Alergeni–testul de degranulare a bazofilelor (bdt)
Yüklə 103,95 Kb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Denumire aditiv Surse Manifestari clinice
- Amestec coloranti alimentari I
- Reactii imunologice (alergice) Reactii idiosincratice (pseudo-alergice)
- Anestezice
- Recomandari pentru efectuarea testului BDT
- Materiale dentare Alergeni profesionali
- 2. Evidentierea pseudo-alergiilor la aditivi si coloranti alimentari
- Specimen recoltat
- Cauze de respingere a probei
- Interpretarea rezultatelor 1. Rezultat negativ
Alergeni–testul de degranulare a bazofilelor (BDT)Informatii generale Progresul tehnologic a furnizat laboratoarelor instrumente noi de cuantificare a anticorpilor IgE alergen-specifici atat in ser cat si pe suprafata bazofilelor. Alaturi de determinarea in ser de IgE alergen-specifice prin metode automate standardizate au fost dezvoltate si teste functionale care mimeaza in vitrocontactul dintre alergeni si celulele responsabile de aparitia simptomelor alergice si care pun astfel in evidenta sensibilizarea de tip imediat. Printre acestea se numara si testul de degranulare a bazofilelor (BDT) cu masurarea sulfidoleucotrienelor eliberate. Pana nu demult s-a considerat ca bazofilele, care reprezinta doar un procent de 0.5% din totalul leucocitelor din sangele periferic, sunt doar forme circulante ale mastocitelor cu semnificatie minora. Date recente indica insa faptul ca bazofilele sunt clinic relevante si detin alaturi de mastocite un rol esential in raspunsul alergic de tip imediat. Prima orientare catre studii functionale ale bazofilelor a fost testul de eliberare a histaminei, insa beneficiul sau clinic a fost controversat datorita sensibilitatii si specificitatii reduse. Testul efectuat in laboratorul nostru are o sensibilitate ridicata si, spre deosebire de masurarea IgE specifice in ser, determina si anticorpii IgE specifici legati de bazofile. Mai mult, ca test clasic de “provocare”, BDT reprezinta singurul instrument diagnostic in vitro pentru studierea unui numar mare de reactii adverse la aditivi alimentari si medicamente (anestezice, antiiflamatoare nesteroidiene, antibiotice) care nu sunt IgE mediate (asa-zisele pseudo-alergii in care se produce cel mai adesea o degranulare celulara directa). Avantajul este ca la BDT nu intervin mediatori preformati ca in cazul testului de eliberare a histaminei; in cazul existentei unei sensibilizari, leucotrienele sunt sintetizate abia dupa contactul cu alergenul. De asemenea testul nu este alterat printr-o eliberare toxica a mediatorilor preformati3;4;5. Reactii adverse la aditivi alimentari Aditivii sunt substante adaugate alimentelor sau preparatelor farmaceutice in scopuri multiple, vizand: -conferirea unor calitati gustative (edulcorante, aromatizante, excitante si/sau secretorii); -conservarea pe termen lung (antioxidanti, antibacteriene). Numerosi aditivi au fost incriminati in producerea unei palete largi de reactii adverse, de la letargie pana la astm sever si anafilaxie. Urmatoarele substante au fost in mod extensiv analizate: coloranti sintetici, sulfiti, monosodium glutamat (MSG), aspartam si benzoati. Astfel, un studiu recent efectuat in Germania a estimat o prevalenta a reactiilor adverse la aditivi alimentari de 0.18%. Unii aditivi alimentari sau farmaceutici au fost implicati in producerea astmului profesional, urticariei cronice sau dermatitei atopice. Cu toate acestea, multe din aceste reactii nu au fost confirmate prin proceduri diagnostice adecvate. Acest lucru se datoreaza faptului ca aditivii sunt in general molecule mici care determina manifestari clinice similare alergiei de tip imediat insa prin mecanisme non-IgE, cum ar activarea sistemului complementului si eliberarea directa a histaminei si leucotrienelor din leucocite (vezi figura). BDT reprezinta un instrument pretios pentru diagnosticul pseudo-alergiilor la aditivi alimentari. 
Fig 17.4.1 Pseudo-alergia la aditivi alimentari. In tabelul de mai jos sunt mentionati colorantii si aditivii alimentari pentru care sunt disponibile testele BDT, sursele care le contin, precum si principalele manifestari clinice induse de acestia2;6:
In cazul suspiciunii de intoleranta la aditivi alimentari (conservanti, antioxidanti, coloranti) se recomanda screening-ul pe 4 grupe de teste: Amestec coloranti alimentari I: amarant, azorubin, galben chinolin, rosu „ponceau”, galben-orange. Amestec coloranti alimentari II: eritrozina, albastru patent, indigocarmin, negru brilliant. Amestec aditivi alimentari I: tartrazina, benzoat de sodiu, nitrit de sodiu, metabisulfit-K, salicilat de sodiu. Amestec aditivi alimentari II: oxid de fier, acid benzoic, glutamat, hidroxibenzoat de propel. Daca se obtine un rezultat pozitiv pentru unul dintre amestecuri, este posibila testarea individuala a a substantelor, dar dupa o noua recoltare3. Reactii pseudo-alergice la medicamente Sindroamele induse de medicamente care sunt sugestive pentru o reactie alergica de tip imediat dar la care nu poate fi demonstrat un mecanism imunologic sunt denumite reactii de hipersensibilizare non-alergica sau pseudo-alergii medicamentoase. Acestea constituie un subset de reactii idiosincratice care trebuie diferentiate clinic de reactiile imunologice (alergice) – vezi tabelul 17.4.2
Tabel 17.4.2 Exemple obisnuite de hipersensibilitate la medicamente Majoritatea reactiilor pseudo-alergice implica aceeasi cale finala comuna ca si reactiile de tip I; in aceste cazuri (reactiile dupa substante radiologice de contrast, astmul indus de aspirina, urticaria asociata cu opiacee) bazofilele si mastocitele sunt activate prin mecanisme non-imunologice cu eliberarea de mediatori vasoactivi. Multe dintre reactiile adverse atribuite substantelor de contrast se datoreaza hipertonicitatii acestora care faciliteaza eliberarea de histamina din mastocite si bazofile. Substantele mai noi, care nu contin iod, au un potential mai redus de pseudo-alergii dar pot asocia si acestea reactii severe, uneori mediate IgE. Aspirina si celelalte AINS inrudite pot fi implicate in doua sindroame de hipersensibilitate non-alergica: -astmul indus de aspirina: rinosinuzita eozinofilica cronica cu polipoza nazala si astm persistent; -urticarie/angioedem declansate de aspirina. Aceste reactii acute non-alergice sunt initiate ca urmare a inhibitiei ciclooxigenazei-1 de catre AINS. Ambele sindroame se caracterizeaza la nivel biochimic prin alterari profunde ale biosintezei eicosanoizilor, predominant prin productia excesiva de cisteinil-leucotriene si trebuie sa fie net diferentiate de alte reactii adverse la AINS prin mecanism alergic. Reactiile alergice se produc de obicei la un singur medicament antiinflamator sau la cateva medicamente cu structura chimica similara. Reactiile pseudo-alergice la anestezice locale sunt intalnite mai ales in practica stomatologica. Cele mai alarmante sunt episoadele de sincopa vaso-vagala care pot mima anafilaxia. Paresteziile si ametelile pot fi explicate pe baza toxicitatii farmacologice a preparatelor, iar simptomele sunt mai frecvente la pacientii cu intoleranta la medicamente1. Avand in vedere mecanismele mentionate, testul BDT poate avea un rol important in depistarea reactiilor pseudo-alergice la medicamente. In laborator este disponibila o paleta de alergeni standard care poate fi pusa in contact cu bazofilele pacientului:
La acestea se adauga posibilitatea de a trimite o tableta sau o fiola dint-un medicament pentru a fi testat3. Recomandari pentru efectuarea testului BDT 1. Evidentierea unei sensibilizari de tip I in urmatoarele situatii clinice: - imposibilitatea efectuarii unui test cutanat datorita pericolului unei reactii anafilactice; - in cazul suspiciunii clinice de alergie de tip imediat, desi Ig E specifice si testul cutanat sunt negative. BDT este in special util pentru urmatorii alergeni: – venin de albina si viespe; – praf de casa; – par/epitelii de caine si pisica; – latex, formaldehida si alte chimicale; – alfa-amilaza (care induce astmul brutarilor!); – acrilati utilizati in stomatologie. Mai jos sunt mentionati toti alergenii pentru care poate fi efectuat BDT in laboratorul nostru (cu exceptia medicamentelor si a aditivilor alimentari): Praf si acarieni Dermatophagoides pteronyssinus d1 Dermatophagoides farinae d2 Acarus siro d70 Amestec de acarieni (Dermatophagoides pteronyssinus d1, Dermatophagoides farinae d2) Amestec de acarieni (Acarus siro d70, Glycophagus domesticus d73, Lepidoglyphus destructor d71, Tyrophagus putreus d72) Fungi Alternaria alternata Aspergillus fumigatus Cladosporum herbarum Penicillium notatum Rhizopus nigricans Trichophyton mentagrophytes Stachybotris spp. Candida albicans Botrytis cinerea Fungi amestec (Penicillium notatum m1, Cladosporium herbarum m2, Aspergillus fumigatus m3, Candida albicans m5, Alternaria alternata m6) Insecte si paraziti Venin albina i1 Venin viespe i3 Polistes spp. (viespe de hartie) i4 Vespa crabro (viespe europeana) i75 Anisakis
Materiale dentare Alergeni profesionali Metil metacrilat (MMA) Alfa-amilaza (astmul brutarilor) 2-Hidroxietil metacrilat (HEMA) Diclofluanid TEG-DMA Formaldehida Bisfenol A Latex Metacrilat de 1,4 butandiol (BDMA) Lindan N,N-dimetil-4-toluidina Permetrin BIS-GMA Anhidrida acidului ftalic Dimetilacrilat cu rasina diuretanica Pentaclorfenol (PCP) Etilenglicol dimetilacrilat Tris-2-cloretil fosfat (TCEP) Endometazona Tris-2-butoxiletil fosfat (TBEP) Gutaperca BTX (benzen, toluen, xileni, etilbenzen) Camforchinona Clorpirifos PCB (Bifenili policlorurati) Amestec – PAK
Alac Carne de porc Crab Asbus de ou Carne de pui Crap Alfa-lactalbumina Carne de rata Creveti Alune Carne de vita Drojdie Ananas Cartof Fistic Arahide Cazeina Galbenus de ou Ardei Capsuni Gluten Avocado Ceai negru Grapefruit Beta-lactoglobulina Ceapa Grau Caracatita Ciocolata Halibut (cambula) Carne de curcan Cod Hamei Carne de gasca Conopida Homar Carne de oaie Coriandru Kiwi Lapte de vaca Orez Secara Langusta Orz Soia Lamaie Ovaz Somon Limba de mare Pastrav Spanac Mandarina Para Sparanghel Mazare Pelinita Stridii Mar Piersica Struguri Migdale Piper negru Susan Morcov Portocala Telini Nuca Porumb Tipar Nuca de Brazilia Rosie Usturoi Nuci cashew Scortisoara Vanilie Polen graminee Cynodon dactylon g2 (pir gros) Dactylis glomerata g3 (golomat) Lolium perenne g5 (iarba de gazon) Polen Phleum pratense g6 (timoftica) Secale cereale g12 (secara) Polen graminee amestec (Dactylis glomerata g3, Lolium perenne g5, Polen Phleum pratense g6, Festuca elatior g4, Poa pratensis g8, Holcus lanatus g13) Polen ierburi Polen Artemisia vulgaris w6 (pelin) Ambrosia elatior w1 Plantago lanceolata w9 (patlagina ingusta) Parietaria officinalis w19 (parachernita) Amestec ambrozie (Ambrosia elatior w1, Ambrosia psilostachya w2, Ambrosia trifida w3)
Alnus incana t2 (arin alb) Polen Betulla verrucosa t3 (mesteacan) Corylus avellana t4 (alun) Quercus alba t7 (stejar alb) Olea europaea (maslin) 2. Evidentierea pseudo-alergiilor la aditivi si coloranti alimentari - se testeaza 18 E-uri in 4 grupe sau, la cerere, in mod individual. 3. Evidentierea reactiilor pseudo-alergice la medicamente - pe langa alergenii standard pot fi testate si preparate native (tablete sau fiole trimise de medici/pacienti)3. Avantajele testului BDT -test de provocare in vitro cu relevanta clinica mare; -detecteaza IgE alergen-specifice legate de celule, precum si degranularea directa prin mecanisme non-IgE; -nu este influentat de eventuala prezenta a anticorpilor IgG alergen-specifici, care interfera cu determinarea de IgE specifice fata de anumite medicamente si alergeni alimentari; -pot fi folositi si alergeni nativi. Mentiune: performanta testului este similara cu cea a testului de activare a bazofilelor cu determinarea prin citrometrie in flux a markerului de degranulare CD633. Pregatire pacient – se va evita administrarea de inhibitori ai degranularii mastocitare cat si corticoterapia cu 2-3 saptamani inaintea recoltarii probei3. Specimen recoltat - sange venos3. Recipient de recoltare - vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant3. Volum proba – cate 2 mL sange pentru fiecare alergen3. Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei3. Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate3. Metoda Testul nostru constituie o dezvoltare a testului folosit anterior – CAST (Cellular Antigen Stimulation Test); imbunatatirea consta in concentrarea granulocitelor bazofile din proba inaintea adaugarii alergenului. Analiza presupune urmatoarele etape (vezi figura 17.4.2): 1. izolarea granulocitelor bazofile din sange recoltat pe EDTA; 2. stimularea cu extractele alergenice respective; 3. masurarea, in cazul sensibilizarii, a mediatorilor asociati histaminei (leucotriene). Dupa separarea prin centrifugare in gradient de densitate Ficoll, se adauga interleukina-3 (IL-3) care creste exprimarea de receptori pe suprafata bazofilelor si faciliteaza astfel eliberarea crescuta de mediatori. Pentru stimularea bazofilelor se pot folosi extracte de alergeni, alergeni recombinati sau alergeni nativi din preparatele furnizate de pacienti care nu prezinta toxicitate celulara. In plus fata de alergeni, bazofilele pacientului sunt incubate cu 2 controale: -anticorpi monoclonali anti-IgE umane (controlul pozitiv) care leaga anticorpii IgE de pe suprafata bazofilelor si activeaza eliberarea de mediatori; -o solutie tampon (controlul negativ) pentru estimarea eliberarii bazale spontane de mediatori. Dupa incubare celulele sunt centrifugate, iar leucotrienele eliberate in urma stimularii bazofilelor se cuantifica printr-o tehnica ELISA in supernatantul rezultat. Nivelul net de mediatori eliberati este calculat apoi prin scaderea cantitatii de leucotriene eliberate spontan din nivelul de mediatori indus de alergeni sau de controlul pozitiv. Rezultatul se exprima in pg/mL3;5.
fata de preparatele testate. 2. Rezultat pozitiv >200 pg/mL leucotriene dupa stimulare cu alergeni = sensibilizare de tip I sau pseudo-alergie. 3. Rezultat neconcludent Apare in situatia in care nu s-au obtinut criteriile de validare fie a controlului pozitiv (raspuns inadecvat <200 pg/mL leucotriene dupa stimulare cu anti-IgE), fie ale controlului negativ (nivel bazal crescut al eliberarii de mediatori). In conditiile in care recoltarea si transportul probei s-au efectuat in conditii adecvate, lipsa de validare a testului se poate datora: – tratamentului cu stabilizatori ai membranelor mastocitelor si bazofilelor; - unui nivel crescut al eliberarii spontane de mediatori ca urmare a unui proces alergic activ; – pacientul este un “non-releaser” (bazofilele nu raspund la stimulare – 10-15% dintre subiecti)3;5. 
Fig. 17.4.2 Etapele testului BDT
Bibliografie 1. Gϋlfem Elif Çelik, Werner J Pichler, N Franklin Adkinson. Drug Allergy. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 1215-1216. 2. Ioan Bradu Iamandescu. Alergia alimentara si digestiva. In Alergologie – Fiziopatologie, diagnostic, tratament, editura All, 1998, 519-525. 3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog. 4. Radhia Boumiza, Anne-Lise Debard, Guillaume Monneret. The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. In Clinical and Molecular Allergy, 2005, 3:9. 5. Robert G. Hamilton, N. Franklin Adkinson. In vitro assays for the diagnosis of IgE-mediated disorders. In Current Reviews of Allergy and Clinical Immunology, 2004. 6. Robert K Bush, Steve L Taylor. Adverse Reactions to Food and Drug Additives. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 1175-1185. Yüklə 103,95 Kb. Dostları ilə paylaş:
|