FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

VERİLER

1. 
   Sonuçların uygulanması
   

Veriler, plaka başına başlangıçtaki hallerine dönen koloni sayısı olarak sunulmalıdır. Hem negatif (kullanıldıysa çözücü kontrol ve muamele edilmemiş kontrol) hem de pozitif kontrol plakalarındaki başlangıçtaki hallerine dönen koloni sayısı da ayrıca verilmelidir. Ayrı ayrı plaka sayımları, plaka başına ortalama başlangıçtaki hallerine dönen koloni sayısı ve standart sapma, test maddesi ve pozitif ve negatif (muamele edilmemiş ve/veya çözücü) kontroller için sunulmalıdır.

Net bir pozitif cevabın doğrulanmasına gerek yoktur. Şüpheli sonuçların, tercihen deneysel koşulların yeniden düzenlenmesi yoluyla, ilave testlerle netleştirilmesi gereklidir. Negatif sonuçların ayrı ayrı doğrulanması gerekir. Negatif sonuçların doğrulanmasının yeterli olmadığının düşünüldüğü durumlarda gerekçe sağlanmalıdır. Koşulların aralığını genişletmek için çalışma parametrelerinin değişikliğine dair değerlendirilmeler takip edilen deneylerde göz önünde bulundurulmalıdır. Değişiklik yapılabilecek çalışma parametrelerine konsantrasyon aralıklandırılması, muamele yöntemleri (plaka katılımı veya sıvı ön inkübasyonu) ve metabolik aktivasyon koşulları dahil edilebilir.

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Pozitif sonuç tayin etmek için, test edilen aralığın üzerinde konsantrasyona bağlı artış ve/veya bir ırkta veya metabolik aktivasyon sistemi olmadan plaka başına düşen başlangıçtaki hallerine dönen koloni sayısındaki bir veya daha fazla konsantrasyondaki tekrarlanabilir artış gibi bazı kriterler vardır (23) Sonuçlar ilk önce biyolojik açıdan değerlendirilmelidir. İstatistiksel yöntemler, test sonuçlarını değerlendirirken yardımcı olarak kullanılabilir (24). Ancak istatistiksel belirlilik pozitif bir cevap için tek belirleyici etken olmamalıdır.

Yukarıdaki kriterlere uymayan bir test maddesinin, bu testte mutajenik olmadığı düşünülür.
Her ne kadar pek çok deney pozitif ve negatif sonuçları açıkça verecekse de, nadir durumlarda veri kümeleri test maddesinin aktivitesi hakkında net bir karara varılmasına engel olacaktır. Sonuçlar, uygulanan deneylerin sayısından bağımsız olarak belirsiz veya şüpheli olabilir.
Bakteriyel ters mutasyon testinden elde edilen pozitif sonuçlar, maddenin, baz yer değiştirmeleri veya yapı kaymalarıyla Salmonella typhimurium ve/veya Escherichia coli genomundaki nokta mutasyonlara neden olduğunu gösterir.
Test koşullarındaki negatif sonuçlar, test maddesinin test edilen türde mutajenik olmadığını gösterir.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir:

Çözücü/Taşıyıcı

• 
  çözücü/taşıyıcı seçimi için gerekçe;
  
• 
  biliniyorsa, test maddesinin çözücü/taşıyıcı içindeki çözünürlüğü ve kararlılığı;
  

Suşlar:

• 
  kullanılan suşlar
  
• 
  kültür başına düşen hücre sayısı
  
• 
  suşların karakteristikleri
  

Test koşulları :

• 
  doz seçiminin gerekçesi ve konsantrasyon başına düşen plaka sayısıyla birlikte plaka başına düşen test maddesi (mg/plaka veya μl/plaka)
  
• 
  kullanılan ortam
  
• 
  kabul edilebilirlik kriteri dahil, metabolik aktivasyon sisteminin türü ve kompozisyonu;
  
• 
  muamele prosedürleri
  

Sonuçlar:

• 
  toksisite belirtileri,
  
• 
  çökelti belirtileri;
  
• 
  ayrı ayrı plaka sayımları
  
• 
  plaka başına düşen başlangıç hallerine dönen kolonilerin ortalama sayısı ve standart sapma;
  
• 
  mümkün yerlerde, doz-cevap ilişkisi;
  
• 
  varsa, istatistiksel analizler
  
• 
  eş zamanlı negatif (çözücü/taşıyıcı) ve pozitif kontrol verileri, aralıkları, ortalamaları ve standart sapmalarıyla birlikte;
  
• 
  geçmişe yönelik negatif (çözücü/taşıyıcı) ve pozitif kontrol verileri, aralıkları, ortalamaları ve standart sapmalarıyla birlikte;
  

Sonuçların tartışılması.

Sonuçlar.

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
   
2. 
   Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215.
   
3. 
   Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, 217-233.
   
4. 
   Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, 69-240.
   
5. 
   Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 91-96.
   
6. 
   Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. pp. 273-285.
   
7. 
   Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61.
   
8. 
   Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, 167-177.
   
9. 
   Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, 33-42.
   
10. 
    Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984). The Fluctuation Test in Bakteri. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. And Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.
    
11. 
    Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, 453-465.
    
12. 
    Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994). Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, 335-344.
    
13. 
    Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, 33-47.
    
14. 
    Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, 2-141.
    
15. 
    Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258.
    
16. 
    Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. (1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, 421-441.
    
17. 
    Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonellatyphimurium. Cancer Res., 39, 3780-3782.
    
18. 
    Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4961-4965.
    
19. 
    Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. (1990). Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, 285-291.
    
20. 
    Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: “In Vitro metabolic Activation in Mutagenesis Testing” Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
    
21. 
    Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175-177.
    
22. 
    Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88 343-350.
    
23. 
    Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bakteriyal Mutagenicity. Mutation Res. 189, 83- 91.
    
24. 
    Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, pp. 28-65.
    

B.15 MUTAJENİTE TESTİ VE KANSEROJENİTENİN İZLENMESİ

GEN MUTASYONU-SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

3. 
   Referans maddeler
   

Yok

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Metabolik aktivasyona sahip veya sahip olmayan kimyasal ajanlarla uyarılan genlerde oluşan mutasyonları ölçmek için Saccharomyces cerevisiae mayasının çeşitli tek kromozom setine sahip (haploid) ve yarısı anneden yarısı babadan gelmek üzere, türe has kromozom sayısı gösteren (diploid) hücre suşları kullanılabilir.

Kırmızı ve adenine ihtiyaç duyan mutantların (ade-1, ade-2) çifte adenine ihtiyaç duyan beyaz mutantlara mutasyonunun ölçülmesi ve canavnaine ve siklohekzamide dayanıklıklık gelişmesi gibi haploid suşlardaki ileri mutasyon sistemleri kullanılmaktadır.
Geçerli en yaygın ters mutasyon sistemi bölgeye özgü mutasyonları veya aşı boyası baskılayıcı mutasyonları uyaran temel yer değiştirme (ikame) mutasyonları ile tersinir olan ade2-1, arg 4-17, lys 1-1 vw trp 5-48 anlamsız aşı boyası (ochre) mutasyonlarını taşıyan XV 185-14C haploid ırkının kullanımını içerir. XV 185-14C ayrıca ikinci bölge mutasyonlarıyla ilk haline dönüşen bir yanlış anlamlı mutasyon his 1-7 işaretleyicisini ve çerçeve kayması tipi mutajenleriyle ilk haline dönüşen işaretleyici hom 3-10’u da taşır.
S. cerevisia’nın diploid suşlarında kullanılan geçerli tek ırk ilv 1-92 için homozigot olan D7’dir.

5. 
   Kalite kriterleri
   

Yok.

6. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

Hazırlıklar

Test kimyasalları ve kontrol çözeltileri, uygun bir taşıyıcı kullanılarak, teste başlamadan hemen önce hazırlanmalıdır. Etanol, aseton veya dimetilsülfoksit (DMSO) gibi organik çözücülerin %2’yi (v/v) geçmeyen çözeltileri gibi suda çözünmeyen organik bileşiklerle kullanılmalıdır. Taşıyıcının son konsantrasyonu hücrenin yaşama kabiliyetini ve büyüme özelliklerini belirgin olarak etkilememelidir.
Metabolik Aktivasyon
Hücreler, uygun dış kaynaklı metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda test kimyasallarına maruz bırakılmalıdır.

En yaygın kullanılan sistem, enzim indirgeyici maddelerle ön muamelesi yapılan, kemirgenlerin karaciğerlerinden gelen kofaktör destekli post-mitokondriyel kısımdır. Metabolik aktivasyon için diğer türlerin, dokuların, post-mitokondriyel kısımların veya başka işlemlerin kullanımı da uygun olabilir.

Test koşulları
Test edileceksuşlar
XV 185-14C haploid ırkı ve D7 diploid ırkı, gen mutasyon çalışmalarında çoğunlukla kullanılır. Ayrıca diğer suşların kullanımı da uygun olabilir.
Ortam
Yaşam sürekliliğinin sağlanması ve mutant sayılarının belirlenmesi için uygun kültür ortamı kullanılır.
Negatif ve pozitif kontrollerin kullanımı
Pozitif, muamele edilmiş ve çözücü kontrolleri aynı anda uygulanmalıdır. Her bir özel mutasyona ait son nokta için uygun pozitif kontrol kimyasalları kullanılmalıdır.
Maruz kalma konsantrasyonu
En az beş uygun aralıklı test maddesi konsantrasyonu kullanılmalıdır. Toksik maddeler için, test edilen en yüksek konsantrasyon değeri hayatta kalanların sayısını %5-10’un altına düşürmemelidir. Nispeten suda çözünmeyen maddeler uygun işlemler kullanılarak çözünürlük sınırlarına kadar test edilmelidirler. Serbestçe suda çözünen, toksik olmayan maddeler için durum bazında üst konsantrasyon belirlenmelidir.
İnkübasyon koşulları
Plakalar karanlıkta dört-yedi gün arasında 28- 30 °C derece sıcaklıkta inkübe edilirler.
Kendiliğinden olan mutasyon sıklıkları
Alt kültürler, kabul edilen normal aralığın içinde kendi kendine olan mutasyon sıklıklarıyla kullanılmalıdır.
Tekrarların sayısı
Gen mutasyonuyla meydana gelen prototrop (tek kaynaktan besin alma) analizi ve hücrelerin yaşayabilmesi için konsantrasyon başına en az üç tekrar plakası kullanılmalıdır. Düşük mutasyon hızı olan hom 3-10 gibi işaretleyicilerin kullanıldığı durumlarda, istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için plaka sayıları artırılmalıdır.
İşlem
S. cerevisia suşlarının muamele edilmesi genellikle hem durağan faz hem de büyüme hücrelerini içeren sıvı test işlemlerinde ile gerçekleştirilir. Başlangıç deneyleri büyüme hücrelerinde yürütülmelidir. 1-5 x 10⁷ hücre/ml, 18 saate kadar 28 -37 °C’de çalkalanarak, test kimyasalına maruz kalır. Metabolik aktivasyon sisteminin uygun bir miktarı gerektiğinde işlem sırasında ilave edilir. İşlem sonunda sonunda, hücreler santrifüjlenir, yıkanır ve uygun kültür ortamına ekilir. İnkübasyondan sonra, plakalar hayatta kalma ve gen mutasyonlarına neden olma durumlarına göre işaretlenir.

Eğer ilk deney negatifse, durağan faz hücreleri kullanılarak ikinci bir deney yürütülmelidir. Eğer ilk deney pozitifse, uygun bağımsız bir deneyle doğrulanmalıdır.

2. 
   VERİLER
   

Veriler, sayılan koloni sayısını, mutant sayısını, hayatta kalan sayısını ve mutant frekansını gösteren içeren bir tablo halinde sunulmalıdır. Bütün sonuçlar bağımsız bir deneyle doğrulanmalıdır.

Veriler uygun istatistiksel yöntemler kullanılarak değerlendirilmelidir.

3. 
   RAPOR
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:

-kullanılan ırk

-test koşulları, durağan faz veya büyüme hücreleri, ortamın bileşenleri, inkübasyon sıcaklığı ve süresi, metabolik aktivasyon sistemi,

-muamele koşulları: maruz kalma seviyeleri, işlem ve uygulamanın uzunluğu, uygulama sıcaklığı, pozitif ve negatif kontroller,

-sayılan kolonilerin sayısı, mutantların sayısı, hayatta kalanların sayısı ve mutant frekansı, uygulanabiliyorsa, doz/cevap ilişkisi, verilerin istatistiksel değerlendirilmesi,

-sonuçların tartışılması,

-sonuçların yorumlanması

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).

4. 
   KAYNAKLAR__Bakınız_Genel_Giriş_Kısım_(E)._B.16_MİTOTİK_REKOMBİNASYON_-_SACCHAROMYCES_CEREVISIAE___YÖNTEM'>KAYNAKLAR
   

Bakınız Genel Giriş Kısım (E).

B.16 MİTOTİK REKOMBİNASYON -SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

3. 
   Referans maddeler
   

Yok

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Saccharomyces cerevisiae’deki mitotik rekombinasyon, genler arasında (veya daha genel olarak bir gen ve onun sentromeri arasında) ve gen içinde tespit edilebilir. İlk olay mitotik çaprazlama olarak adlandırılır ve iki taraflı-karşılıklı ürün meydana getirir, ikincisi ise sıklıkla iki taraflı değildir ve gen dönüşümü olarak adlandırılır. Çaprazlama genellikle heterozigot bir ırkta çekinik homozigot kolonilerin veya kesmelerin oluşumuyla, farklı olarak gen dönüşümü, aynı genin iki farklı kusurlu allelini taşıyan oksotrofik heteroalelik ırkta meydana gelen tek bir kaynaktan beslenme ile geri mutasyon sonucu canlının ilkel halinedönüşümüyle denenir. Mitotik gen dönüşüm tayini için en sık kullanılan suşlar D₄ (ade 2 ve trp 5’te heteroallelik), D₇ (trp 5’te heteroallelik), BZ₃₄ (arg 4’te heteroallelik) ve JDl (his 4 ve trp 5’te heteroallelik)’dir. Kırmızı ve pembe homozigot kesimler oluşturan mitotik çaprazlama (crossing-over), D₅ veya ayrıca ilv 1-92’de mitotik gen dönüşümü ve ters mutasyonu da ölçen D₇’de denenebilir. Her iki ırk da ade 2’nin tamamlayıcı alelleri için heteroalleliktir.

5. 
   Kalite kriterleri
   

Yok.

6. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

Hazırlıklar

Test kimyasallarının, kontrol veya referans bileşikleri çözeltileri, uygun bir taşıyıcı kullanılarak, teste başlamadan hemen önce hazırlanmalıdır. Etanol, aseton veya dimetilsülfoksid (DMSO) gibi organik çözücülerin %2’yi (v/v) geçmeyen çözeltiler gibi suda çözünmeyen organik bileşikler kullanılmalıdır. Taşıyıcının son konsantrasyonu hücrenin yaşama kabiliyetini ve büyüme özelliklerini belirgin olarak etkilememelidir.
Metabolik Aktivasyon
Hücreler, uygun dış kaynaklı metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda test kimyasallarına maruz bırakılmalıdır. En yaygın kullanılan sistem enzim indirgeyici maddelerle ön-muamelesi yapılan, kemirgenlerin karaciğerlerinden gelen kofaktör destekli post-mitokondriyel kısımdır. Metabolik aktivasyon için diğer türlerin, dokuların, post-mitokondriyel kısımların veya başka işlemlerin kullanımı da uygun olabilir.
Test koşulları
Test edilecek suşlar
Sıklıkla kullanılan diploid suşlar D₄, D₅, D₇ ve JD1’dir. Diğer suşların kullanımı uygun olabilir.
Ortam
Yaşam sürekliliğinin sağlanması ve mitotik rekombinasyon frekansı belirlenmesi için uygun kültür ortamları kullanılır.
Negatif ve pozitif kontrollerin kullanımı
Pozitif, muamele edilmemiş ve çözücü kontrolleri aynı anda uygulanmalıdır. Her bir özel rekombinasyon son noktası için uygun pozitif kontrol kimyasalları kullanılmalıdır.
Maruz kalma konsantrasyonları
En az beş uygun aralıklı test maddesi konsantrasyonu kullanılmalıdır. Dikkate alınması gereken faktörler arasında hücre zehirlenmesi ve çözünürlük vardır. En düşük konsantrasyonun hücrenin yaşama kabiliyeti üzerinde hiçbir etkisi olmamalıdır. Toksik kimyasallar için, denenmiş en yüksek konsantrasyon değeri hayatta kalma oranını %5-10’un altına düşürmemelidir. Nispeten suda çözünmeyen maddeler uygun işlemler kullanılarak çözünürlük sınırlarına kadar test edilmelidirler. Serbestçe suda çözünen, toksik olmayan maddeler için durum bazında üst konsantrasyon belirlenmelidir.
Hücreler test kimyasallarına ya hareketsiz fazda ya da 18 saate kadar olan büyüme sürelerinde maruz kalırlar. Ancak, uzun süren muamelelerde kültürler spor oluşumları için mikroskobik olarak incelenmelidir, spor oluşumu testi geçersiz kılar.
İnkübasyon koşulları
Plakalar karanlıkta dört-sekiz gün arasında 28 -30 °C sıcaklıkta inkübe edilirler. Mitotik çaprazlamayla (crossing-over) oluşan kırmızı ve pembe homozigot kesme yöntemi için kullanılan plakalar (uygun boyanmış kolonilerin gelişmesine izin vermek için saymadan iki gün önce) bir buzdolabında (yaklaşık 4 °C’ de) bir sonraki test için saklanmalıdır.
Kendiliğinden mitotik rekombinasyon frekansları
Alt-kültürler, kabul edilen normal aralığın içinde kendi kendine olan mutotik yeniden birleşme mutasyon frekanslarıyla, kullanılmalıdır.
Tekrarların sayısı
Mitotik gen dönüşümüyle meydana gelen prototrop (tek kaynaktan besin alma) ve hücrelerin yaşayabilmesi için konsantrasyon başına en az üç tekrar plakası kullanılmalıdır. Mitotik çaprazlamayla çekinik homozigot oluşan yöntemde uygun koloni sayısı elde etmek için plaka sayıları artırılmalıdır.
İşlem
S. cerevisia suşlarının muamele edilmesi genellikle hem durağan faz hem de büyüme hücresini içeren sıvı test işlemlerinde gerçekleştirilir. Başlangıç deneyleri büyüme hücrelerinde gerçekleştirilmelidir. 1-5 X10⁷ hücre/ml, 18 saate kadar 28 -37 °C’de çalkalanarak, test kimyasalına maruz kalır: Metabolik aktivasyon sisteminin uygun bir miktarı gerektiğinde işlem sırasında ilave edilir.

İşlem sonunda, hücreler santrifüjlenir, yıkanır ve uygun kültür ortamına ekilir. İnkübasyondan sonra, plakalar hayatta kalma ve mitotik rekombinasyonun uyarılması için işaretlenir.

Eğer ilk deney negatifse, durağan faz hücreleri kullanılarak ikinci bir deney yürütülmelidir. Eğer ilk deney pozitifse uygun, bağımsız bir deneyle doğrulanmalıdır.

2. 
   VERİLER
   

Veriler sayılan koloni sayısını, rekombinant sayısını, rekombinantların hayatta kalma oranı ve frekansı gösterecek şekilde tablo haline getirilerek sunulmalıdır.

Sonuçlar bağımsız bir deneyle doğrulanmalıdır.
Veriler uygun istatistiksel yöntemler kullanılarak değerlendirilmelidir.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:

-kullanılan ırk

-test koşulları, durağan faz veya büyüme hücreleri, ortamın bileşenleri, inkübasyon sıcaklığı ve süresi, metabolik aktivasyon sistemi,

-muamele koşulları: maruz kalma konsantrasyonu, işlem ve muamele süresi, muamele sıcaklığı, pozitif ve negatif kontroller,

-sayılan koloni sayısı, rekombinant sayısı, hayatta kalma oranı ve rekombinasyon frekansı, uygulanabiliyorsa, doz/cevap ilişkisi, verilerin istatistiksel değerlendirilmesi,

-sonuçların tartışılması,

-sonuçların yorumlanması

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).

4. 
   KAYNAKLAR
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E).

B.17 MUTAJENİTE - IN VITRO MEMELİ HÜCRESİ GEN MUTASYONU TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

Bu yöntem OECD TG 476 In Vitro Memeli Hücresi Gen Mutasyonu Testi (1997)’nin tekrarıdır.

1. 
   Giriş
   

In VitroMemeli Hücresi Gen Mutasyonu Testi gen mutasyonlarını tayin etmek için kullanılabilir. Uygun hücre dizileri L5178Y fare lenfoma hücrelerini, CHO, CHO-AS52 ‘yi ve hamster hücrelerinin V79 dizilerini ve TK6 insan lenfoblastoid hücrelerini kapsar (1). Bu hücre dizileri arasında en yaygın kullanılanı, timidin kinaz (TK) ve hipoksantin-guanin fosforibozil transferaz (HPRT) ve ksantin-guanin fosforibozil transferaz (XPRT)’ın transgeninde genetik ölçüm mutasyonlarıdır. TK, HPRT ve XPRT mutasyon testleri genetik olayların farklı spektrumlarını belirlerler. TK ve XPRT’nin otozomal konumları X kromozomlarının HPRT lokuslarında (Bir genin kromozom üzerinde bulunduğu bölgeye verilen ad) tayin edilmeyen genetik olayların (örneğin büyük silinmeler (Bir tip kromozom mutasyonu sonucunda DNA’ daki bir bazın ya da bazların yok olması hali)) tayinine olanak sağlayabilir (2)(3)(4)(5)(6).

In Vitro Memeli Hücresi Gen Mutasyonu Testinde, genel olarak kullanılan hücre dizilerinin kültürleri veya hücre suşları kullanılabilir. Kullanılan hücreler kültürdeki büyüme kabiliyetleri temeline ve kendiliğinden olan mutasyon frekansının kararlılığına göre seçilir.
In vitro içinde yürütülmüş testlerde genelde dış kaynaklı metabolik aktivasyonun kullanılması gerekir. Bu metabolik aktivasyon sistemi, memelilerdeki in vivo koşulları tamamen taklit edemez. Esas mutasyona sebep olma özelliğini yansıtmayan sonuçlara sebep olabilecek koşullardan kaçınılmasına dikkat edilmelidir. Esas mutasyona sebep olma özelliğini yansıtmayan pozitif sonuçlar, pH, ozmolalite değişiklikleri veya yüksek düzeyde sitotoksisiteden kaynaklanabilir (7).
Bu test, olası memeli mutajen ve kanserojenlerini taramak için kullanılır. Bu testte pozitif çıkan pek çok bileşik, memeliler için kanserojendir, ancak bu test ve kansere sebep olma özellik (kanserojenlik) arasında tam bir bağlantı yoktur. Bağlantı kimyasal sınıfa bağlıdır ve bu testle belirlenemeyen kanserojenler olduğuna dair giderek artan sayıda kanıt vardır, çünkü diğer sitotoksik olmayan mekanizmalar veya bakteri hücrelerinde olmayan mekanizmalar gibi davranırlar(6).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

İleri mutasyon: Anne ya da babaya ait tip kodlanmış protein fonksiyonlarının enzimatik aktivite kaybına veya değişikliklerine neden olan mutant biçimine sokan gen mutasyonu.

Baz çifti yer değiştirme mutajenleri: DNA’daki bir veya daha fazla baz çiftinin yer değiştirmesine neden olan maddeler
Çerçeve kayması tipi (frameshift) mutajenleri: DNA molekülünde bir veya daha fazla baz çiftinin katılmasına veya eksilmesine neden olan maddeler
Fenotipik ekspresyon zamanı: değişmemiş gen ürünlerinin yeni mutasyona uğramış hücrelerde tükenme süresi
Mutant frekansı: gözlenen mutant hücrelerin sayısının canlı hücre sayısına bölümü
Bağıl toplam büyüme: hücrelerin kontrol popülasyonlarına kıyasla belli bir zamanın üzerinde hücre sayısındaki artıştır; negatif kontrole göre bağıl süspansiyon büyüme ürünüyle, negatif kontrole göre bağıl klonlama verimliliğinin çarpılmasıyla hesaplanır.
Bağıl büyüme: Negatif kontrole göre bağıl ekspresyon süresinin üzerinde hücre sayısındaki artış.
Canlılığı sürdürme yeteneği: Ekspresyon periyodu sonrasındaki seçici koşullarda kaplama zamanında muamele edilmiş hücrelerin klonlama verimi.
Sağkalım: muamele edilen hücrelerin, muamele süresi sonunda kaplanmış kolonlama verimliliği; genellikle kontrol hücre popülasyonun hayatta kalmasıyla ilişkili olarak ifade edilir.

3. 
   Test yönteminin ilkesi
   

TK^+/- ->TK^-/- mutasyonu nedeniyle timidin kinazları (TK) olmayan hücreler, primidin analoğu olan triflorotimidinin (TFT) sitotoksik etkilerine dirençlidirler. Timidin kinaza yetkin hücreler hücresel metabolizmanın inhibisyonuna neden olan ve bir sonraki hücre bölünmesini durduran TFT’ye duyarlıdır. Bu mutant hücreler TFT varlığında çoğalabilirken, timidin kinaz içeren normal hücreler çoğalamazlar. Benzer şekilde, HPRT veya XPRT içermeyen hücreler 6-tiyoguanin (TG) veya 8-azaguanine (AG) direnç göstermeleriyle seçilirler. Herhangi bir memeli hücresi gen mutasyon testlerinde, bir baz ya da seçiçi ajanla ilişkili bir bileşik test edilirse, test maddesinin özellikleri dikkatlice gözden geçirilmelidir. Örneğin, test maddesinin mutant veya mutant olmayan hücrelerdeki şüpheli herhangi bir seçici toksisitesi araştırılmalıdır. Bu, seçici ajanla yapısal olarak ilişkili kimyasallar test edilirken seçim sisteminin/ajanının perfonmansı teyit edilmelidir (8).

Süspansiyondaki veya tek tabakalı kültürdeki hücreler bir süre metabolik aktivasyonun hem varlığında hem de yokluğunda test maddesine maruz kalırlar ve sitotoksisitenin belirlenmesi ve mutant seçiminden önce fenotipik ifadenin ortaya çıkması için alt kültürlenirler (subcultured) (9)(10)(11)(12)(13). Sitotoksisite genellikle, muamele periyodundan sonra kültürlerin bağıl klonlama verimliliği (hayatta kalma) veya bağıl toplam büyümeleriyle belirlenir. Muamele edilen kültürler, mutasyonların en uyguna yakın fenotipik ifadelerinin ortaya çıkması için büyüme ortamında yeterli bir sürede, seçilen her lokus (Bir genin kromozom üzerinde bulunduğu bölgeye verilen ad) ve hücre tipi karakteristiğinde korunmalıdır. Mutant frekansı, mutant hücreleri tespit etmek için seçici ajan bulunan ortamda ve klonlama verimliliğini (canlılığı sürdürme yeteneği) tespit etmek için seçici ajanın olmadığı ortamda bilinen sayıda hücre ekilerek belirlenir. Uygun bir inkübasyon süresinden sonra koloniler sayılır. Mutant frekansı seçici ortamdaki mutant kolonilerin sayısıyla seçici olmayan ortamdaki kolonilerin sayısından elde edilir.

4. 
   Test yönteminin tanımı
   

1. 
   Hazırlıklar
   

1. 
   Hücreler
   

Bu testte L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 veya TK6 hücrelerinin altklonlarını kapsayan çeşitli mevcut hücre tipleri kullanılabilir. Bu testte kullanılan hücre tipleri kimyasal mutajenlere karşı kanıtlanmış bir hassasiyete, yüksek bir klonlama verimine ve kararlı bir spontan mutant frekansına sahip olmalıdır. Hücreler mikoplazma kontaminasyonu için kontrol edilmeli ve kontaminasyon varsa kullanılmamalıdır. Test, duyarlılığının ve gücünün önceden belirlenebileceği şekilde tasarlanmalıdır. Hücrelerin sayısı, kültürler ve kullanılan test maddesinin konsantrasyonu tanımlanan bu parametreleri yansıtmalıdır(14). Bu testte her aşamada kullanılan ve en az sayıdaki hücre kullanımı uygulamasıyla sağ kalan hücreler mutant frekansına dayanmalıdır. Genel kural, spontan mutant frekansının tersinin en az on katı hücre sayısı kullanmaktır. Ancak en az 10⁶ hücre kullanılması tavsiye edilmektedir. Testin tutarlı performansını göstermek için, kullanılan hücre sistemine ait yeterli tarihsel veriler mevcut olmalıdır.

2. 
   Ortam ve kültür koşulları
   

Kültürlerin elde edilmesinde uygun kültür ortamı ve inkübasyon koşulları (kültür kapları, CO₂ konsantrasyonu, sıcaklık ve nem) kullanılmalıdır. Ortam, testte kullanılan seçici sistemlere ve hücre tipine bağlı olarak seçilmelidir. Hem mutant, hemde mutant olmayan hücrelerin koloni oluşturma kabiliyetleri ve ekspresyon süresi boyunca hücrenin en iyi şekilde yetişmesini sağlaması açısından seçilmesi gerekli olan kültür koşulları özellikle önemlidir.

3. 
   Kültürlerin hazırlanması
   

Hücreler stok kültürlerden oluşturulurlar, kültür ortamlarına ekilir ve 37°C derecede inkübasyon yapılır. Bu testte kullanılmadan önce, kültürler önceden var olan mutant hücrelerin temizlenmesi gerekir.

4. 
   Metabolik aktivasyon
   

Hücreler test maddesine uygun metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda maruz kalmalıdırlar. En yaygın kullanılan sistem Aroclor 1254 (15)(16)(17)(18) veya fenobarbiton ve ß–naftoflavon birleşimi (19)(20) enzim indükleyici ajanlarla muamele edilen kemirgenlerin karaciğerlerinden elde edilen kofaktör-destekli post-mitokondriyal kısımdır.

Post-mitokondriyal kısım genellikle son test ortamında %1–10 v/v, konsantrasyon aralığında kullanılır. Metabolik aktivasyon sisteminin koşulları ve seçimi test edilen kimyasalın sınıfına bağlı olabilir. Bazı durumlarda, post-mitokondriyal kısma ait birden fazla konsantrasyon kullanılması uygun olabilir.
(Spesifik aktivasyon gösteren enzimleri ifade eden genetik olarak tasarlanmış hücre dizilerini içeren içsel, endojen aktivasyon için potansiyel sağlayabilir). Kullanılan hücre dizilerinin seçimi (örneğin test maddesinin metabolizması için sitokrom P450 izoenzim ilişkisiyle) bilimsel olarak doğrulanmalıdır.

5. 
   Test maddesi/Hazırlama
   

Hücrelerin muamele edilmelerinden önce uygunsa, katı test maddeleri uygun çözücüler veya taşıyıcılar içinde çözünmeli veya askıda kalmalı ve seyreltilmedir. Sıvı test maddeleri muameleden önce test sistemlerine doğrudan eklenebilirler ve/veya seyreltilebilirler. Saklamanın kabul edilebilirliğini gösteren kararlılık verileri olmadıkça test maddesinin taze hazırlanmış çözeltileri uygulanmalıdır.

2. 
   Test koşulları
   

1. 
   Çözücü/taşıyıcı
   

Çözücü/taşıyıcı, test maddesiyle kimyasal reaksiyona girmemeli ve hücrelerin sağkalımlarıyla ve S9 aktivitesiyle uyumlu olmalıdır. Çok iyi bilinen çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa, içerikleri uyumlu olduklarını gösteren verilerle desteklenmelidir. Mümkün olan yerlerde, sulu çözelti/taşıyıcı kullanılmasının ilk önce göz önünde bulundurulması tavsiye edilir. Suda kararsız olan maddeler test edilirken, kullanılan organik çözücülerde su olmamalıdır. Su, moleküler süzgeç ilave edilerek uzaklaştırılabilir.

2. 
   Maruz kalma konsantrasyonları
   

En yüksek konsantrasyonu belirlerken dikkate alınması gereken kriterler arasında sito toksisite, test sistemindeki çözünürlük, pH veya ozmolalite değişiklikleri vardır. Sitotoksisite bağıl klonlama verimliliği (hayatta kalma) veya bağıl toplam büyüme gibi hücre bütünlüğü ve büyüme için uygun gösterimler kullanılarak asıl deneyde metabolik aktivasyonunhem varlığında hem de yokluğunda belirlenmelidir. Sitotoksisitenin ve çözünürlüğün bir ön deneyde belirlenmesi daha uygun olabilir.

Analiz edilebilen en az dört konsantrasyon kullanılmalıdır. Sitotoksisite olan yerlerde, bu konsantrasyonlar, en fazla toksisiteden, en az toksisiteye ya da hiçbir toksisite yaratmayan bir aralığa dahil olmalıdırlar, bu da genellikle konsantrasyon seviyeleri 2 ve 10 arasındakinden daha fazla olmayan bir faktörle ayrılmaları gerektiği anlamına gelir. En fazla konsantrasyon sitotoksisiteye sebep oluyorsa, o zaman yaklaşık %10-20 arasında (fakat % 10’dan az değil) bağıl sağkalım (bağıl klonlama verimliliği) veya bağıl toplam büyüme olmalıdır.

Nispeten sitotoksik olmayan olan maddeler için, maksimum test konsantrasyonu herhangi biri en düşük olacak şekilde 5 µl/ml, 5 mg/ml veya 0.01 M’dır.

Nispeten çözünemeyen maddeler, çözünebilirlik sınırlarına kadar veya bu sınırın altındaki kültür koşullarında test edilmelidir. Çözünmezliğin kanıtı hücrelerin maruz kaldığı en son muamele ortamında belirlenmelidir. Hücrelerin, S9, serum vs. varlığına bağlı olarak test sistemindeki maruz kalma boyunca çözünürlük değişeceğinden uygulamanın başındaki ve sonundaki çözünürlüğün tayin edilmesi uygun olabilir. Çözünmezlik çıplak gözle belirlenir. Çökelek, skorlamayı engellememelidir.

3. 
   Kontroller
   

Eş zamanlı pozitif ve negatif (çözücü veya taşıyıcı) kontroller, metabolik aktivasyonunhem varlığında hem de yokluğunda her bir deneyde de yer almalıdır. Metabolik aktivasyon kullanıldığında, pozitif kontrol kimyasalı, mutajenik cevap vermek için aktivasyonaihtiyaç duymalıdır.

Pozitif kontrol maddeleri içeren örnekler :

Metabolik aktivasyonun koşulu	Lokus	Madde	CAS No.	EINECS No.
Dış kaynaklı Metabolik Aktivasyonun Yokluğu	HPRT	Etil metansülfonat Etil nitroz üre	62-50-0 759-73-9	200-536-7 212-072-2
	TK (küçük ve büyük koloniler)	Metil metansülfonat	66-27-3	200-625-0
	XPRT	Etil metansülfonat Etil nitroz üre	62-50-0 759-73-9	200-536-7 212-072-2
Dış kaynaklı Metabolik Aktivasyonun Varlığı	HPRT	3-metilkolantren N-nitrozo dimetil amin 7,12-dimetilbenzantrasen	56-49-5 62-75-9 57-97-6	200-276-4 200-549-8 200-359-5
	TK (küçük ve büyük koloniler)	Siklofosfamid Siklofosfamid monohidrat Benzo[a]piren 3-metilkolantren	50-18-0 6055-19-2 50-32-8 56-49-5	200-015-4 200-028-5 200-276-5
	XPRT	N-nitrozo dimetil amin(S 9’un yüksek düzeyleri için) Benzo[a]piren	62-75-9 50-32-8	200-549-8 200-028-5

Diğer uygun pozitif kontrol kaynak maddeleri kullanılabilir. Örneğin bir laboratuvarın 5-Bromo 2’-deoksiüridine (CAS n. 59-14-3, EINECS n. 200-415-9), dayanan tarihsel verileri mevcutsa bu referans maddesi kullanılabilir. Mevcut olduğu durumlarda, kimyasal sınıfla ilişkili pozitif kontrol kimyasalların kullanımı üzerinde durulmalıdır. Negatif kontroller muamele ortamındaki çözücü veya taşıyıcıyı yalnız başına kapsamasını ve muamele gruplarıyla aynı şekilde muamele edilmesini içermelidir. Ayrıca, geçmişe dayalı kontrol verileri sağlığa zararlı veya mutajenik etkilerin, seçilen çözücüyle uyarıldığını göstermediği sürece muamele edilmemiş kontroller de kullanılmalıdır.

3. 
   İşlem
   

1. 
   Test maddesiyle muamele
   

Çoğalan hücreler test maddesine metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda maruz bırakılmalıdır. Maruz kalma, uygun bir zaman aralığında olmalıdır (genellikle üç-altı saat arası etkilidir). Maruz kalma zamanı bir veya daha fazla hücre döngüsü şeklinde genişletilebilir.

Test edilen her bir konsantrasyon için, ya çift sayıda ya da tek sayıda muamele edilmiş kültürler kullanılabilir. Konsantrasyon sayısı tekli kültürler kullanıldığında, analiz için uygun sayıda kültürleri sağlayabilmek için artırılmalıdır. (örneğin en az 8 analiz edilebilir konsantrasyon). Çiftli negatif (çözücü) kontrol kültürleri kullanılmalıdır.
Gaz veya uçucu maddeler, kapalı kültür kaplarının içinde olduğu gibi uygun yöntemlerle test edilmelidirler (21)(22).

2. 
   Sağkalım, canlılık ve mutant frekansı ölçümleri
   

Maruz kalma süresinin sonunda, hücreler yıkanır ve sağkalımların belirlenmesi ve mutant fenotipinin ifade edilmesi için kültürlenirler. Kültürlerin bağıl klonlama verimliliğiyle (sağ kalım) veya kültürlerin bağıl toplam büyümesiyle belirlenen sitotoksisitenin ölçümü genellikle muamele süresi sonrasında başlatılır.

Yeni mutantların (HPRT ve XPRT’nin en az 6-8 güne, TK’nın en az 2 güne ihtiyacı vardır) en uyguna yakın fenotipik ifadelerinin ortaya çıkmasına izin verilmesi için her bir lokusun belirli süreye ihtiyacı vardır. Hücreler sırasıyla mutant sayısının ve klonlama verimliliğinin belirlenmesi için seçici ajanlarının bulunduğu ve bulunmadığı bir ortamda yetiştirilirler. (Mutant frekansını hesaplamak için kullanılan) yasayabilirlik ölçümü ekspresyon süresinin sonunda seçici olmayan ortamda başlatılır. Test maddesi L5178Y TK^+/- testinde pozitifse, test kültürlerinin en az birinde (en yüksek pozitif konsantrasyon) ve negatif ve pozitif kontrollerde koloni boyutuna göre ayırma yapılmalıdır. Test maddesi L5178Y TK^+/- testinde negatifse, negatif ve pozitif kontrollerde koloni boyutuna göre ayırma yapılmalıdır. TK6TK^+/- kullanılan çalışmalarda da ayrıca koloni boyutuna göre ayırma yapılabilir.

2.