2011 YÜksek lisans tez özetleri

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

GÜLER Zeliha

Danışman : Prof. Dr. Şehnaz BOLKENT

İkinci danışman Doç. Dr. Şebnem ERÇELEN

Anabilim Dalı : Biyoloji

Programı : Zooloji

Mezuniyet Yılı : 2011

Tez Savunma Jürisi : Prof. Dr. Şehnaz BOLKENT

Prof. Dr. Tuncay ORTA

Prof. Dr. Seyhan ALTUN

Doç. Dr. Gül ÖZCAN ARICAN

Doç. Dr. Leman YALÇINTEPE GÜNEŞTURAR


Yeni Sentezlenen Dna Nanotaşiyicilarinin Gen Salim Amaciyla Hücre Transfeksiyonu Ve Toksisitelerinin İncelenmesi

Gen terapisi, genetik ya da edinilmiş hastalıkların tedavisi amacıyla, hedef hücrelere terapötik genlerin vektör adı verilen bir DNA taşıyıcısı aracılığıyla aktarımı ve aktarılan genlerin ekspresyonu temeline dayanır. Bu aşamaların gerçekleşmesi sırasında vektör, transfeksiyon verimini etkileyen çeşitli hücresel bariyerler ile karşılaşır. Gen terapisinde kullanılacak vektörün hücresel bariyerleri aşarak; hücreleri en düşük toksisite ile en etkili şekilde transfekte etmesi arzu edilir. Bu nedenle uygun vektörün seçimi oldukça önemlidir. Gen terapisinde viral ve viral olmayan olmak üzere iki temel vektör sınıfı olmasına rağmen, viral olmayan vektörlerin birçok üstünlüğe sahip olmalarından dolayı bu çalışmada viral olmayan, yeni sentezlenmiş ve BG-2 olarak adlandırılmış oligoelektrolit temelli kopolimer tercih edilmiştir.

Bu tez çalışmasında yeni sentezlenmiş BG-2 oligoelektrolitinin transfeksiyon aşamalarında karşılaşılan bariyerleri aşabilme yeteneği, insan serviks epiteloid karsinoma HeLa, insan nöroblastoma SH-SY5Y ve sıçan C6 glioma olmak üzere üç farklı hücre soyu üzerindeki transfeksiyon verimi ve toksik etkisi incelenerek başta kanser olmak üzere birçok genetik ya da edinilmiş hastalıkların tedavisi için gen terapisinin başarısının arttırılması amaçlanmıştır. Ayrıca transfeksiyon aşamalarının aydınlatılması ve bu konuda literatürde mevcut olan eksikliklerin giderilmesine katkıda bulunulması hedeflenmiştir.

BG-2 oligoelektrolitinin 9-(dietilamino)-5H-benzo[R]fenoksazin-5-on (Nil kırmızısı) floresans probu aracılığıyla kiritik misel konsantrasyonu (CMC), DNA molekülü ile oluşturduğu kompleks yapısı ise 1,1'-(4,4,8,8-tetrametil-4,8-diazaundekametilen)bis-4-[[3-metilbenz-1,3-okzazol-2-il]metilidin]-1,4-dihidroquinolinyum] tetraiodid (YOYO-1) probunun floresansından yararlanılarak floresans spektrometrede belirlendi. DNA/BG-2 kompleksinin boyutu Nanosizer boyut ölçüm cihazı aracılığıyla tespit edildi. DNA/BG-2 kompleksinin anyonik 1,2-dimiristoil L-α-fosfatidil-DL-gliserol (DMPG) ve nötral 1,2-dimiristoil-sn–glisero-3-fosfokolin (DMPC) model mebranları ile etkileşimleri etidyum bromür floresansında (EtBr) meydana gelen değişimlerin floresans spektrometrede izlenmesi ile incelendi. BG-2 molekülü ile kompleks halinde bulunan DNA molekülünün, Deoksiribonukleaz I (DNaz I) ve serumda bulunan nukleazların aktivitesine karşı direnci agaroz jel elektroforezinde belirlendi. HeLa, SH-SY5Y ve C6 glioma hücre soyları yeşil floresans protein (GFP) kodlayan pEGFP plazmidi ve lusiferaz enzimini kodlayan pGL4.51 plazmidi ile transfekte edildi. BG-2 oligoelektrolitinin transfeksiyon verimi; GFP ekspresyonunun floresans invert mikroskopta görüntülenmesi ve lusiferaz gen ekspresyonunun luminometrede ölçülmesi ile belirlendi. BG-2’nin transfeksiyon veriminin yanısıra 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) ve Bikinkoninik asit (BCA) yöntemi ile hücreler üzerindeki toksik etkisi de incelendi.

BG-2 oligoelektrolitinin üç farklı hücre soyu üzerindeki transfeksiyon verimi incelendiğinde, en etkili HeLa hücrelerini transfekte ettiği, C6 glioma hücrelerini ise transfekste edemediği görüldü. BG-2’nin hücreler üzerinde toksik etki gösterdiği görülmesine rağmen; DNA ile BG-2 arasında kararlı ve küçük boyutlu komplekslerin oluşumu, oluşan komplekslerin model membranlar ile etkileşim profillerinin arzu edilen düzeyde olması, ayrıca BG-2’nin DNA’yı nukleaz aktivitesine karşı koruması BG-2 oligoelektrolitinin hücresel bariyerleri aşabildiğini göstermektedir. Bu sebeple, BG-2 oligoelektrolit yapısında uygulanacak küçük değişiklikler ile BG-2’nin gen terapisinde kullanıma uygun olacağı düşünülmektedir.