11 Temmuz 1991 tarihli (aet) 2568/91 sayılı komisyon tüZÜĞÜ

▼B

EK V

KILCAL SÜTUNLU GAZ KROMATOGRAFI TARAFINDAN STEROLLERİN İÇERİĞİNİN VE TERKİBİNİN BELİRLENMESİ

1. 
   KAPSAM
   

Bu yöntem yağlı maddelerin tek tek ve toplam sterol içeriklerinin belirlenmesi usulünü tanımlar.

2. 
   YÖNTEMİN PRENSİBİ
   

Yağlı madde, iç standart olarak α-kolestanol ilavesi ile birlikte, etonol çözeltisi içindeki potasyum hidroksit ile sabunlaştırılır ve sabunlaştırılamayanlar sonra ►C1 dietil eterle◄ çıkarılırlar.
Sterol fraksiyonu sabunlaştırılamayan özden kromatograf tarafından temel silis jel tabak üzerinde ayrılırlar. Silis jel den kurtarılan steroller trimetil-silil eter’e dönüştürülür ve kılcal sütunlu gaz kromatografı ile analiz edilirler.

3. 
   ARAÇLAR
   

1. 
   250 ml deney şişesi, zemin-cam eklemleri olan kondansatör uydurulmuş deney şişesi.
   
2. 
   500 ml ayırıcı huni.
   
3. 
   250 ml deney şişeleri.
   
4. 
   20x20 cam plakalar kullanarak ince-katman kromatografisi ile yapılacak analizler için alet.
   
5. 
   366 ya da 254 nm dalga boyu olan mor ötesi lamba.
   
6. 
   100 μl ve 500 μl’lik mikro şırınga.
   
7. 
   Yaklaşık iki cm çapında ve 5 cm derinliğinde, vakum altında çalışmaya müsait filtrasyonun da akli olduğu ve 12/21 erkek cam zemin eklemi olan G3 gözenekli diyaframlı silindirik filtreli huni.
   
8. 
   filtre hunisine uyacak 12/21 cam zemin dişi eklemli 50 ml vakum konik deney şişesi (3.7).
   
9. 
   incelen dipli ve contalı kapaklı 10 ml’lik deney tüpü
   
10. 
    Kılcal sütunla kullanılmaya uygun, aşağıdakilerden oluşan bölücü bir sisteme sahip gaz kromatograf
    
    1. 
       ±1⁰C kesinliğinde istenen sıcaklık derecesini sağlayabilen sütunlar için termostatik odacık.
       
    2. 
       Ayarlanabilir dereceli persinalized cam buharlaştırıcı elemanlı buharlaştırma ünitesi.
       
    3. 
       Alev iyonizasyon detektörü ve konventör amplifikatörü.
       
    4. 
       Cevap verme süresi bir dakikadan fazla olmayan ve değişebilir hızlı konventör-amplifikatörle (3.10.3) kullanılmaya uyumlu bir bütünleştirici-kayıt edici.
       
11. 
    Cam ya da eritilmiş silisten 20-30 metre uzunluğunda, iç çapı 0,25-0,32 mm olan ve tamamı SE-52 ya da SE-54 sıvı ya da muadili ile 0,10-0,30 μm kalınlığında kaplanmış kılcal sütün
    
12. 
    Sertleştirilmiş iğneli 10 μl’lik gaz kromatografi mikro şırıngası.
    

4. 
   AYRAÇLAR
   
   1. 
      Potasyum Hidroksit ►C1 yaklaşık 2 mol/L etonolik çözelti◄ 130 gr prosyum hidroksiti eritin.►C1 ( minimum konsantrasyon %85)◄ 200 ml damıtılmış su içinde soğutun ve sonra etanolle bir litreye çıkartın. Çözeltisi ağzı iyi kapatılmış koyu renk cam şişelerde saklayın.
      
   2. 
      ►C1 dietil eter◄analitik saflıkta.
      
   3. 
      Susuz sodyum sülfat, analitik saflıkta.
      
   4. 
      silis jel ile kaplanmış, florasan endikatörü olmayan,0,25 mm kalınlıkta (ticari olarak kullanmaya hazır) cam plakalar.
      

▼B

5. 
   Potasyum hidroksit ►C1 0,2 mol/L◄ etonolik çözelti. 13 gr potasyum hidroksiti 20 ml damıtılmış suyun içinde eritin ve etonolle 1 litre yapın.
   
6. 
   Kromatografi için benzol (5.2.2’ye bakın)
   
7. 
   Kromatografi için aseton. (5.2.2.’ye bakın)
   
8. 
   Kromatografi için hekzan (5.2.2.’ye bakın)
   
9. 
   Kromatografi için ►C1 dietil eter◄(5.2.2.’ye bakın)
   
10. 
    Kloroform, analitik saflıkta. (5.2.2’ye bakın)
    
11. 
    ince-katmanlı kromatografi için belirtilen çözelti: kloroform içinde kolesterol ya da pitosterol ►M6 %2◄çözelti
    
12. 
    2,7-dichlorofluorescein, %0,2 etonolik çözelti. Alkolik potasyum hidroksit çözeltisinden birkaç damla ►C1 2 mol/L◄ ilave ederek hafifçe temel parçayı yapın.
    
13. 
    Kromatografi için susuz piridin.
    
14. 
    Hekzametil disilizan
    
15. 
    Trimetilklorosilan
    
16. 
    Sterol trimetilsilil eterin belirtilen eriyikleri. Yağlardan elde edilen saf sterol ya da sterol karışımlarından kullanılacağı zaman üretilecek.
    
17. 
    ►C1 β- kolestanol◄, kloroform (iç standart) içindeki %0,2 çözelti (m/V)
    
18. 
    Taşıyıcı gaz: hidrojen ya da helyum, gaz-kromatografik saflığında.
    
19. 
    Yardımcı gazlar:
    

- hidrojen, gaz- kromatografik saflıkta,

- hava, gaz-kromatografik saflıkta.

5. 
   USUL
   
   1. 
      Sabunlaştırılamayanların hazırlanması
      

5.1.1 500 μl’lik şırınga kullanarak ►C1 250 ml’lik deney şişesinin içine belirleme için alınan örnek aliquot unun sterol içeriğinin yaklaşık %10’una tekabül eden miktarda kolestanol içeren kloform içindeki %0,2 β-kolestanolu enjekte edin.◄ Örneğin 5 gr örnek için zeytin yağında 500 μl, zeytin ezmesi yağında ise 1500 μl %0,2 α-kolestanol çözeltisini ilave edin ►M6 -------------------◄

►C1 akışında kuruluk olana kadar◄ nitrojeni buharlaştırın ve 5 gr kuru filtre edilmiş örneği aynı deney şişesinin içine koyun.
Kayda değer miktarlarda kolesterol içeren ►M6 Sıvı ◄ ve katı yağlar kolestanola göre belirgin tutma zamanına sahip zirveler gösterebilir. Eğer bu durum görülürse sterol fraksiyonu iç standartla birlikte ve iç standarttan yoksun olarak iki kez analiz edilecektir. ►M6 ya da kolestanol yerine betulinol kullanılmalıdır.◄

2. 
   50 ml ►C1 2 mol/L◄ etonolik potasyum hidroksit çözeltisi ilave edin, kondensatörü takın ve sabunlaşma gerçekleşene kadar (çözelti berrak hale gelir) devamlı enerjik bir şekilde karıştırarak su banyosunda yumuşak bir şekilde kaynaması için ısıtınız. Fazladan 20 dakika daha ısıtmaya devam edin, sonra kondansatörün üstüne 50 ml ►C1 damıtılmış su ◄ ilave edin, kondansatörü sökün ve deney şişesini yaklaşık 30^oC ye soğutun.
   
3. 
   Deney şişesinin içindekileri 500 ml.lik ayırıcı huniye birkaç defa damıtılmış sudan geçirerek, toplam 50 ml civarındaki kütleyi transfer ediniz. Yaklaşık 80 ml ►C1 dietil eter◄ilave edin 30 saniye kadar güçlü bir şekilde çalkalayın ve durulmaya bırakın.
   

Düşük su benzeri safhadan ayırt etmek için ikinci ayırıcı huni kullanın. Her bir seferde 60-70 ml etil eter kullanarak suya benzer safha üzerinde aynı şekilde fazladan iki çıkarma yapın.

Not 1: Herhangi bir emülsiyon küçük miktarlarda etil ve metil alkol püskürtme şeklinde eklenerek yok edilebilir.

2. 
   Eter çıkarımlarını tek bir ayırıcı hunide havuzla ve su nötr reaksiyon verene kadar damıtılmış su ( her seferinde 50 ml) ile yıka.
   

▼B

Yıkama suyu ortadan kaldırıldıktan sonra susuz sodyum sülfatla kurut ve daha önce 250 ml.lik deney şişesine konmuş susuz sodyum sülfat ile ►C1 filtre et◄, huniyi küçük miktarlardaki ►C1 dietil eter◄ ile yıka ve filtrele.

2. 
   Eteri damıtarak birkaç ml.ye indir, sonra bu kurutulmuşu hafif bir vakuma ya da nitrojen rüzgarına bırak, kurutmayı bir ocağın içinde 100⁰C’de yaklaşık çeyrek saat tutarak tamamla, kurutucunun içinde soğuttuktan sonra tart.
   

2. 
   Sterol fraksiyonunun ayrılması
   

5.2.1. Temel plakaların hazırlanması. Silis jel plakaları (4.4) ►C1 0,2 mol/L◄ etonolik potasyum hidroksit çözeltisine(4.5) 10 saniye süreyle tamamen daldırın, sonra buharlı bir dolapta kuruması için iki saat bırakın sonra 100⁰C’deki ►C1 bir fırına◄bir saat süre ile koyun.

Ocaktan indirin ve kullanılmak üzere istenene kadar kalsiyum klorid kurutucusunda saklayın ( bu şekilde hazırlanan plakalar 15 gün içinde kullanılmalıdır).
Not 2: Temel silis jel plakalar sterol fraksiyonunu ayırmak için kullanılacakları zaman sabunlaşmayanları alümine ile kimyasal işleme tabi tutmaya gerek yoktur. Bu yolla asit karakterindeki tüm bileşikler (yağ asitleri ve diğerleri) belirli bir çizgide tutulacak ve sterol bandı aliphatik ve triterpene alkol bandlarından açıkça ayrılacaktır.

2. 
   95:5 (v/v) benzol/aseton ►C1 karışımını◄ yaklaşık 1 cm’lik derinlikte plaka-geliştirme odacığının içine dök. Alternatif olarak 65:35 (v/v) hekzan/etil karışımı da kullanılabilir. Odacığı uygun bir kapak ile kapat ve sıvı-buhar dengesi oluşması için yaklaşık yarım saat kadar beklet. Odacığın iç yüzeyine eluent e batırılmış filtre kağıdı şeritleri konabilir. Bu gelişim zamanını yaklaşık üçte bir oranında azaltır ve bileşenlerin daha tek tip ve düzenli elüsyonunu sağlar.
   

Not 3: Mükemmel tekrar üretilebilen elüsyon koşullarına ulaşabilmek için geliştirilen sıvı her deneyde değiştirilmelidir.

2. 
   Kloform içinde sabunlaşmayanlardan (5.1.5.) yaklaşık %5 lik bir çözelti hazırla ve 100 μl’lik mikro şırınga kullanarak kromatografik plakayı ►C1 300 μl’lik (5.2.1) ◄ çizginin bir ucundan yaklaşık 2 cm mesafede mümkün olduğu kadar ince ve tek tip çizgiler halinde boyayın. Çizgiler halinde boyamayla aynı doğrultuda olarak 2-3 μl sterol çözeltisini(4.11) plakanın bir ucuna dökün, böylece sterol bandı gelişmeden sonra ayırt edilebilir.
   
3. 
   5.2.2 de belirtildiği şekilde hazırlanmış olan gelişim odacığına plakayı koyun. Ortam ısısı 15 ile 20⁰C arasında olmalıdır. Çabuk bir şekilde odacığın üstünü kapatın ve çözeltisin plakanın üst sınırına 1 cm kadar yaklaşana kadar yıkayıp giderilmesine müsaade edin.
   
4. 
   2,7- dikloroflorosken çözeltisini hafifçe ve tek tip olarak plakaya püskürtün. Morötesi ışık altında plaka gözlemlendiğinde sterol band referans çözeltisinden elde edilen leke ile aynı hizada olması ile ayırt edilebilir. Siyah bir kurşun kalemle florasının kenarları yanında bandın sınırlarını işaretle.
   
5. 
   Metal bir spatula kullanarak silis jeli işaretlenmiş alandan kazıyın. İnce ince parçalanmış materyali filtre hunisine(3.7) boşaltın. 10 ml sıcak kloroform ilave edin, metal spatula ile dikkatlice karıştırın ve vakum altında filtreden geçirin, filtre edilmiş materyali filtre hunisine eklenmiş konik deney şişesinde(3.8) toplayın.
   

Ezmeyi ►C1 hunide dietil eterle üç kez◄yıkayın (her seferinde yaklaşık 10 ml) filtreden geçirilmiş sıvıyı huniye eklenmiş aynı deney şişesinden toplayın. Filtreden geçirilmiş sıvıyı 4-5 ml.lik hacme kadar buharlaştırın, çözelti kalıntısını 10 ml.lik deney tüpüne (3.9) transfer edin, kuruyana kadar hafif bir nitrojen akışı ile hafif bir ateşte buharlaştırın, bir kaç damla aseton kullanarak telafi edin ve sonra kuruyana kadar buharlaştırın, yaklaşık 105⁰C’lik bir ocağa koyun, on dakika tutun ve kurutucu içinde soğumaya bırakın ve tartın.
Deney tüpündeki ezme sterol fraksiyonundan oluşur.

3. 
   Trimetilsilil eterlerin hazırlanması.
   

▼B
5.3.1. Piradin/hekzametil disilizan/trimetil klorosilan ın 9:3:1 (v/v/v) oranındaki karışımından oluşan sililasyon ayracını (not 4) sterol fraksiyonu içeren deney tüpündeki her miligram sterol için 50 μl oranında ilave edin. Nem intikalinden kaçının (not 5).
Not 4: Kullanıma hazır çözeltiler ticari olarak mevcuttur. Bis-trimetilsilil, triflor asetamid + %1 trimetil klorosilan gibi aynı miktarda susuz piridinin ile seyreltilmesi gereken diğer silanize ayraçlar da mevcuttur.

2. 
   Deney tüpünün ağzını kapatın, steroller tamamen eriyene kadar (ters çevirmeden) dikkatlice çalkalayın. Ortam ısısında 15 dakika kadar bekletin ve bir kaç dakika santrifüjleyin. Berrak çözelti gaz kromatografik analiz için hazırdır.
   

Not 5: Önemsiz Opal gibi oynak renkler saçma durumu meydana gelebilir, bu durum normaldir ve herhangi bir etkilemeye yol açmaz. Beyaz taneciklerin oluşması ya da pembe rengin görünmesi nemin mevcut olduğu ya da ayracın değerini yitirmesi durumunun mevcut olduğuna işarettir.

5.4 Gaz Kromatografik analizi.

5.4.1. İlk işlemler, sütun paketleme

5.4.1.1. Sütüna gaz kromatografisini monte edin, giriş ucunu dağıtım sistemine bağlı olan buharlaştırıcıya, çıkış ucunu da detektöre bağlayın.

Gaz kromatografı üzerinde genel kontrolleri yapın (gaz şebekesindeki kaçaklar, detektör verimliliği, dağıtım sisteminin ve kayıt sisteminin verimliliği, vs.).

5.4.1.2. Eğer sütun ilk kez kullanılacaksa hazırlanması tavsiye olunur. Sütunun içinden ince bir gaz akıntısı geçirin, sonra gaz kromatografisini açın. Yavaş yavaş işletim derecesinin en az 20⁰C üzerine kadar ısıtın (Not 6). Bu dereceyi en az iki saat için sağlayın. Sonra aygıtı işletim koşullarına göre ayarlayın ( gaz akışını ve dağıtımını, ışık parlaması, elektronik kaydediciye bağlanması, sütun odacığının düzenlenmesi, detektörün düzenlenmesi ve enjektör ısısı vs.) Analizin yapılması için gerekli olan hassasiyetin en ak iki katı ile sinyali kayıt edin. Esas hat herhangi bir uç göstermeksizin lineer olmalı ve sapma olmamalıdır.

Negatif düz çizgi halindeki sapma sütun bağlantılarının doğru olmadığını gösterir; pozitif bir sapma sütunun doğru bir şekilde hazırlanmadığını gösterir.

Not 6: Koşullandırma derecesini durağan safhada kullanılması için belirtilen maksimum derecenin 20⁰C altında tut.
5.4.2. İşletim koşullarının seçimi

5.4.2.1. Rehber işletim koşulları aşağıdaki gibidir:

- Sütün ısısı: 260 ± 5^oC

- Buharlaştırıcı ısısı: 2800C,

- Detektör ısısı : 2900C,

- Taşıyıcı gazın lineer hızı: helyum 20-35 cm/saniye, hidrojen 30-50 cm/saniye,

- Parçalanma oranı: 1:50 ile 1:100 aralığı

- Enstrüman hassasiyeti: minimum zayıflatmadan 4-16 katı,

- Kayıt hassasiyeti: 1-2 mV f.s.,

- Kağıt hızı: 30-60 cm/saat

- Enjekte edilen maddenin miktarı: TMSE çözeltisinin 0,5-1 μl’si
Bu şartlar sütunun ve gaz kromatografının özellikleri ışığında değişiklik gösterebilir. Bunun için aşağıdaki şartlara uyan kromatogramlar elde edin:

- ß-sitosterol için tutulma süresi 20 ± 5 dakika olmalı,

- Kampesterol zirvesi: zeytin yağı için ( ortalama içerik %3) tam ölçünün %15 ± 5’i ; soya yağı için (ortalama içerik %20) tam ölçünün %80 ± 10’u.

-Mevcut bütün steroller ayrılmalıdır.Ayrılmaya ek olarak zirveler de tamamen çözülmelidir. Yani zirve izi bir sonraki zirve için terk etmeden önce mutlaka esas hatta dönmelidir. Bununla birlikte tam olmayan çözülme dikey doğrultu gösteren kullanarak TRR 1,02’deki zirve ölçülebiliyor ise tolere edilebilir.

▼B
5.4.3. Analitik usul.

5.4.3.1. 10 μl’lik mikro şırınga kullanarak 1 μl hekzan alın, içine 0,5 μl hava çekin ve sonra örnek çözeltiden 0,5-1 μl alın. İğneyi boşaltmak için şırınganın pistonunu kaldırın. İğneyi enjeksiyon ünitesinin zarına batırın ve bir, iki saniye sonra hızlıca enjekte edin, sonra iğneyi yavaşça beş saniye kadar sonra çıkarın.

5.4.3.2. Mevcut sterollerin TMSE’si tamamen yıkanıp giderilene kadar kayda devam edin.

Esas hat gerekleri karşılamaya devam etmelidir (5.4.1.2).

5.4.4. Zirve tanımlaması

Tutma süreleri temel alınarak ve sterol TMSE karışımlarının aynı koşullara altında analiz edilerek kıyaslanması yolları ile ferdi zirveleri teşhis etmek.

Steroller aşağıdaki sıraya göre yıkama yoluyla diğerlerinden ayrılırlar: kolesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7- kampesterol, Δ 5,23- stigmastadienol, ►C1 klerosterol◄, ß-sistosterol, sitostanol, Δ 5- avenasterol, Δ 5,24- stigmastadienol ►C1 , Δ 7-stigmasterol,◄ Δ 7-avenasterol.
SE-52 ve SE-54 sütunları için sitosterol tutma süreleri tablo 1 de gösterilmiştir.

Şekil 1 ve 2 bazı yağlar için tipik kromatogramları göstermektedir.

5.4.5. Niceliksel değerlendirme.

5.4.5.1. ►C1 ß-kolestanol◄ ve sterol zirve alanlarını integrator kullanarak hesaplayın. Tablo 1’de listelenenler arasında bulunmayan bileşiklerin zirvelerini ihmal edin. ►C1 ß kolestanol◄ için karşılık katsayısı 1’e eşittir.

5.4.5.2. 100 gr yağlı materyal içindeki her bir sterolün konsantrasyonunu mg cinsinden aşağıdaki formül uyarınca hesaplayın:
sterol x = A_x · M_s · 100

A_s ·m

A_x = sterol x’in zirve alanı►M6 -----------------◄;

A_s = ►C1 ß kolestanol◄ zirvesi alanı►M6 ----------------◄

m_s = miligram cinsinden eklenen ►C1 ß kolestanol◄ ün kütlesi;

m = gram cinsinden belirleme için alınan örneğin kütlesi.

5. 
   Sonuçların ifadesi
   
   1. 
      100 gr yağlı materyal içindeki her bir sterolün konsantrasyonunu mg cinsinden kaydet ve bunların toplamını ‘toplam steroller’ olarak kaydet.
      
   2. 
      Steroller için toplam zirve alanına söz konusu zirve alanının oranından her bir sterolün yüzdesini hesapla.
      

Sterol x’in % = A_x . 100

ΣA
Ax = x’in zirve alanı

ΣA = sterollerin toplam zirve alanı

▼B
EK BÖLÜM
Gazın çizgisel hızının belirlenmesi
Normal işletim koşullarına ayarlanmış bir gaz kromatografı ile 1-3 μl metan (propan) enjekte edin. Gazın sütuna enjekte edildiği andan zirvenin meydana geldiği ana (t_M) kadar geçen süreyi ölçün.
Cm/saniye cinsinden lineer hız L/t_M formülü ile elde edilir. Burada L sütunun cm cinsinden uzunluğu, t_M ise saniye cinsinden ölçülmüş zamandır.
Tablo I

Steroller için göreli tutma süreleri

Zirve	Tanımlama		Göreceli tutma süresi
			SE54 kolon	SE 52 kolon
1	kolesterol	A-5-kolesten-3 (3-ol	0,67	0,63
2	kolestanol	5a-kolestan-3 (3-ol	0,68	0,64
3	brassicasterol	[24S]-24-metil-A-5,22-kolestadien-3(3-ol	0,73	0,71
4	24-metilene-kolesterol	24-metilene-A-5 ,24-kolesten-3 (3-ol	0,82	0,80
5	campesterol	[24R]-24-metil-A-5-kolesten-3(3-ol	0,83	0,81
6	campestanol	[24R]-24-metil-kolestan-3 (3-ol	0,85	0,82
7	stigmasterol	[24R]-24-etil-A-5 ,22-kolestadien-3 (3-ol	0,88	0,87
8	A-7-campesterol	[24R]-24-metil-A-7-kolesten-3(3-ol	0,93	0,92
9	A-5,23-stigmastadienol	[24R,S]-24-etil-A-5,23-kolestadien-3(3-ol	0,95	0,95
10	klerosterol	[24S]-24-etil-A-5,25-kolastadien-3(3-ol	0,96	0,96
11	(3-sitosterol	[24R]-24-etil-A-5-kolestan-3(3-ol	1,00	1,00
12	sitostanol	24-etil-kolestan-3 (3-ol	1,02	1,02
13	A-5-avenasterol	[24Z]-24-etilidene-5-kolesten-3(3-ol	1,03	1,03
14	A-5 ,24-stigmastadienol	[24R,S]-24-etil-A-5,24-kolestadien-3(3-ol	1,08	1,08
15	A-7-stigmastenol	[24R,S]-24-Etil-A-7,24-kolestadien-3(3-ol	1,12	1,12
16	A-7-avenasterol	[24Z]-24-etiliden-A-7-kolesten-3(3-ol	1,16	1,16

▼B