FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
B.1 bis AKUT ORAL TOKSİSİTE- SABİTLENMİŞ DOZ İŞLEMİ
Yüklə 5,29 Mb.
|
B.1 bis AKUT ORAL TOKSİSİTE- SABİTLENMİŞ DOZ İŞLEMİ
Bu yöntem OECD TG 420 (2001) ile eşdeğerdir.
Geleneksel yöntemler, akut toksisite değerlendirilmesinde hayvan ölümlerini en son nokta olarak kullanır. 1984’te akut toksisite testleriyle ilgili seri olarak sabit doz uygulamasına dayanan yeni bir yaklaşım İngiliz Toksikoloji Derneği tarafından önerilmiştir(1). Yaklaşımda, hayvan ölümlerinin en son nokta olarak kullanımından kaçınılmıştır ve bunun yerine sabitlenmiş doz serilerinden, birinde gözlenen toksisite belirtilerine dayandırılmıştır. İngiltere (UK) (2) ve uluslararası (3) in vivo validasyon çalışmalarını takiben işlem 1992 yılında test yöntemi haline getirilmiştir. Bunu takiben, Sabitlenmiş Doz İşleminin istatiksel özellikleri, matematiksel modellerin kullanıldığı bir dizi çalışmayla değerlendirilmektedir (4)(5)(6). Diğer geleneksel yöntemlere kıyasla, prosedürün tekrarlanabilir olduğunu, daha az hayvan kullanıldığı ve daha az hayvanın kurban edilmesine sebep olduğu gösterilen, in vivo ve modelleme çalışmaları beraberce maddeleri, diğer toksisite test yöntemleri ile benzer şekilde sınıflandırabilmektedir. Belirtilen bir amaç için en uygun test yöntemi Akut Oral toksisite Testi Kılavuz Dokümanlarına (7) bakılararak bulunabilir. Bu Doküman ayrıca B.1bis’teki Test Yöntemlerinin yürütülmesi ve yorumlanmalarına ilişkin ilave bilgiler de içermektedir. Asıl çalışmada sadece orta derecede toksik dozların kullanılması test yönteminin temelini oluşturur ve öldürücü olması beklenen dozların uygulanmasından kaçınılmalıdır. Ayrıca, aşındırıcı ve ciddi tahriş edici etkiye bağlı olarak acı ve ağrı verdiği bilinen maddelerin uygulanmasına gerek yoktur. Ölmek üzere olan veya açıkça acı çeken veya bunun ciddi belirtilerini gösteren hayvanlar insani şekilde öldürülebilir ve bunlar test sonuçlarının yorumlanmasında dikkate alınarak, testte ölen hayvanlarla aynı şekilde değerlendirilir. Ölmek üzere olan veya ciddi anlamda acı çeken hayvanların öldürülmesine karar verme kriterleri ve beklenen veya yaklaşan ölümlerin teşhis edilmesi ile ilgili yönlendirme, ayrı bir kılavuz dokümanın konusudur (8). Yöntem, zararlı özellikler hakkında bilgi verir ve maddenin akut toksisiteye neden olan kimyasalların sınıflandırılmasını sağlayan Küresel Uyumlaştırılmış Sistem’e (Globally Harmonised System, GHS) göre sınıflandırılmasına olanak sağlar (9). Test uygulama laboratuvarı çalışmaya başlamadan önce, test maddesiyle ilgili ulaşılabilecek tüm bilgiyi göz önünde bulundurmalıdır. Böyle bir bilgi, maddenin kimyasal yapısını, kimliğini, fizikokimyasal özelliklerini, maddeyle ilgili önceden yapılmış in vitro veya in vivo toksisite testlerini, yapısal olarak ilişkili maddelere ait toksikolojik verileri ve maddenin istenmeyen kullanımını/kullanımlarını kapsayacaktır. Bu bilgi, testin insan sağlığını korumak için uygulandığı ve uygun başlangıç dozunun seçilmesine yardımcı olacağını konusunda tatmin olmak için gereklidir.
Akut oral toksisite: Bir maddenin ağız yoluyla 24 saat içinde tek veya çoklu dozlar halinde verildiğinde ortaya çıkan olumsuz etkilerine işaret eder. Gecikmiş ölüm: Hayvan 48 saat içinde ölmez veya ölmeye yakınmış gibi görünmez fakat 14-günlük gözlem süresinden sonra ölürse, gecikmiş ölüm anlamına gelir. Doz:Uygulanan test maddesinin miktarıdır. Doz, test hayvanının birim ağırlığı başına düşen test maddesinin ağırlığı (örneğin, mg/kg) olarak ifade edilir. Belirgin toksisite: Test maddesinin uygulanmasından sonra görülen açık toksisite belirtileri için (örnekler için bakınız (3)) kullanılan genel terimdir, öyle ki en yüksek sabitlenmiş dozda çoğu hayvanda ya ciddi ağrı ve devam eden ciddi acı çekme belirtileri, ölmeye yakın olma durumu (kriterler İnsancıl Sınır Noktalar Kılavuzunda (Humane Endpoints Guidance) sunulmuştur (8)), ya da olası ölüm beklenebilir. GHS (Globally Harmonised System): Kimyasal Maddeler ve Karışımlar için Küresel Uyumlaştırılmış Sınıflandırma Sistemi OECD’nin (insan sağlığı ve çevre), BM Tehlikeli Malların Taşınmasıyla ilgili Uzman Komitesi (fiziko-kimyasal özellikler) ve ILO (zarar iletişimi) ve Kimyasalların Güvenli İdaresi için Kuruluşlararası Programı (IOMC) ile birlikte yürüttüğü birleştirilmiş müşterek bir aktivitedir. Yaklaşan ölüm: Planlanan bir sonraki gözlem zamanından önce beklenen ölüm veya ölüme yakın durum. Bu durumun kemirgenlerdeki belirtileri arasında çırpınma, yanal pozisyon sırt üstü yatma ve titreme vardır (Daha fazla ayrıntı için İnsancıl Sınır Noktalar Dokümanına (Humane Endpoints Guidance) bakınız(8)). LD50 (ortalama öldürücü doz): Oral yolla uygulandığında hayvanların %50’sinin ölümüne neden olması beklenen, maddenin istatiksel olarak türetilen tek dozu. LD50 değeri test hayvanının birim ağırlığı başına düşen test maddesinin ağırlığı olarak ifade edilir (mg/kg). Sınır doz: Test uygulamalarında en üst sınırdaki doza (2000 veya 5000 mg/kg) karşılık gelir. Ölmek üzere olma (Moribund) durumu: Ölme durumunda olma veya tedavi edilse de yaşama kabiliyetinin olmaması durumu (Daha fazla ayrıntı için İnsancıl Sınır Noktalar Dokümanına (Humane Endpoints Guidance) bakınız(8)). Tahmini ölüm: Deneyin planlanan sonlandırma zamanından önceki, gelecekte bilinen bir zamanda ölüme dair klinik belirtilerin mevcut olması, örneğin: yiyecek ve su alamama durumu (Daha fazla detay İnsancıl Sonlanma Noktaları Dokümanına (Humane Endpoints Guidance)bakınız (8)).
Tek bir cinsiyetten oluşan hayvan gruplarına işlem, adım adım izlenerek 5, 50, 300 ve 2000 mg/kg sabitlenmiş dozlar kullanılarak (istisnai olarak 5000 mg/kg’lık ilave bir sabit doz düşünülebilir, bakınız bölüm 1.6.2) doz uygulanır. Başlagıç dozu seviyesi, dozun ciddi toksik etkilere ve ölüme neden olmadan bazı toksisite belirtileri oluşturması beklendiğinden, gözlem çalışmasına göre seçilir. Klinik belirtiler ve ağrı, acı ve olması yakın ölümle ilgili koşullar ayrı bir OECD Yönergesinde (8) detaylı olarak tanımlanır. Sonraki gruplara, toksisite belirtileri veya ölümün görülüp görülmediğine bağlı olarak, daha yüksek veya daha düşük dozlar uygulanabilir. Bu işlem doz belirgin toksik etkiye neden oluncaya kadar veya ilk ölüm görülünceye kadar veya en yüksek dozda hiçbir etki görülmediği sürece veya en düşük dozda ölüm meydana gelinceye kadar devam eder.
Tercih edilen kemirgen türü sıçandır, ancak diğer kemirgen türleri de kullanılabilir. Normalde dişiler kullanılır (7). Geleneksel LD50 testleriyle ilgili literatürler, cinsiyetler arasında duyarlılıkları bakımından çok az farklılık olduğunu göstermiştir fakat farklılıkların gözlendiği durumlarda dişiler çok az da olsa daha duyarlıdırlar (10). Ancak, eğer yapısal olarak ilgili kimyasalların toksik ve toksikokinetik özelliklerine ait bilgiler, erkeklerin dişilerden daha duyarlı olduğunu gösterirse, böyle durumlarda erkekler kullanılmalıdır. Çalışma erkeklerle yürütülürse, gerekçe gösterilmelidir. Yaygın olarak kullanılan laboratuvar suşlarının genç, yetişkin ve sağlıklı olanları kullanılmalıdır. Dişilerin doğum yapmamış olmaları ve hamile olmamaları gerekir. Doz uygulamasının başlangıcında her bir hayvan 8-12 haftalık arasında olmalı ve ağırlıklar, daha önceden doz verilen hayvanların ortalama ağırlıklarının ± 20 %’sini geçmemelidir.
Deney hayvanları için oda sıcaklığı 22°C (± 3°C) olmalıdır. Ayrıca, bağıl nem oranının en az %30 olması ve tercihen %70’i geçmemesi gerekmesine rağmen, odanın temizlenmesi sırası dışında, nem olarak hedef % 50-60 olmalıdır. Yapay ışık sistemi kullanılmalı, 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık şeklinde olmalıdır. Beslenme için sınırsız içme suyu tüketimiyle beraber geleneksel laboratuvar yiyecekleri kullanılabilir. Hayvanlar dozlara göre gruplandırılıp kafeslere konabilirler ancak kafes başına düşen hayvan sayısı hayvanların net bir şekilde gözlenebilmesini etkilememelidir.
Hayvanlar rastgele seçilirler, ayrı ayrı kimliklendirilmeleri için işaretlenirler ve deneyden en az beş gün öncesinden itibaren, deneysel barınma ve besleme koşullarında laboratuar ortamına alışmaları için, deney kafeslerinde muhafaza edilirler
Test maddeleri genellikle sabit hacimde, test edilecek doz aralığında yer alan çeşitli konsantrasyonlardaki dozlarda uygulanmalıdır. Sıvı bir son ürün veya karışım test edilirken, seyreltilmemiş test maddesinin kullanılması ör. sabit bir konsantrasyon, sonrasında o maddenin risk değerlendirmesiyle daha ilgili olabilir ve bu bazı düzenleyici yetkili makamların ortaya koyduğu bir gerekliliktir. Her durumda da uygulama için maksimum doz hacmi aşılmamalıdır. Sıvının tek seferde uygulanabilecek maksimum sıvı hacmi test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. Kemirgenlerde hacim normalde 1ml/100g vücut ağırlığını geçmemelidir ancak sulu çözeltilerde 2ml/100g vücut ağırlığı düşünülebilir. Uygun olan her yerde dozun hazırlanma formülasyonuna bağlı olarak sulu çözeltinin/ süspansiyonun/ emülsiyonun kullanılması tavsiye edilir, bunu tercih edilme sırasına göre yağda (örneğin, mısır yağı) çözeltinin/süspansiyonun/emülsiyonun kullanımı ve diğer taşıyıcılardaki mümkün çözelti kullanımı izler. Su dışındaki taşıyıcıların toksik özellikleri bilinmelidir. Kullanılacağı süre boyunca, kararlılığı bilinmedikçe ve kabul edilebilir olmadıkça, dozlar, uygulamadan kısa bir süre önce hazırlanmalıdır.
Test maddesi tek doz olarak gavaj yöntemi kullanılarak sonda ile veya uygun bir boşaltım tüpü kullanılarak uygulanır. Tek dozun mümkün olmadığı olağandışı durumlarda, daha küçük parçalar halinde, 24 saati geçmeyen aralıklarla verilmelidir. Hayvanlar doz uygulanmadan önce aç bırakılmalıdır (ör. sıçanda, gece boyunca su verilebilir fakat yiyecek verilmemelidir; farede de, 3-4 saat için su verilebilir fakat yiyecek verilmemelidir). Aç bırakılma süresini takiben hayvanlar tartılmalı ve test maddesi uygulanmalıdır. Madde uygulandıktan sonra, sıçanlara 3-4 saat, farelere 1-2 saat yiyecek verilmeyebilir. Doz, bir sürenin üzerinde parça parça uygulandığında bu sürenin uzunluğuna bağlı olarak hayvanlara yiyecek ve su sağlanması gerekebilir.
Gözlem çalışmasının amacı asıl çalışma için uygun başlangıç dozlarının seçilmesidir. Test maddesi hayvanlara sıralı şekilde Ek-I’deki akış şeması izlenerek uygulanır. Gözlem çalışması, asıl çalışma için başlangıç dozuna karar verildikten sonra (veya en düşük sabit dozda ölüm görüldüğünde) bitirilir. Gözlem çalışması için başlangıç dozu 5, 50, 300 ve 2000 mg/ kg’lık sabit doz seviyeleri arasından, aynı kimyasal ve yapısal olarak ilişkili kimyasalların in vivo(canlı dokularda) veinvitro(yapay bir ortamdaki) çalışmalardan elde edilen verilere dayanan belirgin toksik etki oluşturması beklenen doz olarak seçilir. Böyle bir bilginin olmadığı durumda başlangıç dozu 300 mg/kg olacaktır. Her hayvana doz uygulamaları arasında en az 24 saatlik bir süre ara verilmelidir. Bütün hayvanlar en az 14 gün gözlenmelidir. İstisnai olarak ve sadece özel düzenleyici gerekliliklerle mazur gösterildiği zaman, 5000 mg/kg’lık ilave daha yüksek sabit doz düzeyininin kullanılması düşünülebilir (bakınız Ek-III). Hayvan refahıyla ilgili kaygılar nedeniyle hayvanları GHS Kategori 5 aralığında (2000-5000 mg/kg ) teste tabi tutmak uygun bulunmamıştır ve sadece böyle bir testin sonuçlarının hayvan ve insan sağlığını ve çevreyi korumakla doğrudan ilintili olduğuna dair kuvvetli bir olasılık varsa kullanımı düşünülmelidir Gözlem çalışmasında en düşük sabit doz ile (5mg/kg) test edilen bir hayvanın öldüğü durumlarda, normal işlem çalışmayı bitirmek ve maddeyi GSH Kategori 1’e koymaktır (Ek-I’de gösteridiği gibi). Ne var ki, eğer sınıflandırma için daha fazla onay gerekirse, akabinde zorunlu olmayan tamamlayıcı bir prosedür yürütülebilir. İkinci bir hayvana 5mg/kg doz uygulanır. Eğer ikinci hayvan ölürse, sonrasında GHS Kategori 1 onaylanacak ve çalışmaya hemen son verilecektir. Eğer ikinci hayvan yaşarsa, en fazla üç ilave hayvana 5mg/kg’lık doz uygulanacaktır. Çünkü yüksek riskte ölüm söz konusu olacağından bu hayvanlara hayvan refahının korunması açısından sıralı şekilde doz uygulanmalıdır. Her hayvanın doz uygulamaları arasındaki zaman aralığı, bir önceki hayvanın sağ kalmasını sağlayacak yeterlilikte olmalıdır. İkinci bir ölüm görülürse, doz dizisine hemen son verilmeli ve daha fazla hayvana doz uygulanmamalıdır. Çünkü ikinci ölümün görülmesi (sonlandırmada test edilen hayvanların sayısından bağımsız) sonuç A’ya karşılık gelir (2 veya daha fazla ölüm), Ek-II’deki 5mg/kg sabit dozda sınıflandırma kuralı (eğer 2 veya daha fazla ölüm varsa Kategori 1; 1’den fazla ölüm yoksa Kategori 2’dir) takip edilir. İlaveten, Ek-IV, yeni GHS tamamlanıncaya kadar Avrupa Birliği (AB) sistemindeki sınıflandırma hakkında rehberi içerir.
Başlangıç dozu test uygulanmasını takiben yapılacaklar,Ek-II’deki akış şemasında gösterilmiştir. Testi durdurmak ve uygun tehlike sınıfına yerleştirmek ya da daha yüksek bir sabit dozda veya daha düşük bir sabit dozda test etmek şeklindeki üç faaliyetten birini yapmak gerekecektir. Ancak, hayvanları korumak için gözlem çalışmasında ölüme neden olan doz asıl çalışmada tekrar uygulanmaz (bakınız Ek-II). Tecrübeler göstermiştir ki başlangıç dozundaki en olası sonuç, maddenin sınıflandırılabileceği ve ilave testlere ihtiyaç duyulmayacağıdır. Araştırılacak her bir doz için normalde tek cinsiyetten beş hayvan kullanılacaktır. Bu beş hayvan, biri gözlem çalışmasında seçilen dozun uygulandığı hayvan olmak üzere ilave dört hayvandan oluşturulur (olağandışı olarak, asıl çalışmada kullanılan bir dozun gözlem çalışmasında yer almadığı durumlar haricinde). Her seviyedeki doz uygulamaları arasındaki zaman aralığı toksik etki belirtilerinin başlangıcı, süresi ve ciddiyeti göz önüne alınarak belirlenir. Önceden doz uygulanan bir hayvanın sağ kaldığından emin olununcaya kadar hayvanların bir sonraki dozla muamele edilmeleri ertelenmelidir. Eğer gerekirse, gecikmiş toksik etki gözlenmesine olanak sağlamak için, her bir dozda, doz uygulamaları arasında 3–4 gün süre olması tavsiye edilir. Zaman aralığı, örneğin bir sonuca varılamayan cevapların olduğu durumlarda, uygun şekilde ayarlanabilir. Üst sabit doz olarak 5000 mg/kg’ın kullanılması düşünüldüğünde, Ek-III’te belirtilen süreç takip edilmelidir. (ayrıca bakınız bölüm 1.6.2).
Sınır testi öncelikle deneyi yapan kişinin, test maddesinin toksik olmadığını gösteren bilgilere sahip olduğu ör. Sadece düzenleyici sınır dozlarının üzerinde toksik etki olduğuna dair, bilgiye sahip olduğu durumlarda yapılır. Test maddesinin toksisitesi ile ilgili bilgi test edilen benzer bileşikler veya benzer karışımlar veya ürünler hakkındaki bilgilerden, toksikolojik bakımından önemi olan bileşenin yüzdesi ve tanımı dikkate alınarak elde edilir. Toksisiteyle ilgili herhangi bir bilginin olmadığı veya test maddesinin toksik olmasının beklendiği durumlarda asıl test yapılmalıdır. Normal süreç kullanılarak, 2000 mg/kg (veya istisnai olarak 5000 mg/ kg) gözlem çalışması başlangıç dozunu takiben ilave dört hayvana bu seviyede doz uygulanması bu doküman için bir sınır testidir.
Hayvanlar doz uygulandıktan sonra ilk 30 dakika boyunca en az bir defa, ilk 4 saatte daha dikkatlice olmak üzere ilk 24 saat içinde düzenli olarak ve bundan sonra 14 gün boyunca her gün bireysel olarak gözlemlenir. Hayvanlar, çalışmadan çıkartılmaları ve insancıl olarak öldürülmeleri gerektiğinde veya ölü bulundukları zaman bu uygulamaya devam edilmez. Ancak gözlem süreleri asla değişmeyecek şekilde sabit olmamalıdır. Bu süre toksik reaksiyonlarla, bu reaksiyonların başlangıç zamanlarıyla ve iyileşme süresinin uzunluğuyla belirlenmelidir, bu yüzden de gerekli olduğu düşünüldüğünde bu süre uzatılabilmelidir. Toksisite belirtilerinin ortaya çıktığı ve kaybolduğu zamanlarla, ölüm zamanları ve özellikle de ölümlerin geç gerçekleşmesi eğilimi varsa önemlidir (11). Her bir hayvan için ayrı ayrı elde edilen verilerle birlikte tüm gözlemler sistematik olarak kaydedilmelidir. Eğer hayvanlar toksisite belirtileri göstermeye devam ederse ilave gözlemler yapılması gerekecektir. Gözlemler ciltteki, kürkteki, gözlerdeki, mukoz membranlardaki değişikliklerle, solunum, dolaşım, otonomik ve merkezi sinir sistemindeki, somatomotor aktivite ve davranış değişikliklerini kapsamalıdır. Titreme, çırpınma, tükürük salgılanması, ishal, uyuşukluk, uyku ve koma ile ilgili gözlemlere özellikle dikkat edilmelidir. İnsancıl Sonlanma noktaları Dokümanında özetlenen (8) ilkeler ve kriterler dikkate alınmalıdır. Ölmek üzere olan, acı ve ağrı çeken hayvanlar insani şekilde öldürülmelidir. Hayvanlar insani nedenlerle öldürüldüğünde veya ölü bulunduklarında ölüm zamanları olabildiğince hassas şekilde kaydedilmelidir.
Bütün hayvanların ağırlıkları ayrı ayrı, madde uygulanmadan kısa bir süre önce ve sonnrasında da en azından haftalık olarak tayin edilmelidir. Ağırlık değişiklikleri hesaplanmalı ve kaydedilmelidir. Test sonunda sağ kalan hayvanlar da tartılır ve insani şekilde öldürülürler.
Tüm test hayvanlarına (test sırasında ölenler veya hayvan refahı nedeniyle testten uzaklaştırılan hayvanlarda dâhildir) tam teşekküllü otopsi yapılmalıdır. Her bir hayvan için bütün büyük çaplı patolojik değişiklikler kaydedilmelidir. İlk dozun uygulanmasınden sonra 24 saat ya da daha fazla sağ kalan hayvanlarda, organların mikroskobik incelemeleri büyük çapta patoloji kanıtı gösteriyorsa, bu incelemeler yararlı bilgiler sunabilirler.
Veriler her bir hayvan için ayrı ayrı sağlanmalıdır. Ayrıca, veriler, her bir test grubu için kullanılan hayvan sayısını, toksisite belirtileri gösteren hayvanların sayısını, test sırasında ölü bulunan veya insani nedenlerle öldürülen hayvan sayısını, hayvanlar için ayrı ayrı ölüm zamanlarını, toksik etkilerin tanımı, tersinir olup olmadığı ve otopsi bulgularını gösterecek şekilde tablo halinde özetlenmelidir.
Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir: Test maddesi:
Taşıyıcı, (eğer uygunsa):
Test hayvanları:
Test koşulları:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması ve yorumlanması Yorumlar.
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. (2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol.‚ 6, 279-291. (3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482. (4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. (5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol. (6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183 -196. (7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris (8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. (9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,ENdocuments-521-14-no-24-no-0,FF.html]. (10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. (11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology . 3 rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA. Ek-I Gözlem Çalışması İçin Akış Şeması  Ek-II Ana Çalışma İçin Akış Şeması  Yüklə 5,29 Mb. Dostları ilə paylaş:
|
