2. Specii de drojdii utilizate în procesele biotehnologice
Yüklə 216,1 Kb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- 2.7.3.5. Condiţii de cultivare
- 2.7.3.6. Sistem fermentativ pentru studii fiziologice şi biochimice
- Figura 4
- 2.7.4. Expresia heteroloagă a genelor P 450 din Candida maltosa în Saccharomyces cerevisiae
- 2.7.5. Purificarea proteinelor din Candida maltosa
- 2.7.5.1. Purificarea citocromului P 450 din Candida maltosa dezvoltată pe n – alcani
- 2.7.6. Aplicaţii biotehnologice ale drojdiei Candida maltosa
- 2.8. Trichosporon cutaneum Behrend
- Figura 5
|
Soluţia de microelemente conţine în 1000 ml apă bidistilată următoarele substanţe: FeSO4×7H2O 10 g, ZnSO4×7H2O 80 g, MnSO4×4H2O 64 g, CuSO4×5H2O 8 g, 10 ml HCl concentrat. Vitamine: biotina (10 g/l sau până la 1 mg/l) este necesară pentru dezvoltarea tulpinii Candida maltosa, în special pe n – alcani cu lanţuri scurte. Extractul de drojdie în concentraţie de 0,1% este de asemenea utilizat ca sursă complexă de vitamine şi aminoacizi.
2.7.3.6. Sistem fermentativ pentru studii fiziologice şi biochimice Metoda de extruziune protonică aplicată la Candida maltosa şi la alte culturi dezvoltate pe azot, fără surse de carbon în mediu conţinând săruri de amoniu ca singură sursă de azot, arată că aceasta poate fi exactă şi de încredere pentru un parametru on – line, pentru descrierea producţiei de biomasă, consumului de azot (cu o rată de schimb NH4+/H+, de exact 1) şi a cantităţii surselor de carbon în procesele de fermentaţie. Această extruziune protonică a drojdiilor dezvoltate în cultură batch, care conduce la acidifierea mediului, necesită măsurarea consumului de alcooli pentru menţinerea valorii constante a pH, a fost utilizată pentru dezvoltarea unui sistem fermentativ pentru descrierea dezvoltării drojdiilor şi a selecţiei dezvoltare – consum de substrat (diferite surse de carbon şi surse de NH4 şi N) în cultură batch sau fed – batch şi determinarea mai exactă a valorilor acestora (substanţă uscată, densitate optică, conţinut proteic). Acest sistem fermentativ miniaturizat (volum de lucru de 90 ml) a fost aplicat pentru studierea variatelor fenomene de reglare fiziologică în drojdii ce caracterizează reglarea ratei de dezvoltare şi a citocromului P450, precum şi a altor enzime conţinute în Candida maltosa şi în alte drojdii (Yarrowia lipolytica, Debaryomyces formicorius, Saccharomyces cerevisiae) prin concentraţia oxigenului în mediu şi pentru testarea potenţialului de utilizare a diferitelor substraturi, ca surse de carbon pentru dezvoltarea drojdiilor [36, 37, 38]. Extruziunea protonică poate fi indicată ca o metodă simplă şi de mare acurateţe în legătură directă cu un parametru din sistemul fermentativ (Figura 4). 
Figura 4. Reprezentarea schematică a sistemului fermentativ utilizat în experimente cu Candida maltosa şi alte drojdii pentru testarea reglării, inhibiţiei şi utilizării substratului. E – electrod de pH, pO2 – electrod de oxigen, S – substrat. Volumul de lucru mic (50 – 100 ml) permite descrierea dezvoltării din cantităţi de substrat de 5 – 50 mg, în procese de fermentaţie fed – batch. Aplicaţia într-o fază de hidrocarburi practic inertă (pristan 1 – 2%), a fost utilizată pentru testarea dezvoltării drojdiilor pe substraturi (alcani cu lanţ scurt, l – alcooli, aldehide, acizi graşi) ce manifestă potenţial toxic sau efecte inhibitorii în cultura de drojdii sau pentru dezvoltarea pe substraturi de hidrocarburi solide (alcani cu lanţ lung, alcooli graşi, acizi graşi) în faza pristan. Biomasa de drojdie este produsă în flacoane agitate sau în fermentator, înainte de utilizarea substraturilor de n – alcani, glicerol sau glucoză. Ea poate fi utilizată direct din precultură, după diluţia cu mediu proaspăt, fără extract de drojdie sau după separarea preculturii prin centrifugare. Aproximativ 1 – 3 g de biomasă este utilizată pentru experimente cu limite scăzute de substrat, pe când în experimentele de cultivare pe termen lung, biomasa iniţială este mică [36]. Condiţiile de fermentaţie sunt:
2.7.4. Expresia heteroloagă a genelor P450 din Candida maltosa în Saccharomyces cerevisiae Testarea funcţiei individuale de inducere alcanică a formelor P450 în Candida maltosa şi expresia ei heteroloagă în Saccharomyces cerevisiae sub controlul promotorului GAL10, utilizând vectorul YEp51, sau în Candida maltosa, sub controlul promotorului heterolog a lui SAL10, a fost performantă [39, 40]. Pentru expresia autentică a formelor P450 în Saccharomyces cerevisiae a fost utilizată metoda PCR recombinat pentru schimbarea codonilor CTG din gene sau sADNc a citocromului P450s, de către tripleta TCT [40]. Tulpina transformantă de Saccharomyces cerevisiae (leu2his3) a fost cultivată în mediu minimal pentru drojdii (0,67% YNB, fără aminoacizi, 50 mg/l L – histidină şi 2% rafinoză ca sursă de carbon, la o densitate celulară de 0,7 – 1×108 celule/ml). Inducţia citocromului P450 a fost realizată prin adaosul a 2% galactoză în mediu de cultură. Expresia cantitativă a P450 a fost determinată prin spectrele de diferenţiere CO în celule întregi sau în extracte celulare. Expresia citocromului P450 este maximă după 8 – 15 ore de cultivare în prezenţa galactozei. 2.7.5. Purificarea proteinelor din Candida maltosa Un număr de proteine din Candida maltosa au fost bine purificate şi caracterizate. Printre acestea cel mai mare interes l-a cunoscut sistemul de enzime P450 şi FAOD implicat în oxidarea n – alcanilor.Purificarea simultană la scară largă a P450s, reductaza NADPH – P450, citocromului b şi FAOD, din Candida maltosa dezvoltată pe decan, s-a realizat printr-un complex de metode ca ultrafiltrare, partiţie de fază şi cromatografie. De asemenea au fost purificaţi P450Cm1 (P45052A3), P450Cm2 (P45052A4) şi NADH – 450 reductaza din Candida maltosa după expresia heteroloagă de înalt nivel a genelor lor în Saccharomyces cerevisiae [41, 42]. 2.7.5.1. Purificarea citocromului P450 din Candida maltosa dezvoltată pe n – alcani Izolarea citocromului P450 s-a efectuat mai ales din celule cultivate sub o puternică limitare de oxigen, astfel creşterea puternică a conţinutului în alcani, induce P450 în biomasă de către factorul 4 – 6. Date recente arată că numai P450Cm1(P45052A3) şi Cm3 (P45052A5) au fost bine purificaţi din diferite tulpini de Candida maltosa. P450Cm1 a fost prima dată izolat şi caracterizat din Candida maltosa EH15 dezvoltată pe un amestec de n – alcani (C11 – C19) sub limitare de oxigen. Rezultate similare s-au obţinut la purificarea P450AlK1 (P45052A3) dintr-o tulpină dezvoltată pe tetradecan. Din Candida maltosa VSB779 dezvoltată pe decan sub limitare puternică de oxigen s-au izolat ambii citocromi P450Cm1 şi P450Cm3 printr-o metodă modificată bazată pe cromatografie pe octil – sefaroză [43]. 2.7.6. Aplicaţii biotehnologice ale drojdiei Candida maltosa
sau alte substraturi (P450s, NADPH – P450 reductază, citocrom b, FAOD, SOD, catalază) sau expresia heteroloagă a acestor gene în Saccharomzces cerevisiae şi aplicarea acestor enzime în reacţii de biotransformare [46]. Inducerea FAOD de către alcani în Candida maltosa poate fi aplicată la oxidarea stereoselectivă a alcoolilor secundari pentru a se ajunge la alcanoli secundari enantiomeric puri al căror potenţial este interesant pentru fracţionarea membranelor sau pentru purificarea enzimelor obţinute din celule dezvoltate pe alcani. Recent, s-a descris un sistem eficient de biotransformare a acidului lauric în acid dodecanoic cu celule recombinante intacte de Saccharomyces cerevisiae care conţin o coexpresie a genelor NADPH – P450 reductazei şi CYP52A4 P450 din Candida maltosa [40]. A fost investigată şi producţia enzimatică de indolepiruvat, şi analogilor indolepiruvatului din triptofan şi derivaţi metil şi fluoro ai triptofanului utilizând triptofan aminotransferaza din Candida maltosa. Utilizarea tulpinii Candida maltosa ca gazdă potenţială pentru producţia de proteine heterologe; Producţia de acid muconic din catecol printr-un bioproces bazat pe dezvoltarea drojdiei Candida maltosa pe catecol; Producţia enantioselectivă a D – aminoacizilor din substraturi racemice de DL – aminoacizi (de exemplu alanina); Producţia a 3 şi 2 – isopropilmalat cu mutanţi leu2 şi leu1 de Candida maltosa; Producţia a - aminoadipot 5 – semialdehidă (AASA) cu mutanţi lis1 şi lis9 de Candida maltosa; Izolarea mananului din Candida maltosa şi introducerea derivaţilor lui sulfonaţi în spaţiul intercelular la tutun şi castravete pentru mărirea nivelurilor de rezistenţă la bolile virale (virusul mozaicului tutunului) şi infecţiile bacteriene (tulpina patogenă Pseudomonas syringae var. lachrimans). 2.8. Trichosporon cutaneum Behrend Trichosporon cutaneum a fost stabilită ca specie tip a genului. Celulele crescute pe mediu cu glucoză, extract de drojdie şi peptonă diferenţiază miceliu adevărat şi astrospori, a căror lăţime şi lungime este extrem de variabilă. Celulele sunt globulare, ovale, elipsoidale sau pot prezenta şi alte forme bizare. Mărimea lor este de 3,5 – 7×3,5×14 m. Înmugurirea poate fi abundentă sau absentă şi poate avea loc pe o bază îngustă sau largă şi este stimulată de agitarea culturii. După menţinerea timp de 3 zile la 250C, se formează o peliculă de culoare crem sau albă, catifelată, rugoasă sau încreţită, subţire sau groasă, rareori având tendinţa să se scufunde în mediu. În absenţa unei pelicule, uneori, se formează un inel, care poate varia de la incomplet la unul gros, rugos [1]. După o lună de menţinere la 250C pe mediu cu glucoză, extract de drojdii, peptonă – agar, cultura este albă sau gălbuie spre crem închis. Arareori are o tentă uşor maronie. Suprafaţa este netedă, catifelată, zbârcită, rugoasă sau încreţită, umedă, lucioasă sau strălucitoare, cu o structură moale până la dură, convexă cu marginea întreagă sau neregulată. Cultivate pe mediu cu făină de porumb agarizat formează un miceliu abundent, iar artrosporii au mărime variabilă, adesea cu o citoplasmă optic densă. Artrosporii sunt în număr mare sau lipsesc. Frecvent se observă diferenţierea unui pseudomiceliu, care poate fi bine dezvoltat, cu blastosporii aranjaţi în lanţuri şi ciorchini. În unele culturi blastosporii cresc direct din hife sau din artrospori, singuri (izolaţi), în mici lanţuri sau sunt încolăciţi. Numărul lor este mic sau mare şi au o citoplasmă optic densă. În alte culturi miceliul poartă numai celule terminale sau ovale, care se pot întâlni singure sau în mici lanţuri. Aceste celule prezintă o citoplasmă optic densă şi cel puţin unele dintre ele se înmulţesc prin înmugurire. În altele izolate, miceliul şi atrosporii pot lua o formă bizară. Se pot întâlni şi blastospori. Se întâlnesc şi celule gigante, globuloase sau de forme bizare, în special pe mediu cu glucoză şi făină de cartof. Endosporii asexuali se formează prin clivare protoplasmică. Celulele globulare, elipsoidale sau în formă de pară, pot conţine 1 – 6 (sau mai mulţi) endospori, de mărimi variate, globulari sau elipsoidali. Endosporii se formează în culturi tinere, însămânţate pe mediu cu glucoză, extract de drojdie şi peptonă. Capacitatea de a forma endospori prin clivaj protoplasmic a fost aparent pierdută după câteva transferări. Se întâlnesc şi endospori formaţi prin înmugurire internă. Endosporii pot fi observaţi în culturi după 2 săptămâni, la 250C şi după o săptămână la 250C în culturile însămânţate în pantă. Specia Trichosporon cutaneum nu are capacitate fermentativă. Asimilează glucoza, galactoza (rareori - ), L – sorboza (sau - ), zaharoza (rareori - ), maltoza (rareori - ), elobioza (rareori - ), trehaloza (sau - ), lactoza, melibioza (sau - ), rafinoza (sau - ), melizitoza (sau - ), d – xiloza, L – arabinoza (rareori - ), DL – acidul lactic (sau - ), acidul citric (sau - ), inositolul (rareori - ). Tiamina şi biotina stimulează creşterea. Temperatura maximă de creştere este de 29…410C. Recent genul Trichosporon a fost reviziut pe baza unui număr de caracteristici referitoare la morfologie, ultrastructura porilor septali, sistemul coenzimei Q, conţinutul G+C al ADN şi la secvenţierea parţială a ARN ribozomal 26S (Figura 5) [47, 48].
Pentru menţinerea şi cultivarea drojdiei Trichosporon cutaneum au fost utilizate diferite medii de cultură. Mediul YEPD – conţine extract de drojdie 1%, peptonă 2%, glucoză 2%. Mediul sintetic minimal are în compoziţie 0,67% azot de drojdie pe bază de aminoacizi şi 2% glucoză, mediul minimal D este prezentat în Tabelul 5. Mediul solid se obţine prin adiţia a 2% agar şi suplimentarea cu aminoacizi a căror concentraţie finală este cuprinsă între 5 – 50 mg/ml-1 [2]. Tabelul 5. Mediu minimal D, g×l-1.
Yüklə 216,1 Kb. Dostları ilə paylaş:
|
