18 Décembre 2014 Communications orales Laetitia Attaiech Equipe «Génétique de la compétence chez les bactéries pathogènes»
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- Role of the apicoplast in the membrane biogenesis of Apicomplexa parasites: make, assemble and give.
- Claire Durmort
- Sylvie ELSEN*
- Guillaume Golovkine
- Anne KERIEL
- Cecile Morlot*
- Pierre Wallet
- Julie BONNET
- Christine Felix
- Céline LAVIRE*
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16ème Rencontre G-RREMI Groupe Régional de Recherche en Microbiologie des Interactions 18 Décembre 2014 Communications orales Laetitia Attaiech Equipe « Génétique de la compétence chez les bactéries pathogènes » CNRS UMR5240, Univ. Lyon 1, LYON L’augmentation du ratio ori/ter est la cause de l’induction de la compétence par les antibiotiques ciblant la réplication. Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) tue près d’un million d'enfants chaque année et l'émergence de souches multi-résistantes aux antibiotiques constitue une grave menace pour la santé humaine. S. pneumoniae est une bactérie naturellement transformable, c’est-à-dire qu’elle peut internaliser de l'ADN exogène et l’intégrer dans son chromosome par recombinaison homologue. Pour ce faire, elle développe un état physiologique particulier, génétiquement régulé, appelé « compétence ». De façon frappante, il a été montré qu’un certain nombre d’antibiotiques induisent, par un/des mécanisme(s) inconnu(s), cet état physiologique. Ainsi, la compétence pour la transformation génétique permet la propagation rapide des gènes de résistance aux antibiotiques au sein des populations bactériennes, et ce phénomène peut être induit par certains antibiotiques eux-mêmes. Nous avons pu démontrer que les antibiotiques ciblant la réplication de l'ADN induisent une augmentation du nombre de copies des gènes situés près de l'origine de réplication (oriC). Les gènes responsables de l’initiation de la compétence sont situés près de oriC et sont directement affectés par ce phénomène. Nous montrons que ce déséquilibre explique l’induction de la compétence par ces mêmes molécules. De plus, des analyses transcriptomiques globales montrent que ces antibiotiques induisent une sur-expression des gènes proches de l’origine dans d’autres espèces bactériennes. Ceci est une conséquence directe et intrinsèque du ralentissement/arrêt de la réplication. Nos données suggèrent que l'évolution a conservé l'emplacement proche de l’origine des gènes importants chez les bactéries afin de permettre une réponse robuste aux stress réplicatifs sans avoir à maintenir de systèmes de détection ou de régulation complexes. Ces résultats ont été publiés dans le journal Cell (Jelle Slager, Morten Kjos, Laetitia Attaiech, Jan-Willem Veening ; Antibiotic-induced replication stress triggers bacterial competence by increasing gene dosage near the origin ; Cell. 2014 Apr 10;157(2):395-406. PMID: 24725406). Cyrille BOTTÉ ApicoLipid Team - Laboratoire Adaptation et Pathogenie des Microorganismes, La Tronche Role of the apicoplast in the membrane biogenesis of Apicomplexa parasites: make, assemble and give. Apicomplexa is a phylum of obligate intracellular parasites, including pathogens of medical and veterinary importance that represent a massive social and economic burden, and against, which there is no current vaccine. Two genera, Plasmodium and Toxoplasma, which are responsible for malaria and toxoplasmosis in humans, have been the focus of most studies in this parasite group. Most of these parasite harbours a relict plastid, known as the apicoplast. Resulting from the secondary endosymbiosis of red algae, this organelle is essential to parasite survival, and whilst non photosynthetic, it shares a number of important biochemical pathways with the chloroplasts of plants and algae. The apicoplast is believed to play in central part in parasite lipid synthesis and thus parasite biogenesis through the generation of unique lipid precursors for membrane biogenesis. Major questions remain unanswered: What lipids are synthesized by the apicoplast biosynthetic machineries? Are these lipids needed for the apicoplast biogenesis or are they exported to other membrane compartments? If exported, what is their fate and how are they trafficked? Our group is involved in addressing some of these important questions, which will help understand its raison d'etre and identify new potential drug targets against these major human pathogens. Alexandre Duprey* Microbiologie, adaptation et pathogénie UMR5240 CNRS/INSA/ Université Lyon 1 Evolution et spécialisation des régions régulatrices des gènes pel codant les pectate lyases majeures chez les bactéries phytopathogènes du genre Dickeya. La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise un arsenal d'enzymes, les principales étant les pectate lyases (Pels), pour dégrader les parois végétales et ainsi causer la maladie de la pourriture molle chez une large variété de plantes. Les Pels sont produites en fin de phase exponentielle de croissance et sont soumises à une régulation complexe. Chez D. dadantii, on constate des duplications et réarrangements récents d'un groupe de Pels essentiel au pouvoir pathogène de cette bactérie. Deux membres de ce groupe, PelD et PelE, ont évolué vers des fonctions opposées : PelE, dont la production dépend fortement des conditions environnementales, sert d'initiateur de la dégradation des composés pectiques alors que PelD, produit plus tardivement, est essentiellement induit par les produits de dégradation de la pectine. Les bases moléculaires de cette spécialisation restaient cependant jusqu'alors inconnues. L'étude comparée des régions régulatrices de pelD et pelE a mis en évidence un ensemble de mécanismes régulateurs communs, complétés par d'autres mécanismes spécifiques à chaque gène. Sur les deux régions régulatrices, au niveau du site de fixation de l'ARN polymérase, on trouve un site de fixation pour la protéine CRP, servant d'activateur principal de l’expression des gènes pel, et deux sites de fixation pour la protéine associée au nucléoide Fis. Cette dernière réprime l’expression des gènes pel via des compétitions à la fois avec CRP et l'ARN polymérase. En revanche, la région régulatrice de pelD est la seule à comporter un second promoteur divergent en amont du promoteur principal. Le promoteur divergent réprime celui de pelD durant la phase exponentielle de croissance ou durant les phases précoces de l’infection et contribue ainsi au retard de l'expression de pelD par rapport à celle de pelE. Chez d'autres bactéries du genre Dickeya, les structures et l'organisation de ces promoteurs sont remarquablement bien conservés lorsque pelD et pelE sont présents, mais peu conservés lorsque l'un des deux gènes a été perdu. Ces constats suggèrent une adaptation de la régulation de la synthèse de ce groupe de Pel en fonction du contexte génique de la bactérie. L’analyse fine des séquences régulatrices de ces deux gènes permet ainsi de mieux comprendre les phénomènes évolutifs qui ont permis aux différentes bactéries du genre Dickeya de rationaliser l’utilisation des nouveaux facteurs de virulence issus de la duplication. *Auteurs : Alexandre Duprey1, Sylvie Reverchon1, William Nasser1 1Microbiologie, adaptation et pathogénie UMR5240 CNRS/INSA/ Université Lyon 1 f‐69621 villeurbanne Claire Durmort Pneumococcus Group, Institut de Biologie Structurale CNRS(UMR5075)/CEA/UJF, Grenoble Une nouvelle source d’énergie pour un ABC transporteur impliqué dans la résistance multi-drogue chez Streptococcus pneumoniae. La super-famille des ABC transporteurs (ATP binding cassette) est une famille de complexes membranaires dédiés à l’import et l’export d’une grande variété de composants dans les cellules. Le transport, réalisé par deux domaines transmembranaires (les perméases), est énergisé par hydrolyse de l’ATP intracellulaire grâce à l’activité ATPase du domaine NBD (nucleotide binding domain). Chez Streptococcus pneumoniae, plus de 60 ABC transporteurs ont été répertoriés dont une vingtaine sont des transporteurs impliqués dans l’export des xénobiotiques : peptides antimicrobiens, antibiotiques, drogues. PatA PatB fait partie de ces systèmes d’export conférant au pneumocoque une résistance multi-drogues ce qui pose des problèmes de résistance des souches pathogènes aux traitements antibiotiques chez les patients. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous avons réalisé une étude fonctionnelle et structurale de ce transporteur. PatA/PatB joue un rôle dans l’export des antibiotiques de la famille des fluoroquinolones et des oxazolidinones (linezolide). La suppression simple ou simultanée des gènes des deux protéines au sein du pneumocoque lui confère une sensibilité accrue à la ciprofloxacine et à la norfloxacine ; deux antibiotiques de la famille des floroquinolones. Seul l’hétérodimère PatA/PatB a une activité d’hydrolyse de l’ATP et de transport de drogues in vitro; les homodimères PatA ou PatB étant inactifs. De surcroît, nous venons de découvrir que PatA/PatB hydrolyse préférentiellement le GTP et que l’activité de transport des drogues s’en trouve augmentée d’un facteur 6 à 8, cela de fonction de la température. Nous avons vérifié que les concentrations d’ATP et de GTP intracellulaire chez le pneumocoque sont du même ordre de grandeur (mM), cela prouve que l’activité d’hydrolyse du GTP n’est pas un artéfact de laboratoire mais possède une relevance physiologique. Ainsi, nous avons montré pour la première fois qu’un ABC transporteur est une GTPase ce qui ouvre de nouveaux concepts de fonctionnement pour cette super-famille de protéine. Sylvie ELSEN* Pathogénie bactérienne et réponses cellulaires, IRTSV / CEA Grenoble Un nouveau mécanisme de virulence de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires aiguës ou chronique graves. Le pouvoir pathogène de cette bactérie Gram-négative est largement attribué à son système de sécrétion de type III (SST3), véritable aiguille qui injecte des toxines directement dans les cellules de l’hôte. Notre équipe vient d’identifier un nouveau mécanisme de virulence chez une souche appelée CLJ1, isolée au CHU de Grenoble d’un patient décédé d’une pneumonie hémorragique qui a aggravé une insuffisance respiratoire chronique. Alors qu’elle ne possède pas les toxines les plus connues, ni l’aiguille du SST3, cette souche est hyper-virulente chez un modèle souris de pneumonie aiguë. Deux clones de CLJ, CLJ2 et CLJ3, isolés 12 jours après CLJ1 du même patient soumis à une antibiothérapie, ont perdu leur virulence et ont acquis une haute résistance aux antibiotiques. L’analyse protéomique des sécrétomes de CLJ1 et CLJ3 par l’équipe Étude de la Dynamique des Protéomes (EDyP, LBGE CEA-Grenoble) a permis d’identifier une nouvelle cytolysine appelée Exolysine A (ExlA), sécrétée essentiellement par CLJ1. Cette toxine est responsable de la mort des cellules infectées en provoquant la désorganisation du squelette d’actine, la perméabilisation de la membrane externe et la rétraction cellulaire. ExlA est sécrétée grâce à la protéine ExlB localisée dans la membrane externe de la bactérie. Les deux protéines ExlA et ExlB, codées par l’opéron exlBA, forment donc un nouveau « two-Partner Secretion (TPS) system » ou SST5. Des souches de P. aeruginosa associées à des pathologies variées et collectées dans divers hôpitaux aux Etats-Unis et en Europe possèdent les gènes exlBA et sont capables de sécréter la toxine ExlA. Il est donc essentiel de comprendre le rôle et la régulation de ce nouveau mécanisme de virulence, ainsi que de le prendre en compte pour le développement de nouveaux anti-microbiens visant P. aeruginosa. *Auteurs : Elsen S, Huber P, Bouillot S, Couté Y, Fournier P, Dubois Y, Timsit JF, Maurin M, Attrée I. 2014. A type III secretion negative clinical strain of Pseudomonas aeruginosa employs a two-partner secreted exolysin to induce hemorrhagic pneumonia. Cell Host Microbe. 15(2):164-76. Guillaume Golovkine Biology of Cancer and Infection" Team: "Bacterial Pathogenesis and Cellular Responses" UMR1036 INSERM-CEA-UJF / CNRS ERL5261, iRTSV/CEA-Grenoble Real-time imaging of Pseudomonas aeruginosa transmigration across the tissue barriers. Pseudomonas aeruginosa is a major human opportunistic pathogen and one of the most important causal agents of nosocomial infections. A critical step of P. aeruginosa acute infection is the crossing of the epithelial and endothelial barriers. Here, we investigated the mechanisms involved in these two processes using biochemical and videomicroscopic approaches. For the endothelial barrier, the first step is the cleavage of VE-cadherin, an adhesive intercellular junction protein, by the secreted protease LasB. This is followed by toxin injection at the basolateral side of the cell, using P. aeruginosa's type III secretion system (Golovkine et al., Plos Pathog 2014). Toxin injection induces actin cytoskeleton collapse and massive cell retraction, provoking endothelial barrier breakdown (Huber et al. Cell Mol Life Sci 2013). The mechanisms of epithelial barrier crossing remain elusive. Indeed, the apical membrane of epithelial cells is resistant to Type 3 toxin injection, and E-cadherin is not cleaved by LasB. To describe the bacterial transmigration in this tissue and to identify the virulence factors involved in the phenomenon, we established an in vitro model of visualization of epithelial cell infection in real-time by confocal and TIRF microscopy. We showed that bacteria transmigrate through intercellular junctions, specifically at cell dividing points, and propagate radially from these points below the cell monolayer. This invasion requires the coordinated action of several bacterial virulence factors: Type 3 secretion system, Type 4 pili and flagellum. Altogether, our data indicate that the epithelium constitute a good rampart against P. aeruginosa, while the vascular endothelium is more permissive. *Auteurs: Golovkine G, Bouillot S, Faudry E, Elsen S, Attrée I and Huber P. UMR 1036 Equipe Pathogénie Bactérienne et Réponses Cellulaires. CEA-Grenoble. Anne KERIEL Inserm U1047 - Virulence Bactérienne et Maladies Infectieuses, UFR de MEDECINE - Site de NIMES Brucella intracellular life relies on the host protein CD98. Brucella are intracellular bacterial pathogens that use a type IV secretion system (T4SS) to escape host defences and create a niche in which they can survive and multiply. Although the importance of T4SS in establishing the replication niche is clear, little is known about its interaction with host cell structures. In this study, we identified the eukaryotic protein CD98hc (also named 4F2hc, SLC3A2 or FRP-1) as a partner for Brucella T4SS subunit VirB2. This transmembrane glycoprotein is involved in amino-acid transport, modulation of integrin signalling and cell-to-cell fusion. Knocking-down CD98hc expression demonstrated that it is essential for Brucella (but not for Salmonella) replication in both HeLa and murine dermal fibroblasts. CD98hc transiently accumulates around the bacteria during the early phases of infection and is required for both optimal bacterial uptake and intracellular multiplication of Brucella. The results presented in this manuscript provide new insights into the complex interplay between Brucella infection and host pathways. Cecile Morlot* Pneumococcus Group Institut de Biologie Structurale CNRS(UMR5075)/CEA/UJF, Grenoble The PALM nanostructure of FtsZ along the cell cycle of a pathogenic coccus Ovoid cocci form a morphological group that includes several human pathogens (enterococci and streptococci). Their shape results from two modes of cell wall insertion, one allowing division, and another one allowing limited elongation. Both cell wall synthesis modes rely on a single cytoskeletal protein, FtsZ, since MreB is absent in ovococcal bacteria. Despite the central role of FtsZ in these bacteria, very little is known regarding the assembly and architecture of their Z-ring. In particular, while the comprehension of the in vivo structure of FtsZ from rod-shaped bacteria has recently beneficiated from superresolution imaging techniques, such data have never been reported for ovococci, and more generally for cocci. We have developed the use of PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) in the ovococcus human pathogen Streptococcus pneumoniae, by engineering a photoactivatable fluorescent protein which provides better fluorescent properties in the pneumococcus. This new tool was fused to the endogenous copy of the ftsZ gene and optimization of the PALM data acquisition process allowed us to determine the first nanostructure of the Z-ring along the cell cycle of an ovococcus. The pneumococcal Z-ring displays clustered patterns that could be classified into four main classes and characterized in terms of cluster content and Z-ring dimensions. Our data show a direct relationship between the axial thickness of the Z-ring and the advancement of the cell cycle. In addition, we observe in pre-divisional cells double-ring sub-structures that cannot be detected using conventional microscopy. Based on these new super-resolution data, we propose a model for the constriction mechanism of the Z-ring in ovococci.
Francisella novicida est une bactérie intracellulaire facultative capable de survivre et de se répliquer à l'intérieur des macrophages. Après phagocytose, la bactérie s'échappe rapidement du phagosome et se retrouve dans le cytoplasme où elle se réplique activement. La détection de Francisella dans le cytosol de la cellule hôte induit l'expression d'environ 500 gènes induits par l'interféron (IFN) de type 1. L'interféron contribue à l'activation de l'inflammasome AIM2. L'inflammasome est une voie de l'immunité innée qui entraîne la pyroptose du macrophage, éliminant ainsi la niche réplicative de Francisella. AIM2 est activé suite à sa fixation sur l'ADN bactérien détecté dans le cytosol de la cellule hôte. L'activation d'AIM2 requiert donc la lyse de la bactérie mais on ne sait pas si cette lyse est accidentelle ou un mécanisme actif de la cellule hôte. La nature des gènes inductibles par l'IFN contribuant à l'activation de AIM2 et potentiellement à la lyse bactérienne est inconnue. Par un crible siRNA d'environ 500 gènes induits par l'interféron, nous avons identifié GBP2 et GBP5 comme des activateurs clés de l'inflammasome AIM2 durant l'infection par Francisella. Leur rôle a été validé à la fois in vitro et in vivo. Mécaniquement, les GBPs ciblent Francisella dans le cytoplasme et entrainent la bactériolyse. Communications par affiche Julie BONNET Division of Streptococcus Pneumoniae, Institute de Biologie Structurale (IBS) - CEA/CNRS/UJF In vivo functional analysis of LytA, the major autolysin of Streptococcus pneumonia. Streptococcus pneumoniae is a Gram-positive commensal bacterium, which colonizes the nasopharyngeal cavities of humans. But it is also an opportunistic pathogen responsible for invasive (meningitis, bacteremia) and non-invasive (pneumonia, acute otitis media, sinusitis) diseases in young children, elderly and immunocompromised people, leading to the death of 1.6 million people per year according to the World Health Organization. First described in the early 1900s, pneumococcal autolysis is a process induced during the stationary growth phase. Cell lysis results from cell wall degradation triggered by LytA, which cleaves the lactyl-amide bond linking the stem peptides and the glycan strands of the peptidoglycan. LytA is composed by two domains: a N-terminal N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase domain and a C-terminal choline binding domain which allows attachment to the phosphocholine (PCho) residues decorating the cell wall lipoteichoic acids. Although pneumococcal lytA mutant strain is less virulent in murine infection models than the parental strain, the role of LytA in the pneumococcal virulence is not well defined. Cell lysis mediated by LytA would allow the release of virulence factors including the pneumolysin toxin and cell wall components interfering with the host immune response. The enzymatic property of LytA is well characterized and its crystallographic structure is solved but important points regarding the in vivo mechanism of action and regulation of LytA are still unknown. How the lytic activity is regulated throughout the growth phase, how LytA is targeted to the cell wall despite the absence of signal peptide, what cell wall site (septal vs equatorial) is targeted by LytA are important points to focus on in order to decipher the function of the autolysin LytA. To address these questions, we have analyzed the spatio-temporal localization of LytA and different mutants, along the bacterial growth phase, using a GFP-fusion chimera.
The Brucellasuis protein BR1024, is an ortholog of the previously identified B. abortus protein BPE043, which was shown to be translocated into mouse macrophage J774.A1 cells in a VirB-dependent manner, suggesting a role for this protein in host cells during infection. BR1024 is annotated as a “kinesin-like” protein in the B. suis genome, but its function remains unknown. BR1024 is a conserved hypothetical protein of 1557 amino acids, with two predicted transmembrane domains in its N-terminal regionand four apolipoprotein domains in the C-terminal region. The C-terminal of protein also shows homology with eukaryotic myosin and kinesin. By qRT-PCR we found that the gene was co-expressed with the virB operon under acidic conditions, in agreement with a role for this protein in host cells. We were unable, however, after many attempts toobtain an unmarked deletion of the gene encoding BR1024, suggesting this protein has an essential role in the bacteria, or possibly that other essential regulatory elements, such as sRNAs, may be located in the gene sequence. A GFP-BR1024 fusion protein ectopically expressed in HeLa cells was seen to co-localise with mitochondria. In a yeast two hybrid screen we identified the CSN6 subunit of the COP9 signalosome as a putativeinteracting host protein. We will discuss the possible roles for this protein during Brucella infection. Auteurs: Christine Felix1,2, Angeline Reboul1,2, Nabil Hanna1,2, David O’Callaghan1,2, Annette Vergunst1,2 (Christine.felix@univ-montp1.fr) 1INSERM, U1047, UFR Médecine, 186 Chemin du carreau de Lanes, 30908 Nîmes, Cedex 02, France 2Université Montpellier 1, EA4204, UFR Médecine, 186, Chemin du Carreau de Lanes, 30908 Nimes Cedex 2, France Céline LAVIRE* UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne, Univ. Lyon 1, Villeurbanne Expression des gènes de dégradation de l’acide férulique chez Agrobacterium fabrum C58 en présence de composés phénoliques et au contact des racines de Medicago truncatula. La disponibilité des génomes bactériens permet de plus en plus aisément des approches qualifiées d'écologie inverse consistant à caractériser sans à priori l'écologie d'un microorganisme à partir de l'étude de son génome. Nous avons ainsi mis en place une telle approche sur l’espèce Agrobacterium fabrum, dont certains membres sont connus pour induire la Galle du Collet sur de nombreuses plantes. Lassalle et al. (2011)1 ont ainsi émis l’hypothèse que les gènes spécifiques à cette espèce conféraient à A. fabrum un avantage sélectif dans la rhizosphère de plantes, notamment de Medicago truncatula. La rhizosphère contient un grand nombre de composés carbonés qui peuvent être de nature et d’origine différentes, et dont la composition varie en fonction des plantes et au cours de leur développement. La plupart de ces molécules sont des acides aminés, des sucres, des acides organiques et des acides phénoliques. Ces derniers sont des constituants de la paroi végétale et sont libérés dans les zones de blessures de la plante. Ils peuvent avoir des effets néfastes ou bénéfiques sur les bactéries et aussi servir de ressources trophiques aux bactéries rhizosphériques. Une des régions identifiée comme spécifique de l’espèce A. fabrum est impliqué dans la dégradation d’un composé phénolique, l'acide férulique2 (Campillo et al. 2014). Par des outils de génétique fonctionnelle nous avons pu mettre en évidence non seulement que cette région était induite par de nombreux composés phénoliques, mais aussi qu’A. fabrum était capable de les utiliser comme source de carbone. En outre, cette région est induite et finement régulée au contact des racines de Medicago truncatula. Notre étude suggère qu’A. fabrum pourrait utiliser de nombreux composés phénoliques comme source de carbone dans son environnement. Cette propriété lui fournirait un avantage sélectif pour les ressources carbonées dans cette zone de forte compétition qu’est la rhizosphère. Mots clefs : Agrobacterium fabrum, acide férulique, rhizosphère, Medicago truncatula. Référence bibliographique : 1. Lassalle, F. et al. Genomic Species Are Ecological Species as Revealed by Comparative Genomics in Agrobacterium tumefaciens. Genome Biol. Evol. 3, 762–781 (2011). 2. Campillo, T. et al. Analysis of hydroxycinnamic acid degradation in Agrobacterium fabrum reveals a coenzyme A-dependent, betaoxidative deacetylation pathway. Appl. and Env. Microbio, 80, 3341-3349 (2014).
Laboratoire d'Écologie Microbienne, UMR CNRS 5557, USC INRA 1193 Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1 43, Boulevard du 11 Novembre 1918, 69622 VILLEURBANNE CEDEX Yüklə 62,43 Kb. Dostları ilə paylaş:
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