Avian influenza hastaliği acil eylem plani

EK-13: AVİAN İNFLUENZA VİRÜSÜNÜN İZOLASYON VE TANIMLAMA METOTLARI

Virüsün embriyolu tavuk yumurtasında izolasyonu: Berraklaştırılan süpernatant sıvı 0.1 – 0.2 ml miktarında 9-11 gün inkübe edilmiş en az beş adet embriyolu tavuk yumurtasının allantoik boşluğuna inoküle edilir. İdeali bu yumurtaların SPF sürüsünden temin edilmesidir, ya da en azından spesifik antikor negatif sürülerden olmalıdır. İnoküle edilen yumurtalar 37 ⁰C’de tutulur ve günlük olarak canlılık kontrolü yapılır. İnokülasyondan 7 gün sonra ölen ya da ölmekte olan embriyolar ve kalan tüm yumurtalar +4 ⁰C’de soğutulur ve amnio-allantoik sıvılar HA aktivitesi yönünden test edilirler. HA tespit edilen sıvılar bakteriyel kontaminasyon açısından kontrol edilirler. Herhangi bir bakteriyel kontaminasyon varlığında bu sıvılar 45 nm membran filtreden geçirilerek tekrar ilave antibiyotikler eklenir ve yukarıda belirtildiği şekilde embriyolu yumurtaya inoküle edilir. HA aktivitesi tespiti İnfluenza A virüsünün ya da bir avian paramikso virüsün yüksek ihtimalle varlığına işaret eder. Negatif reaksiyon veren sıvıların en az bir parti yumurtaya daha pasajlarının yapılması gerekir.

İnfluenza A virüsünün varlığı, influenza A virüsleri için ortak olan nükleokapsit ya da matriks antijenlerinin varlığı agar jel immünodifüzyon (AGID) testinde tespit edilmek suretiyle gösterilebilir. Enfektif amnio-allantoik sıvıdan virüsün konsantrasyonu ya da enfekte koriyo-allantoik membranlardan virüs ekstrakte edilerek antijen hazırlanabilir; hazırlanan antijenler bilinen pozitif anti serumlarla test edilirler.

Enfekte yumurtalardan alınan koriyo-allantoik membranlardan nükleokapsit yönünden zengin antijenlerin hazırlanması; Virüs enfektif allantoik sıvıdan ultra santrifüj yolu ile ya da asit ortam altında presipitasyon yolu ile konsantre edilebilir. Belirtilen ikinci metotta enfektif allantoik sıvıya yaklaşık pH 4.0 olana kadar 1.0 M HCl ilave edilir. Karışım 1 saat süre ile buz banyosuna konur, sonra + 4 ⁰C’de 1000 g’de santrifüj edilerek berraklaştırılır. Süpernatant sıvı atılır. Virüs konsantresi glisin - sarkosil tampon’da yeniden süspanse edilir: bunda 0.5 M glisin ile pH 9.0’a tamponlanan %1 (w/v) sodyum lauril sarkosinat bulunur. Bu konsantreler hem nükleokapsit hem de matriks polipeptitleri içerirler. Nükleokapsit yönünden zengin antijen preparatları AGID testinde kullanılmak üzere koriyo-allantoik membrandan da elde edilebilir.

Enfekte yumurtalardan alınan koriyo-allantoik membranlardan nükleokapsit yönünden zengin antijenlerin hazırlanması; Bu metot HA aktivitesine sahip allantoik sıvı içeren yumurtalardan koriyo-allantoik membranların çıkarılması ile ilgilidir. Membranlar daha sonra parçalanarak iyice homojenize edilir

Elde edilen homojenat, üç kez dondurulup çözdürüldükten sonra 1.000 g’de 10 dakika süre ile santrifüj edilir. Pelet atılır. Süpernatant %0.1 formalin ile muamele edildikten sonra antijen olarak kullanılır.

Bu iki antijenden birisi agar jel immuno difüzyon (AGID) testinde kullanılabilir.

EK-14: AVİAN İNFLUENZA VİRÜSÜNÜN PATOJENİTESİNİ DEĞERLENDİRME METOTLARI

HPAI teriminin anlamı virüsün virulent bir suşunun varlığına işaret eder. Bu terim göz yaşı akıntısı, solunum güçlüğü, sinüzitis, baş ve yüzde ödem, deride tüysüz bölgelerin siyanotik görünümü ve ishal gibi klinik belirtileri taşıyan tavuklara ait bir hastalığı tarif etmek için kullanılmaktadır. Tek belirti ani ölüm de olabilir. Bu işaretler konakçı ile ilgili kanatlının yaşı, diğer organizmaların varlığı ve çevre şartları gibi durumlara bağlı olarak çok büyük farklılıklar gösterebilmektedir. Ayrıca ortam şartları ile bakım ve besleme koşullarının kötü olması durumunda, sadece hafif klinik belirti oluşturan ya da hiç belirti oluşturmayan düşük patojeniteli virüsler de yüksek patojenik AI gibi gözlemlenebilir.

Bir AI virüsünün yüksek patojenik olarak sınıflandırılmasında esas alınan kriterler:

Virülens tayin metodu olarak intra venöz patojenite indeks (IVPI) testi kullanılmıştır. Hastalığı teyit etmek ve koruyucu önlemler alınmasını sağlamak amacı ile aşağıdaki tanımlar geçerlidir:

"6 haftalık tavuklarda IVPI’nin >1.2 olduğu bir influenza A virüsünün neden olduğu bir kanatlı enfeksiyonu veya hemaglütinin kırılma bölgesinde nükleotit sekansında çoklu temel amino asitlerin varlığının gösterildiği influenza A virüsleri H5 veya H7 alt tipleri ile enfeksiyondur ".
Intra Venöz Patojenite Indeks (IVPI) Testi

Titresi bilinmeyen virüs izolatı 1:10 oranında steril PBS ile sulandırılır.

Sulandırılmış virüs 0.1 ml miktarında 10 adet 6 haftalık yaşta SPF pilicin her birine intra venöz yolla enjekte edilir.

Kanatlılar 10 gün boyunca 24 saat aralıklarla muayene edilir.

Her bir gözlemde her bir kanatlı için normal (0), hasta (1), şiddetli hasta (2) ya da ölü (3) şeklinde derecelendirme yapılır (hasta ve şiddetli hasta kanatlılar subjektif klinik değerlendirme olup normalde "hasta" kanatlılar aşağıda sayılan klinik belirtilerden birini "şiddetli hasta" kanatlılar ise birden fazlasını sergileyen kanatlılar olarak sınıflandırılmalıdır: Solunum bozukluğu, depresyon, ishal, açıkta kalan deri kısımlarının ya da sakalın siyanozu, yüz ve/veya başta ödem, sinirsel belirtiler. Ölüm sonrası kalan her günlük gözlemde, ölü bireyler üç olarak değerlendirilmelidir).

IVPI, 10 günlük süre içinde her kanatlı için gözlem başına sayı (skor) ortalamasıdır. Indeksin 3.00 olmasının anlamı 24 saat içinde tüm tavukların öldüğünü, indeksin 0.00 olmasının anlamı ise 10 günlük gözlem süresi içinde hiçbir tavuğun klinik belirti göstermediğini belirtmesidir.

Plak Oluşturma Yeteneğinin Tayini

1. Pleyt üzerinde optimum sayıda plak varlığını sağlayacak virüs dilüsyon oranı kullanmak genellikle en iyi yoldur. PBS içinde 10^-6’ya kadar 10-katlı dilüsyonlar yeterlidir.

2. Beş cm çapında petri kaplarında civciv embryo hücrelerinden ya da uygun bir hücre hattından (örneğin Madin-Darby Sığır Böbreği-MDBK) konfluent monolayerler hazırlanır.

3. Her bir petri kabına her virüs dilüsyonundan 0.2 ml eklenir ve 30 dakika süre ile virüsün absorbsiyonu (emilmesi) sağlanır.

4. PBS ile üç kez yıkama sonrası enfekte hücreler %1 mg/ml tripsin içeren ya da hiç tripsin içermeyen %1 (w/v) agar içeren uygun vasat ile kaplanır. Kaplama vasatına serum ilave edilmemesine dikkat etmelidir.

5. 37 ⁰C’de 72 saat inkübasyondan sonra plakların yeterli büyüklüğe erişmesi beklenir. Bunlar en iyi şekilde agarın üst katmanının (kaplamasının) kaldırılması ve hücre monolayerin 25 v/v etanolde kristal violet (%0.5 v/v ) ile boyanması ile görülürler.

6. Kaplama içinde tripsinin varlığında inkübe edildiklerinde tüm AI virüsleri belirgin plaklar oluştururlar. Kaplama içinde tripsin bulunmaması durumunda yalnızca tavuklar için patojen olan AI virüsleri plak oluştururlar.
1.Ön Teşhis

Virüsün yayılmasını sınırlamaya yönelik kontrol tedbirlerinin en kısa zamanda alınmasının öneminden dolayı her bölgesel laboratuvarın izole edilen hemaglütinasyon oluşturan bütün virüsleri Newcastle virüsüne ek olarak influenza virüsleri H5 ya da H7 alt tipi olarak tanımlayabilecek konumda olması gerekmektedir. HI testinde kullanılacak hemaglütinasyon sıvıları şu tarife uygun olarak kullanılmalıdır.

HA testinde 2⁴ (1:16) titreye sahip , ya da influenza A H5 veya H7 alt tipleri için spesifik poliklonal antiserum ile HI testinde en az 2⁹’luk ve daha yüksek pozitif inhibisyon titresi ara kontrol tedbirlerinin yürürlüğe konması için ön tanımlama olarak değerlendirilebilir.
2. Doğrulayıcı Teşhis

İnfluenza virüslerinin 16 hemaglütinin ve 9 nöraminidaz alt tipinin bulunmasından ve bunların her biri arasında da varyasyonların olabilmesinden dolayı her bölge laboratuvarında influenza izolatlarının tam antijenik karakterizasyonunu sağlayacak antiserumların bulundurulması hem pratik hem de ekonomik değildir, bununla birlikte her bölge laboratuvarı şu işlemleri yapabilmelidir:

1. 
   Tarif edildiği şekilde grup antijenlerinin arandığı agar jel immunodiffüzyon testi kullanarak bir izolatın influenza A virüsü olduğunu teyit edebilmelidir (bölge laboratuvarları eğer tercih ederlerse grup antijenlerinin aranmasına yönelik immünofloresan ya da ELISA tekniklerini kullanabilirler);
   

2. 
   İzolatın H5 ya da H7 alt tipi olup olmadığını tayin edebilmelidir;
   

3. 
   Tavuklarda intravenöz patojenite indeks testinin yapılabilmesi için özel izolatörlere ve BSL-3 güvenlik seviyesinde laboratuvarlara ihtiyaç vardır. Dolayısıyla bu test URL ve diğer BSL-3 güvenlik laboratuvarlarına sahip UL’ lar tarafından yapılır. 1.2’den daha yüksek intravenöz patojenite indeksi virüsün varlığına işaret eder ve kontrol tedbirlerinin eksiksiz olarak uygulanmasını gerektirir. (BSL-3 güvenlik seviyeli ulusal laboratuvarlarda, tarif edildiği gibi ayrıca, bir izolatın kültürlerde plak oluşturma kapasitesini tayin eden testlerin yapılması yararlı bir uygulama olabilir.)
   

Bölgesel laboratuvarlar bütün AI ve H5 ve H7 izolatlarını, özelliklerinin tam tespiti için en kısa zamanda URL’ye göndermelidirler.

3. İzolatların Tip ve Özellikleriyle İlgili Daha İleri Tespit

URL, bölgesel laboratuvarlardan aldığı bütün hemaglütinasyon özellikli virüsları daha ileri antijenik ve genetik çalışmalara tabi tutar, ve hastalığın ya da hastalıkların epizootiyolojisinin daha ayrıntılı olarak anlaşabilmesi için çalışır ve bunları teyit amacıyla AB/FAO/OIE AI Referans Laboratuvarlarından birisine gönderir.

Bu çalışmalara ek olarak URL kendisine gelen tüm influenza virüslarının tam antijenik tip çalışmasını yapacaktır. URL ayrıca 1.2’den daha yüksek intravenöz patojenite indeksine sahip olmayan H5 ve H7 virüsleri için, hemaglütinin proteini için kırılma bölgesinde çoklu temel amino asitlerin bulunup bulunmadığının ortaya konması için hemaglütinin geninin nükleotid sekansının çıkarılmasını da yapmalıdır.

Nonpatojenik Virüslerle Oluşan Enfeksiyonlar

Enfekte kanatlılarda klinik belirtiler görülmemekle birlikte bunlar genetik değişim gösterebilirler. Bu virüslerden bazılarının genom mutasyonu yolu ile virulent hale gelme potansiyelleri bulunmaktadır.

Düşük veya Orta Derecede Patojenik Virüslerle Enfeksiyon

Tavuk ya da hindilerde klinik belirtiler tespit edilemeyenden orta ya da şiddetli dereceye ve şiddetli solunum hastalığına kadar değişen özellikte olabilir ve enfeksiyöz laringotrakeitis ve diğer solunum yolu enfeksiyonları ile karıştırılabilir.

Mortalite oranları kafes yumurtacılarında %3’ten et tavuklarında % 15’e kadar değişebilir. Yumurtacılarda yumurta verimi % 45 azalabilir ve normal düzeye 2-4 haftada dönülebilir. Salgınlarda mutasyon yoluyla virülens gösterilmiştir.
Yüksek Patojenik Virüsler ile Enfeksiyon

Tavuk ve hindilerdeki belirtiler şiddetli solunum belirtileri, aşırı sulu gözler, sinüzitis, ibik, sakal ve bacakların siyanozu, başta ödem, tüylerin kabarması, ishal ve sinirsel belirtiler.

Hastalığın başlamasından sonraki son yumurtalar genellikle kabuksuzdur.

Ani ölümlerin (perakut) meydana geldiği akut olaylarda klinik belirtiler dikkati çekmeyebilir ve ölümler hastalığın ilk belirtilerinden 24 saat sonra görülmeye başlar, genellikle de 48 saat içinde ölümler görülür. Diğer olaylarda daha değişken belirtiler görülür ve ölümler bir hafta kadar gecikebilir. Perakut ve akut olaylarda mortalite oranlarının hemen hemen %100’e ulaştığı bildirilmiştir.

Şiddetli derecede etkilenmiş bazı tavuklar iyileşebilir, fakat çok nadir olarak tekrar yumurtlayabilirler.

Hindilerde hastalık tavuklardakine benzer. Ancak genellikle tavuk kolerası, hindi korizası ve kolibasillozis gibi ikincil enfeksiyonlarla komplike olur.