2012 YÜksek lisans tez özetleri

KARLIK Elif
Danışman : Doç. Dr. Filiz GÜREL

Anabilim Dalı : Moleküler Biyoloji ve Genetik

Mezuniyet Yılı : 2012

Tez Savunma Jürisi : Doç. Dr. Filiz GÜREL

Prof. Dr. Avni KURU

Prof. Dr. Şule ARI

Doç. Dr. Gülruh ALBAYRAK

Prof. Dr. Ayşegül TOPAL SARIKAYA

Arpa’da (Hordeum vulgare L.) Virüs Aracılığıyla Gen Susturulması Çalışmaları

Virüs aracılığıyla gen susturulması (VAGS) bitki genlerinin fonksiyonel analizinde kullanılan yaklaşımlardan biridir. Bu yaklaşım için kullanılan araçlardan biri üç parçalı genoma sahip pozitif-iplikli bir RNA virüs olan “Arpa çizgili mozaik virüsü” (Barley stripe mosaic virus, BSMV)’dür. Bu çalışmanın amacı arpada abiyotik strese yanıtla ilişkili olabileceği düşünülen bir genin seçilmesi ve VAGS yönteminde kullanılmak üzere BSMV vektörüne klonlanmasıdır.

Heterotrimerik G proteini (Gα, Gβ/Gγ alt birimleri) hücre sinyal ağının en önemli bileşenlerinden biridir. Arabidopsis G-proteini mutantlarının bitkide plastisiti ile yakından ilişkili olan ve stres toleransında rol oynayabileceğine dair yeni çalışmalar bulunmaktadır. G-proteini mutantları yaşayabilmekte ancak değişmiş sinyal iletiminden dolayı meyve sayısı ve tohum sayısındaki azalmanın yanı sıra kuraklık gibi stres koşulları altında bitkinin sahip olduğu uyum yeteneği etkilenmektedir. Bununla birlikte, bitkilerde G proteinleri ile stres yanıtı ve arasındaki ilişkiyi açığa çıkaran yeni çalışmalar yapılmalıdır. O nedenle bu çalışmada, gen susturulması çalışmalarında kullanılmak üzere arpa G-proteini α alt birimini kodlayan gen seçilmiştir. Öncelikle, bu genin NCBI veritabanında kayıtlı olan cDNA dizisi primer tasarımında kullanılmış. Bu genin arpada anlatımı kantitatif gerçek zamanlı PZR ile belirlenmiştir. İkinci aşama olarak VAGS uygulamalarında kullanılmak üzere bu alt birimi kodlayan 317 bç’lik bir parça BSMV γ-genomuna klonlanmıştır. PZR ve restriksiyon enzim analizi ile bu diziyi taşıyan bakteriyel klonlar gösterilmiştir.

Bu vektörler ileriki çalışmalarda arpa bitkilerine bulaştırılarak stresle ilişkili fizyolojilerinin araştırılmasında ve moleküler analizlerde kullanılabilecektir.

 

Virus-Induced Gene Silencing Studies in Barley (Hordeum vulgare L.)

Virus-induced gene silencing (VIGS) is one of the approaches used in functional analysis of plant genes. One of the tools used for this application is Barley stripe mosaic virus (BSMV) which is a tripartite, positive-sense RNA virus. The aim of this study is assessment of a gene that may be associated with the response to abiotic stresses in barley and cloning this gene into the BSMV construct for further VIGS applications.

Heterotrimeric G protein (Gα, Gβ/Gγ subunits) is one of the most important components of cell signaling network. There are recent studies that Arabidopsis G-protein mutants is closely related with phenotypic plasticity in plant and G-proteins may play a role in stress tolerance. G-protein mutants can survive but adaptability of the plant is affected by stress conditions such as drought and the number of fruit and seeds is reduced due to the altered signal transduction. However, new studies should be carried out to reveal a possible relationship between the stress response and G-proteins in plants. Therefore in this study, the gene coded barley G-protein α-subunit was selected for using gene silencing studies. At first, the cDNA sequence of this gene registered in the NCBI database was used for designing primers. Expression of this gene in barley was determined by quantitative Real-time PZR. Secondly, a 317 bp sequence encoding a part of this subunit has been cloned to BSMV γ-genome for VIGS applications. Bacterial clones carrying this sequence were demonstrated by PZR and restriction enzyme analysis.

These vectors can be used to infect barley plants for assesment stress physiology and molecular analysis.

MERİÇ Sinan
Danışman : Prof. Dr. Şule ARI

Anabilim Dalı : Moleküler Biyoloji ve Genetik

Mezuniyet Yılı : 2012

Tez Savunma Jürisi : Prof. Dr. Şule ARI

Prof Dr. Avni KURU

Prof. Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

Doç. Dr. Filiz GÜREL

Doç. Dr. Tijen TALAS OĞRAŞ

Misir İçeren Gida Ve Yemlerde Genetiği Değiştirilmiş Organizmalarla

İlgili Genetik Analizler

Günümüzde genetik yapısı değiştirilmiş bitkiler konusunda tartışmalara rağmen bu bitkilerin ekim alanları her yıl genişlemeye devam etmektedir. Son yıllarda genetik mühendisliği teknolojisi ile üretilen gıda ve yemler marketlerde yer almaktadır. Genetiği değiştirilmiş ürünlerin kullanımının uzun vadede çevre ve insan sağlığı üzerindeki etkileri bakımından kontrollü şekilde üretimi ve tüketiciye sunulması yasal bir zorunluluktur.

Bu çalışmada Türkiye’nin farklı bölgelerinde yetiştirilen 11 adet mısır tohumu ve bu tohumlardan üretilmiş 11 adet hayvan yemi ile marketlerden satın alınan mısır içerikli 11 adet çeşitli işlenmişlik düzeylerine sahip gıda örneğinde genetik değişikliklerin saptanmasına yönelik olarak yabancı gen temeline dayalı genetik analizler yapıldı. Tüm örneklerde genetiği değiştirilmiş bitkilerde yaygın olarak kullanılan kontrol dizilerinden 35S promotor ve NOS terminatör taranması, geleneksel PCR ile gerçekleştirildi. PCR sonucu genetik değişiklik saptanan yem örneklerinin içerdiği transgenik bitkinin Bt176 mısır ve GTS-40-3-2 soya olup olmadığının araştırılması için ise sırasıyla Nested PCR ve geleneksel PCR analizleri yapıldı.

Yapılan analizler sonucu 11 adedi yem, 3 adedi mısır tohumu ve 1 adedi de gıda olmak üzere toplam 15 adet yabancı gen içeren örnek belirlendi. Transgenik olduğu belirlenen bu örneklerden 3 adet mısır tohumu ve 1 adet gıdanın sadece nos terminatör dizisini taşımaları, bu örneklerdeki transgenik mısır çeşidinin GA21 veya MIR603 olduğunu düşündürdü. Hem 35S hem de NOS terminatör dizisinin birlikte bulunduğu yem örneklerinde Bt176 mısır çeşidine özgü primerler ile gerçekleştirilen Nested PCR sonucunda yem örneklerinin hiçbirinde Bt176 mısır çeşidinin taşıdığı böcek direnci sağlayan cryIA(b) dizisi belirlenemedi. Buna karşılık transgenik soya çeşidi GTS-40-3-2’nin taşıdığı herbisit toleransı sağlayan CP4-EPSPS gen kasedine özgü primerler ile gerçekleştirilen geleneksel PCR sonucunda yem örneklerinin tamamında GTS-40-3-2’ye özgü diziler saptandı.

Genetically Modified Organisms Related Genetic Analysis of Maize

Derived Food and Feed

Despite to controversy about genetically modified plants, these plants are still cultivated incrementally. In recent years, many food and feed products that produced by genetic engineering technology are found places on the market shelves. Controlling of the production and presentation of genetically modified crops is very important for environment and human health, especially in terms of long term consumption.

In this study, 11 kinds of corn seeds which are grown in different regions in Turkey, 11 kinds of animal feed which are containing corn seeds, and 11 different processed corn food were used for genetic analysis based on foreign gene determination. All samples were screened with conventional PCR technique by using widely used genetic elements, 35S promoter and nos terminator squences for GMOs. After the determination of GM containing samples, nested PCR and conventional PCR analysis were performed to find out if the samples are contained Bt176 or GTS-40-3-2 for corn and soy, respectively. As a result of PCR based GMO analysis, totally 15 samples were found as transgenic. Those are 11 of feed samples, 3 of maize seeds samples and 1 of food samples. These 3 maize samples and 1 food sample were contained only NOS terminator sequences, so this situation was thought that they might be GA21 or MIR603 transgenic maize line. Both 35S and NOS including feed samples or in other words potential Bt176 containing samples were analysed with Bt176 cryIAb gene specific primers via nested PCR. Eventually, none of them were found Bt176 positive. On the other hand, when we applied conventional PCR to the same samples with the CTP4-EPSPS construct specific primers for transgenic soy variety GTS-40-3-2, we found that all samples were positive for GTS-40-3-2.

  

MARAKLI Sevgi

Danışman : Prof. Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

Anabilim Dalı : Moleküler Biyoloji ve Genetik

Mezuniyet Yılı : 2012

Tez Savunma Jürisi : Prof. Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

Prof. Dr. Nazlı ARDA

Prof. Dr. Şule ARI

Doç. Dr. Ercan ARICAN

Doç. Dr. İbrahim İlker ÖZYİĞİT

Arpa (Hordeum vulgare L.) Kültür Varyetelerinde Transpozon ve Kromozom Analizleri

Retrotranspozonlar genom içinde hareket edebilen elementlerdir. Hareketleri gelişim boyunca farklılık göstermektedir. Değişik dokularda retrotranspozon hareketlerindeki farklılık incelenmesine karşın gelişim süresinde hareket farklılığını inceleyen çalışmalar sınırlıdır. Bu çalışmada, arpada bitkisinde (Hordeum vulgare L. cv. Tokak 157/37) gelişim sırasında IRAP (“Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism”) tekniği kullanılarak embriyo, kök ve yapraklarda BARE1 (Barley Retroelement 1) ve BAGY2 (Barley Gypsy Element 2) retrotranspozon hareketleri ve Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (“RT-PCR”) ile gen anlatım profilleri incelendi. Retrotranspozonlar moleküler düzeyde incelendikten sonra retrotranspozonların kromozomal düzeydeki etkileri arpa kromozomlarında analiz edildi.

BARE1 ve BAGY2 retrotranspozonlarının hareketliliğini incelemek amacıyla DNA ve RNA izolasyonu yapıldı. Örnekler, 10 günlük kök ve yapraklardan alındı. Elde edilen DNA’lar kalıp olarak kullanıldı. BARE1 ve BAGY2 retrotranspozonları için ikişer farklı primer ile IRAP-PCR yapıldı. PCR ürünleri poliakrilamit jel elektroforezinde ayrıldı ve incelendi. İzole edilen RNA’lar ise, cDNA oluşturulmak üzere kalıp olarak kullanılarak gen anlatım profilleri açısından araştırıldı.

Arpa kromozomlarının incelenmesi amacıyla, çimlendirilen arpa tohumları Carnoy fiksatifi (3:1, etanol:asetik asit) içerisine konuldu. Kök uçları daha sonra preparat yapımında kullanıldı. Metafaz evresinin gözlenmesi amacı ile preparatlar DAPI (4′,6-diamidin-2-fenilindodihidroklorit) ile boyanıp floresan mikroskopta incelendi.

BARE1 retrotranspozonunda çok az hareket gözlenirken, BAGY2 retrotranspozonunun stabil (hareketsiz) olduğu görüldü. BARE1-gag, BAGY2-env ve BAGY2-rt domenlerinin (retrotranspozonların yaşam döngüsü için gerekli proteinleri kodlayan bölgeler) PCR analizlerinde BARE1 gag domeni genomik DNA’dan çoğaltılabilmesine karşın cDNA’dan çoğaltılamadı. BAGY2 env domeninin ise embriyo ve yaprak cDNA’larından çoğaltılabilmesi env’nin bu örneklerde anlatım yaptığını göstermektedir. Buna karşın, kök dokuları ile yapılan PCR’ın negatif sonuç vermesi, env domeninin kökte aktif olmadığının göstergesidir. BAGY2 rt domeni için yapılan PCR, hem genomik DNA’larda hem de cDNA’larda pozitif sonuç vermiştir.

Buna karşın, farklı tohumların çimlendirilmesi ile elde edilen, aynı dokulara ait cDNA’larda görülen PCR ürünü miktarlarının farklı olması, bireyler arasında rt domeninin anlatım profilinin değişebileceğini göstermektedir.

Arpa bitkisinde gelişim sırasında retrotranspozon hareketlerinin incelenmesi ile ilgili yapılan çalışmalar sınırlıdır. Bu tez çalışmasından elde edilen sonuçlar, arpa gelişiminde BARE1 ve BAGY2 retrotranspozon hareketlerinin ve gen anlatım profillerinin farklılığını göstermektedir. Elde edilen bulguların, epigenetik değişimlerin arpa gelişimi üzerindeki etkilerinin anlaşılmasına katkı sağlaması beklenmektedir. Arpa kromozom analizleri ile retrotranspozonların kromozom üzerinde yerlerinin belirlenmesi ve sebep olduğu kromozomal anomaliler gibi konularda daha kapsamlı bilgilere ulaşılması beklenmektedir.

Transposon and Chromosome Analysis on Barley (Hordeum vulgare L.)

Culture Varieties

Retrotransposons are genetic elements that can move within the genome. Their movements show difference during development. Although retrotransposon movements were investigated in various tissues, studies on retrotransposon movements during development are limited. In this study, BARE1 (Barley Retroelement 1) and BAGY2 (Barley Gypsy Element 2) retrotransposon movements in barley (Hordeum vulgare L. cv. Tokak 157/37) embryo, root and leaves were investigated during development by using IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) molecular marker technique and gene expression profiles by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). After retrotransposons were investigated at molecular level, retrotransposons effects at chromosomal level were analysed barley chromosomes.

DNA and RNA isolations were performed to examine BARE1 and BAGY2 retrotransposon movements. Samples were obtained from 10-day-old barley root and leaves. The resulting DNAs were used as template. IRAP-PCR for BARE1 and BAGY2 retrotransposons was carried out by using two different primers for each. PCR products were separated and analysed by Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Isolated RNAs used as template to synthesize cDNA were investigated in terms of gene expression profiles.

Barley seeds were put into Carnoy fixative (3:1, ethanol:acetic acid) to investigate barley chromosomes. Root tips were then used for preparation. To observe metaphase phase, preparations were stained with DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and investigated by a fluorescence microscope.

Very low BARE1 retrotransposon movements were monitored whilst BAGY2 retrotransposons were observed to be more stable (immobile). In PCR analysis of BARE1-gag, BAGY2-env and BAGY2-rt domains (regions that encode proteins necessary for the life cycle of retrotransposons), although BARE1 gag domain was amplified from genomic DNA, it could not be amplified from cDNA. The amplification of BAGY2 env domain from embryo and leaf cDNAs indicates that env is expressed in these samples. On the other hand, PCR with root tissue showing a negative result demonstrates that env domain is not active in the roots.

PCR analysis from BAGY2 rt domain gave positive results with both genomic DNAs and cDNAs. On the other hand, different PCR products of cDNAs, belonging to the same tissue derived from different germinating seeds, demonstrate that the expression profile might change among individuals.

Studies on retrotransposon movements in barley during development are limited. Results obtained from this thesis indicate that BARE1 and BAGY2 retrotransposon movements and gene expression profiles are different.

The findings are expected to contribute to understanding of the effects of the epigenetic changes during barley development. Barley chromosome analyses are also expected to give more comprehensive information such as determination of retrotransposons locations on chromosome and chromosomal aberrations caused by retrotransposons.

GULIYEV Mehrab
Danışman : Prof. Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

Anabilim Dalı : Moleküler Biyoloji ve Genetik

Mezuniyet Yılı : 2012

Tez Savunma Jürisi : Prof. Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

Prof. Dr. Keriman GÜNAYDIN

Doç. Dr. Filiz GÜREL

Doç. Dr. Gülruh ALBAYRAK

Doç. Dr. İbrahim İLKER ÖZYİĞİT

İnsan Endojen Retrovirüs H (HERV – H)' ın Genomik Analizi

Endojen retrovirüsler (ERV’ler) ve ERV benzeri diziler insan genomunun %8’ini oluşturmaktadır. ERV lokuslarının bilinmeyen bir kısmı transkripsiyona uğrar ve böylece insan transkriptomuna katılır. Bu bölgelerin küçük bir kısmı işlevsel proteinleri kodlar. ERV’lerin normal ve hastalıklı biyolojik süreçlerdeki rolü daha belirlenmediği için transkripsiyonu yapılan ERV lokusları ilgi çekmektedir. Bu çalışmada, insan endojen virüs H’ın (HERV-H) LTR7A (450 bç), LTR7B (464 bç) ve LTR7C (471 bç) bölgelerinin PZR ile analizi ve popülasyon arasındaki karşılaştırması amaçlanmıştır. Farklı etnik kökenli 20 bireyde alınan kan örnekleri, genomdaki entegrasyon bölgesi varyasyonlarının belirlenmesi için kullanılmıştır. Elde edilen genomik DNA’lar, HERV-H geninin LTR bölgelerini kapsayan 6 primer çifti ile incelenmiştir. “Inter-retrotransposon amplified polymorphism” (IRAP) yöntemi polimorfizm analizleri için uygulanmıştır. Tüm bireylerde polimorfizm gözlenmiştir. Elde edilen bulguların, HERV-H’in insan popülasyonlarındaki değişimlerinin ve genoma olan etkilerinin anlaşılmasına katkı sağlaması beklenmektedir.

Genomic Analysis On Human Endogenous Retrovirus H (Herv-H)

Endogenous retroviruses (ERVs) and ERV-like sequences comprise 8% of the human genome. An unknown proportion of ERV loci are transcribed and thus contribute to the human transcriptome. A small proportion of these loci encode functional proteins. As the role of ERVs in normal and diseased biological processes is not yet known, transcribed ERV loci are of particular interest. In this study, we aimed to analyse LTR7A (450 bp), LTR7B (464 bp) and LTR7C (471 bp) parts of human endogenous retroviruses (HERV-H) with PZR and compare in between the population. Blood samples obtained from 20 individuals of different etnic origin were used for determination of the integration region variations at genome. Isolated genomic DNAs were screened using 6 primers pairs covering LTR regions of HERV-H gene. Inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP) technique was performed for polymorphism analyses. İt wos observed polymorphism patterns in all individuals. Findings obtained are expected to contribute to understanding of the effects of HERV-H to the variation in human populations and the genome.

  
UZ Gülşen
Danışman : Prof. Dr. Ayşegül TOPAL SARIKAYA

Anabilim Dalı : Moleküler Biyoloji ve Genetik

Mezuniyet Yılı : 2012

Tez Savunma Jürisi : Prof. Dr. Ayşegül TOPAL SARIKAYA

Prof. Dr. Avni KURU

Prof. Dr. Nazlı ARDA

Prof. Dr. Şule ARI

Doç. Dr. Kadir TURAN

Schizosaccharomyces pombe'de Mitotik Mikrotübül Oluşumu

Üzerine Magnezyumun Etkisi

Magnezyum (Mg²⁺), hücresel sistemlerde en çok bulunan divalent katyon olup, birçok biyolojik fonksiyon için önemlidir. Biyomembranların ve nükleik asitlerin kararlılığını sağlar; DNA, protein sentezi ve iyon kanallarının çalışmasının düzenlenmesi gibi birçok hücresel işlevden sorumlu 300' den fazla enzimin ko-substratıdır. Ayrıca magnezyum, mikrotübül polimerizasyonu ve sitokinez gibi diğer hücresel işlevlerle de ilgilidir. Kardiyovasküler hastalıklar, primer hipertansiyon, diabet ve metabolik sendrom gibi pekçok hastalık, Mg²⁺ homeostasisinin bozulmasıyla ilişkilidir.

Mitozun ilk aşamalarında, mitotik mikrotübüllerin polimerizasyonu, Mg²⁺ ve GTP varlığında gerçekleşir. Önceleri yapılan bir çalışmada, hücreler büyürken hücre içi Mg²⁺ konsantrasyonunun düştüğü ve bunun mitotik mikrotübüllerin oluşumunu sağladığı, hücre bölünmeden önce hücre içinde Mg²⁺ konsantrasyonunun artarak mitotik mikrotübüllerin depolimerize olduğu yönünde bir hipotez öne sürülmüştü. Magnezyumun, mikrotübüllerin polimerizasyonunu teşvik ettiği bilinmesine rağmen, hücre bölünmesi öncesinde mitotik mikrotübüllerin depolimerizasyonunu nasıl sağladığını gösteren özgün bir çalışma bulunmamaktadır. Ayrıca bu zamana kadar, Mg²⁺’ nın mikrotübüller üzerindeki ekisini anlamak amacıyla, mikrotübüllerin floresan mikroskobunda görünür hale gelmesi için immunofloresan yöntem kullanılmıştır. Bu yöntem hücrelerin fikse edilmesini gerektiren bir yöntem olup, Mg²⁺’nin mitotik mikrotübüller üzerine etkisi gösterilmemiştir. Dolayısla Mg²⁺’nın mitotik mikrotübüller üzerine etkisini göstermek için, Schizosaccharomyces pombe’nin, bilinen iki magnezyum transport geni bakımından delesyonlu ikili mutant ırkı ve bu ırkın elde edildiği magnezyum transport sistemine sahip atasal ırkı, kontrol olarak kullanıldı. Mikrotübülleri floresan mikroskobunda görünür hale getirmek için, iki ırka, GFP işaretli alfa 2 tubulin geni taşıyan pDQ105 plazmiti aktarıldı. Magnezyumun GFP işaretli mitotik mikrotübüller üzerine etkisini göstermek ve eş zamanlı olarak da serbest Mg²⁺’nın kantifikasyonunu yapmak için, iyon formundaki Mg²⁺’ya özgün Mag-fura 2 AM probu kullanıldı.

Sadece iyon formundaki Mg²⁺’nin kantifikasyonu için oldukça duyarlı olan orantısal görüntüleme (ratiometric imaging) yöntemi kullanılarak, hücre içi serbest Mg²⁺’nın, ikili mutantta kontrole göre daha düşük olduğu gösterildi. Schz. pombe’de mag-fura 2 AM probunun kalibrasyon güçlüğü nedeniyle, hücre içi Mg²⁺ kantifikasyonu yapılamadı. GFP işaretli mikrotübüllerin mag-fura 2 probuna karşı oldukça duyarlı olduğu gösterildi ve mag-fura 2 yüklü hücrelerde mikrotübüller gözlenemedi. Bu nedenle mikrotübüllerin ve serbest magnezyumun eş zamanlı gösterebilmesi için, kullandığımız yöntemin geliştirilmesi gerektiğine karar verildi. Diğer taraftan ikili mutantta başlangıçta sağlıklı interfaz mikrotübülleri görülmesine rağmen, ilk hücre bölünmesinden sonra, kısa, daha az sayıda ve organizasyonu bozulmuş interfaz mikrotübülleri görüldü. Kontrol ırkta dördüncü bölünmeden sonra mikrotübüller görülmez hale gelirken, ikili mutantta ikinci bölünmeden sonra mikrotübüller görülmez hale geldi. Bu durumun, ikili mutantın mikrotübül polimerizasyonu için gerekli Mg²⁺' yı, ya pasif yolla sınırlı olarak dış ortamdan almasından ya da mitokondri gibi hücre içi Mg²⁺ depolarından kullanmasından ileri geldiği düşünüldü. Ayrıca logaritmik fazda, kontrol ırka ait hücrelerde mitotik mikrotübül yüzdesi %17 iken, ikili mutant hücrelerinde %4 olup hücrelerin ~ %70’inin uzun, septumsuz ve tek nukleuslu olduğu gözlendi. Bu bulgulara dayanarak, ikili mutant ırka ait hücrelerinin, hücre döngüsünün G2-M evresinde tutuklandığı düşünüldü. Bulgularımız Mg²⁺ eksikliğinin, mitotik mikrotübüllerin oluşumunu engellediğini, dolayısıyla mitotik mikrotübül oluşum kontrol noktasının etkilenerek, hücre döngüsünde tutuklanmaya yol açmış olabileceğini göstermektedir. Magnezyum eksikliğinin, mitotik mikrotübüller ve de mikrotübül oluşum kontrol noktasına olan etkisinin daha iyi anlaşılabilmesi için, ikili mutantın model hücre olarak kullanılarak, gen anlatım profillemesi yapılmasına gereksinim vardır.

The Effect of Magnesium on the Formation of Mitotic Microtubules in

Schizosaccharomyces pombe

Magnesium (Mg²⁺) is the most abundant intracellular divalent cation in cellular systems and important in a great variety of biological functions. It stabilizes biomembranes and nucleic acids and cosubstrate for more than 300 enzymes related multiple cellular processes like DNA, protein synthesis and modulation of ion channels. Magnesium is involved in many other cellular processes such as microtubule polymerization and cytokinesis. An abnormal Mg²⁺ homeostasis is associated with several disease conditions, such as cardiovascular diseases, essential hypertension, diabetes mellitus, and metabolic syndrome.

In the first stages of mitosis, polymerization of microtubules occurs in the presence of magnesium and GTP. According to a hypothesis from a previous study; when cells grow, intracellular Mg²⁺ concentration falls. This triggers the formation of mitotic microtubules. Shortly before cell division, rapid Mg²⁺ influx occurs and intracellular Mg²⁺ reaches to a concentration that brings about mitotic microtubules breakdown. However the stimulating effect of magnesium on polymerization of microtubules was known, there hasn’t been any spesific research that shows how magnesium causes depolymerisation of mitotic microtubules before cell division. Also until now, to make microtubules visible, immunofluorescence technique that is only limited to fixed (i.e., dead) cells, has been used to understand the effect of Mg²⁺ on interphase microtubules not mitotic microtubules. So to show the effect of magnesium on mitotic microtubules during mitosis, two Schizosaccharomyces pombe strains were used. One is double mutant strain which was deleted in terms of two essential magnesium transporter genes and its parental strain which has magnesium transport system as a control. The pDQ105 plasmid carrying GFP tagged alpha 2 tubulin gene, was introduced to these two strains to label microtubules fluorescently. Mag-fura 2 AM prob which is spesific for ionized magnesium was used to show the effect of magnesium on GFP labelled mitotic microtubules and quantify the ionized magnesium simultaneously.

Using the ratiometric imaging technique which is a very sensitive method for quantifying only free Mg²⁺, it has been confirmed that intracellular free magnesium is relatively lower in the double mutant than in control. Because of the mag-fura 2 probe calibration difficulties in Schz. pombe, intracellular free Mg²⁺ quantification couldn’t have been done. It was shown that GFP tagged microtubules were very sensitive to chemicals like Mag-fura 2 AM and microtubules were invisible in mag fura 2 loaded cells so our method needs for improvement to show microtubules and free magnesium simultaneously. On the other hand, at first we observed healthy interphase microtubules in the double mutant, however after first division, we observed short, reduced number of microtubule bundles and defects in microtubule organisation. After the second division, microtubules became invisible in the double mutant, although we observed the same for the control after the forth division. This made us think that the double mutant uptaked Mg²⁺ which is essential for the polymerisation of microtubules, either by passive transport in limited quantities or consumed from intracellular stores such as mitochondria. Also in logaritmic phase, the percentage of mitotic microtubules in the double mutant was %4, whereas in control strain was %17 and ~ %70 of the double mutant cells were long without septum and contained only one nuclei. This showed us, the double mutant cells were arrested in G2-M phase of the cell cycle. According to our findings, we think that magnesium deficiency may cause cell cycle arrest by preventing the formation of mitotic microtubules so effecting spindle assembly checkpoint. For a better understanding the effect of magnesium deficiency on mitotic microtubules and so on spindle checkpoint, gene expression profilling needs to be done using the double mutant as a model cell.