FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

VERİLER

1. 
   Sonuçların uygulanması
   

Her bir hayvana ait veriler tablo halinde sunulmalıdır. Deneysel birim hayvandır. Her bir hayvan için ayrı ayrı yapısal kromozom bozukluğu olan hücre sayısı ve hücre başına düşen kromozom bozukluğu sayısı değerlendirilmelidir. Farklı tipteki yapısal kromozom bozuklukları sayılarıyla ve frekanslarıyla kontrol ve muamele grupları için listelenmelidir. Eksiklikler ayrıca kaydedilir ve raporlanır fakat genelde toplam bozukluk frekansında yer almazlar.

Mitoz yanında mayoz gözlenirse, olası sitotoksik etki oluşturmak için hayvan başına 100 bölünen hücrenin düştüğü bir örnekte, spermatoganal mitozların birinci ve ikinci mayotik metafazlara oranı tüm muamele ve negatif kontrol hayvanları için sitotoksisitenin bir ölçüsü olarak tayin edilir. Sadece mitoz gözlenirse, mitoz endeksi her bir hayvan için en az 1000 hücreyle belirlenmelidir.

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Pozitif sonuç tayin etmek için bozuk kromozomlu hücrelerin bağıl sayısındaki doza bağlı artış veya tek bir doz grubunda, tek bir örnek alma zamanında kromozomu bozuk hücrelerin sayısındaki net artış gibi bazı kriterler vardır. Sonuçlar ilk önce biyolojik açıdan değerlendirilmelidir. İstatistiksel yöntemler, test sonuçlarını değerlendirirken yardımcı olarak kullanılabilir (8). İstatistiksel anlamlılık pozitif bir cevap için tek belirleyici etken olmamalıdır. Belirsiz sonuçlar ilave testlerle tercihen deney koşullarının modifikasyonuyla netleştirilmelidir.

Sonuçları yukarıdaki kriterleri karşılamayan bir test maddesinin bu sistemde mutajenik (genetik bozukluğa neden olan) olmadığı düşünülür.
Her ne kadar pek çok çalışma açıkça pozitif ya da negatif sonuçlar verecekse de, nadir durumlarda veri kümeleri test maddesinin aktivitesi hakkında net bir karar verilmesine engel olabilir. Sonuçlar deneyin tekrarlanma sayısından bağımsız olarak şüpheli ve belirsiz olabilir.
İn vivo spermatogonal kromozom bozukluk testinden elde edilen pozitif sonuçlar bir maddenin test edilen türün eşey hücrelerindeki kromozom bozukluklarını indüklediğini gösterir. Negatif sonuçlar, test koşulları içinde, test maddesinin test edilen türün eşey hücrelerindeki kromozom bozukluklarını indüklemediğini gösterir. Test maddesinin veya metabolitinin genel dolaşıma veya belirli biçimde hedef dokuya ulaşma olasılığı tartışılmalıdır.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir:

Çözücü/Taşıyıcı

• 
  taşıyıcı seçimi için gerekçe;
  
• 
  biliniyorsa, test maddesinin çözücü/taşıyıcı içindeki çözünürlüğü ve kararlılığı;
  

Test hayvanları:

• 
  kullanılan tür/ ırk;
  
• 
  hayvanların sayısı ve yaşı;
  
• 
  kaynak, barınma koşulları, diyet. vs.;
  
• 
  testin başında her bir hayvanın ayrı ayrı ağırlığı, her bir grup için vücut ağırlığı aralığı, ortalama ve standart sapma dahildir;
  

Test koşulları:

• 
  yapıldıysa, aralık-bulma çalışma verileri;
  
• 
  doz seçimi için gerekçe;
  
• 
  uygulama yolu için gerekçe;
  
• 
  test maddesi hazırlanmasıyla ilgili detaylar;
  
• 
  test maddesi uygulanmasıyla ilgili detaylar;
  
• 
  gözden çıkarılma zamanları için gerekçe;
  
• 
  eğer uygulanabiliyorsa, diyet/içme suyu test maddesi konsantrasyonun (ppm) mevcut doza (mg/kg vücut ağırlığı/gün) çevrilmesi;
  
• 
  gıda ve su kalitesiyle ilgili detaylar;
  
• 
  muamele ve örnek alma planıyla ilgili detaylı tanım;
  
• 
  toksisite ölçümü yöntemleri;
  
• 
  metafaz durdurucu maddelerin tanımı, konsantrasyonları ve muamele süreleri;
  
• 
  lam hazırlama yöntemleri;
  
• 
  bozuklukları sayma kriterleri;
  
• 
  hayvan başına analiz edilen hücre sayısı;
  
• 
  çalışmaları pozitif, negatif ve belirsiz olarak ayırma ölçütleri.
  

Sonuçlar:

• 
  toksisite belirtileri;
  
• 
  mitotik indeks;
  
• 
  spermatogonal mitoz hücrelerin ilk ve ikinci mayotik metafazlara oranı;
  
• 
  her bir hayvan için ayrı ayrı verilen bozukluk tipi ve sayısı;
  
• 
  grup başına düşen toplam bozukluk sayısı;
  
• 
  grup başına düşen bozukluklu hücre sayısı;
  
• 
  uygun yerlerde, doz cevap ilişkisi;
  
• 
  varsa, istatistiksel analiz;
  
• 
  eşzamanlı negatif kontrol verileri;
  
• 
  geçmişe yönelik negatif kontrol verileri, aralık, ortalama ve standart sapmayla birlikte;
  
• 
  eşzamanlı pozitif kontrol verileri.
  
• 
  görülebiliyorsa, plodideki değişiklikler;
  

Sonuçların tartışılması.

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.
   
2. 
   Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
   
3. 
   Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.
   
4. 
   Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
   
5. 
   Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonal Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.
   
6. 
   Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.
   
7. 
   Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson- Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.
   
8. 
   Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
   

B.24. FARE BENEK TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

3. 
   Referans maddeler
   

Yok.

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Bu, farede uygulanan, gelişmekte olan embriyoların kimyasala maruz kaldığı in vivo (canlı organizma içinde) bir testtir. Gelişmekte olan embriyolardaki hedef hücreler melanoblastlar ve hedef genler de tüylerin pigmentasyonunu (hücrelerin renkli madde oluşturması) kontrol eden genlerdir. Gelişmekte olan embriyolar bu kıl renk genlerinin bazıları için heterozigottur. Melanoblastlardaki böyle bir genin baskın kalıtsal gendeki değişime neden olan gendeki bir mutasyon veya baskın kalıtsal gendeki değişime neden olan genin kaybolması çekinik fenotipin kendi nesillerinden hücrelerde, meydana gelen farenin tüylerinde rengi değişmiş leke oluşturarak, görülmesi anlamına gelir. Bu lekelere veya beneklere, yani mutasyonlara sahip yavrular sayılır ve sadece çözeltiyle muamele edilen embriyolardan elde edilen yavruların arasındakilerle karşılaştırılır. Fare benek testi fetal hücrelerdeki tahmin edilen mutasyonların belirlenmesini sağlar.

5. 
   Kalite kriterleri
   

Yok.

6. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

Hazırlıklar

Mümkün olduğu durumlarda, test kimyasalları izotonik tuz çözeltisinde çözülür veya askıda kalırlar. Suda çözünmeyen kimyasallar, uygun taşıyıcıların içinde çözünür veya askıda kalır. Kullanılan taşıyıcı test bileşiğiyle etkileşmemeli ya da toksik etki oluşturmamalıdır. Test kimyasallarının yeni hazırlanan çözeltileri kullanılmalıdır.
Deney hayvanları

T ırkı fareleri (nonagouti, a/a; çinçilla, pembe göz, c^chp/c^chp; kahverengi, b/b; seyrek, kısa kulak, d se/d se; benekli lekeli, s/s) ya HT ırkı (solgun, nonagouti, podi familyasından, pa a bp/pa a bp; bulanık gri, ln fz/ln fz; inci pe/pe) ya da C57BL (nonagouti, a/a) ile çiftleştirilir. NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) ve DBA (nonagouti, a/a; kahverengi, b/b; seyrek d/d) arasındaki gibi diğer uygun çaprazlamalar nonagouti yavruları oluşturmak için kullanılabilir.

Sayı ve cinsiyet

Yeterli miktarda hamile hayvan muamele edilir ve kullanılan her bir doz için uygun sayıda yavrunun sağ kalması sağlanır. Uygun numune büyüklüğü muamele edilen farelerde görülen benek sayısıyla ve kontrol verilerinin skalasıyla sağlanır. Negatif sonuç sadece dişilerden en az 300 yavru en yüksek dozla muamele edilip sayılırsa kabul edilebilir.

Negatif ve pozitif kontrol kullanımı

Sadece taşıyıcıyla muamele edilen farelerden elde edilen eşzamanlı kontrol verileri (negatif kontroller) mevcut olmalıdır. Aynı laboratuardan elde edilen tarihsel kontrol verileri, homojen oldukları varsayılarak, hassasiyeti artırmak için birleştirilebilir. Test kimyasalının mutajeniteye neden olduğu belirlenemezse, aynı laboratuardan yakın zamanda, bu testle mutajenite göstereceği bilinen bir kimyasalla muamele edilerek elde edilen pozitif kontrol veriler mevcut olmalıdır.

Uygulama yolu

Uygulama yolu, hamile dişilere genellikle oral intubasyon veya intraperitonal enjeksiyondur. Solunum yoluyla veya diğer yollarla uygulama da uygun durumlarda kullanılabilir.

Doz düzeyleri

Biri toksisite belirtileri veya yavru büyüklüğünde azalma sağlayan en az iki doz kullanılır. Toksik olmayan kimyasallar için pratik olarak uygulanabilecek maksimum doz kullanılmalıdır.

İşlem

Tek uygulama normalde hamileliğin 8,9 veya 10ncu günlerinde yapılır. 1nci gün vajinal tıkacın ilk gözlendiği gün olarak hesaplanır. Bu günler gebelikten sonra 7,25, 8,25 ve 9,25 günlerine karşılık gelir. Bu günlerin üzerindeki başarılı uygulamalar kullanılabilir.

Analiz

Yavrular kodlanır ve doğumdan üç ve dört hafta sonra benekler için sayılır. Benekler üç sınıfa ayrılırlar:

(a) hücre ölümü (WMVS) sonucu oluştukları öngörülenorta düzeyde 5 mm’lik beyaz benekler;
(b) yanlış farklılaşma sonucu oluştukları öngörülen meme, cinsel organ, boğaz, koltuk altı ve kasık, orta alınla ilişkili sarı, agouti-benzeri benekler,
(c) somatik mutasyon (RS) sonucu oluştukları öngörülen tabakada rastgele dağılmış renkli ve beyaz benekler,
Her üç sınıf sayılır fakat sadece sonuncusu, RS, genetikle ilgilidir. Ayırmada karşılaşılan problemler, örnek tüylerin florasan mikroskobu ile incelenmesiyle çözülebilir. Yavrulardaki belirgin büyük morfolojik (yapıya bağlı) anomaliler not edilmelidir.

2. 
   VERİLER
   

Veriler sayılan yavruların ve bir veya daha fazla öngörülen somatik mutasyon beneklerinin toplam sayısı olarak sunulur. Muamele ve negatif kontrol verileri uygun yöntemlerle karşılaştırılır. Veriler ayrıca litre başına temel alınarak sunulurlar.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:

• 
  çaprazlamada kullanılan suşlar,
  
• 
  deney ve kontrol gruplarındaki hamile hayvan sayısı,
  
• 
  deney ve kontrol grubundaki yavruların doğumdaki ve memeden kesilmedeki ortalama büyüklükleri,
  
• 
  test kimyasalının dozları,
  
• 
  kullanılan çözücü
  
• 
  uygulamanın yapıldığı hamilelik günü,
  
• 
  uygulama yolu
  
• 
  yavruların toplam sayısı, deney ve kontrol gruplarındaki WMVS, MDS ve RS sayıları,
  
• 
  büyük morfolojik anomaliler,
  
• 
  uygun olduğunda, RS ‘nin doz/cevap ilişkisi,
  
• 
  istatistiksel değerlendirilme,
  
• 
  sonuçların tartışılması,
  
• 
  sonuçların yorumlanması
  

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).

4. 
   KAYNAKLAR___Bakınız_Bölüm_B_Genel_Giriş_(E).__B._25._FAREDE_KALITIMSAL_TRANSLOKASYON_TESTİ___YÖNTEM'>KAYNAKLAR
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E).

B. 25. FAREDE KALITIMSAL TRANSLOKASYON TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

3. 
   Referans maddeler
   

Yok.

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Farede kalıtımsal yer değiştirme testi, ilk neslin yavrularında ortaya çıkan memeli eşey hücrelerindeki yapısal ve sayısal kromozom değişikliklerini belirler. Belirlenen kromozom değişikliklerinin tipleri karşılıklı yer değiştirmelerdirve dişi nesiller dâhil edilirse, X kromozomu kaybolur.

Yer değiştirme taşıyıcıları ve XO-dişilerinin doğurganlıkları düşüktür, bu durum sitogenetik analizler için F1 soyunu seçmekte kullanılır. Tam kısırlık bazı tip yer değiştirmelerden (X-otozom ve c-t tipi) kaynaklanır. Yer değiştirmeler sitogenetik olarak erkeklerde ayrı ayrı diyakinezi-metafaz 1’in mayoz bölünme gösteren hücrelerinde, ya F1 erkeklerinde ya da F1 dişilerin erkek yavrularında gözlenir. XO-dişileri kemik iliği mitoz bölünmede sadece 39 kromozomun varlığıyla sitogenetik olarak tanımlanır

5. 
   Kalite kriterleri
   

Yok.

6. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

Hazırlıklar

Test kimyasalları izotonik tuz çözeltisinde çözülür. Eğer çözünmezlerse, uygun bir taşıyıcı içinde çözünür veya askıda kalırlar. Test bileşiklerinin çözeltileri, kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. Dozun uygulanmasını kolaylaştırmak için bir taşıyıcı kullanılıyorsa, taşıyıcı test bileşiğiyle etkileşmemeli ya da toksik etki oluşturmamalıdır.
Uygulama yolu

Uygulama yolu genellikle ağızdan tüple veya deri içine enjeksiyondur. Diğer yollarla uygulama da uygun olabilir.

Deney hayvanları

Üremenin kolaylaştırılması ve sitolojik doğrulama için deneyler fareyle yürütülür. Özgün bir fare ırkına gerek yoktur. Ancak, ırkın ortalama bir batında doğan yavruların sayısı sekizden fazla ve nispeten sabit olmalıdır. Sağlıklı, cinsel olarak olgunlaşmış hayvanlar kullanılır.

Hayvan sayısı

Gerekli hayvan sayısı, kendiliğinden yer değiştirme frekansına ve pozitif sonuç için gerekli olan en düşük oluşma hızına bağlıdır.

Testler genellikle F1 erkek soyunun analizi ile gerçekleştirilir. Doz grubu başına en az 500 erkek F1 yavru kuşak test edilmelidir. Dişi F1 kuşak varsa, 300 erkek ve 300 dişiye gerek vardır.
Negatif ve pozitif kontrollerin kullanımı

Eş zamanlı ve tarihsel kontrollerden elde edilen uygun kontrol verileri mevcut olmalıdır. Aynı laboratuvarda yakın zamanda yürütülen deneylerden kabul edilebilir pozitif kontrol sonuçları elde edildiğinde bu sonuçlar eş zamanlı bir pozitif kontrol yerine kullanılabilir.

Doz
Genelde en az toksik etkinin oluşmasını sağlayan fakat üreme davranışını ve sağkalımı etkilemeyen en yüksek doz düzeyi test edilir. Doz-cevap ilişkisini oluşturmak için, daha düşük iki ayrı doza daha ihtiyaç vardır. Toksik olmayan kimyasallar için, uygulanabilen en yüksek doz kullanılmalıdır.
İşlem
Muamele ve çiftleşme
İki muamele programı mevcuttur. Test maddesinin tek seferde uygulanması yaygın olarak kullanılır. Test maddesinin 35 gün boyunca haftada yedi gün uygulaması da kullanılabilir bir yöntemdir. Muameleyi takip eden çiftleşme sayısı,muamelenin programlanmasıyla elde edilir ve muamele edilen tüm üreme hücresi aşamalarının örneklendirildiği kesinleştirilmelidir. Çiftleşme süresinin sonunda dişiler ayrı kafeslere yerleştirilirler. Dişiler doğum yaptığında, tarih, yavru büyüklüğü ve yavru kuşak cinsiyeti kaydedilir. Deneyde kullanılmayacaklarsa, bütün erkek yavru kuşaklar sütten kesilirler ve bütün dişi yavru kuşaklar atılırlar.
Yer değiştirme heterozigotluğu için test uygulanması
Olası iki yöntemden biri kullanılır:
-F1 yavru kuşağı doğurganlık testi ve sitogenetik analizle olası yer değiştirme taşıyıcılarının daha sonraki doğrulanması
- Erkek F1 yavru kuşakların doğurganlık testiyle ön seçim yapılmadan sitogenetik analizi

1. 
   Doğurganlık testi
   

F1’lerin doğurganlıklarının azalması bir batındaki yavru sayısının gözlenmesi ve/veya dişi döl yatağı (uterus) içeriklerinin analiziyle oluşturulabilir. Normal ve azalmış doğurganlığı belirleme kriterleri kullanılan fare ırkı için oluşturulmalıdır.

Bir batındaki yavru sayısının gözlenmesi: Test edilecek F1 erkekleri aynı deneydeki ya da kolonideki dişilerle birlikte ayrı ayrı kafeslere yerleştirilir. Kafesler çiftleşmeden 18 gün sonra başlayarak günlük olarak incelenir. F2 yavru kuşaklarının bir batındaki yavru sayısı ve cinsiyetleri doğumda kaydedilir ve sonrasında yavrular atılırlar. Dişi F1 yavru kuşaklar test ediliyorsa, bir batında az sayıda meydana gelen F2 yavru kuşakları ilave bir test için saklanır. Dişi yer değiştirme taşıyıcıları, kendi erkek döllerindeki yer değiştirmelerin sitogenetik analiziyle doğrulanırlar. XO-dişileri kendi yavru kuşakları arasındaki cinsiyet oranlarındaki 1:1 ‘den 1:2’ye erkek vs. dişi şeklindeki değişiklikle, seçilirler. Sıralı bir işlemde ilk F2 yavru normal değere ulaşır veya normal değeri geçerse, normal Fl hayvanları daha sonraki testlerden alıkonulurlar, aksi takdirde ikinci veya üçüncü F2 yavru gözlenir.
Üç F2 batına kadar gözlem yapıldıktan sonra, normal olarak sınıflandırılamayan F1 hayvanları ya dişi dölyatağı içeriği analiziyle ilave testlere tabi tutulurlar ya da doğrudan sitogenetik analiz yapılır.
Döl yatağı (uterus) içeriğinin analizi: Yer değiştirme taşıyıcılarının bir batındaki yavru sayısındaki düşüş embriyonik ölümlere bağlıdır. Bu yüzden ölü implantların çok sayıda olması test edilen hayvanlarda yer değiştirme varlığının göstergesidir. Test edilecek F1 erkeklerinin her biri iki ya da üç dişiyle çiftleştirilirler. Gebe kalma her gün sabahları vajinal kapakçığın kontrolü yapılarak saptanır. Dişiler, 14-16 gün sonra gözden çıkartılırlar ve döl yataklarındaki canlı ve ölü implantlar kaydedilir.

2. 
   Hücre genetiği analizi (sitogenetik analiz)
   

Testis preparatları hava ile kurutma tekniğiyle yapılır. Yer değiştirme taşıyıcıları birincil spermatositlerde diyakinezi-metafaz I’deki çok değerlikli konfigürasyonların varlığıyla tanımlanır. En az iki çok değerlikli iki hücrenin gözlenmesi test hayvanının yer değiştirici taşıyıcısı olduğuna dair gerekli kanıtı sağlar.

Hiç üreme seçimi yapılmamışsa, bütün F1 erkekleri sitogenetik olarak incelenir. Erkek başına en az 25 diyakinezi-metafaz I hücresi mikroskobik olarak sayılmalıdır. Spermatogonlarda veya kemik iliğinde mitotik metafazın incelenmesi küçük testisli ve diyakineziden önce mayotik kırılma gerçekleşen veya XO şühesi olan F1 dişilerinden olan F1 erkekleri için gereklidir. 10 hücrenin her birinde beklenmedik şekilde uzun ve/veya kısa kromozomların varlığı belirli erkek kısır yer değişikliği için kanıttır (c-t tipi).
Erkekte kısırlığa neden olabilen bazı X-otozom yer değiştirmeler, sadece mitotik kromozomların sarmal analizleriyle tanımlanabilirler. 10 mitozda da 39 kromozom bulunması, dişide XO varlığının kanıtıdır.

2. 
   VERİLER
   

Veriler tablo halinde sunulmalıdır.

Doğumda ve sütten kesildiğinde ortalama bir batındaki yavru sayısı ve ebeveyn (erkek-dişi) çiftleşmelerinden gelen cinsiyet oranları her bir çiftleşme aralığı için rapor edilir.
F1 hayvanlarının doğurganlıklarının değerlendirilmesi için, tüm normal çiftleşmelerin ortalama bir batındaki yavru sayısı ve F1 yer değiştirici taşıyıcılarının ayrı ayrı her bir batındaki yavru sayıları gösterilir. Döl yatağı (uterus) içeriğinin analizi için, normal çiftleşmelerin canlı ve ölü implantlarının ortalama sayısı ve her bir F1 yer değiştirme taşıyıcısı için canlı ve ölü implantların ayrı ayrı sayısı rapor edilir.
diyakinezi-metafaz I’in sitogenetik analizleri için, çok değerlikli konfigürasyon tiplerinin sayısı ve hücrelerin toplam sayısı her bir yer değiştirme taşıyıcısı için listelenir.
Kısır F1’lerin her biri için, toplam çiftleşme sayısı ve çiftleşme süreleri rapor edilir. Testis ağırlıkları ve sitogenetik analiz belirtilir.
XO dişileri için, ortalama bir batındaki yavru sayısı, F1 yavru kuşak cinsiyet oranı ve sitogenetik analiz sonuçları rapor edilir.
Uygun yerlerde F1 yer değiştirici taşıyıcıları doğurganlık testleriyle önceden seçilirler. Tabloların bunların kaçının onaylanmış yer değiştirme heterozigotu olduğuna dair bilgileri içermesi gerekir.
Negatif kontroller ve pozitif kontrol deneylerinden elde edilen veriler rapor edilmelidir.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:

• 
  farelerin ırkı, hayvanların yaşı, muamele edilen hayvanların ağırlıkları,
  
• 
  deney ve kontrol gruplarında her bir cinsiyete ait ebeveyn (anne-baba olarak) hayvan sayısı,
  
• 
  test koşulları, muamelenin detaylı tarifi, dozlar, çözücüler, çiftleşme programı,
  
• 
  dişi başına düşen, döl sayısı ve cinsiyeti, yer değiştirme analizi için yetiştirilen döl sayısı ve cinsiyeti
  
• 
  yer değiştirme analizlerinin süresi ve kriterleri
  
• 
  yer değiştirme taşıyıcılarının sayısı ve açıklamalı tarifi, üreme ile ilgili veriler ve döl yatağı (uterus) içeriği verileri dahil, eğer uygulanabiliyorsa,
  
• 
  sitogenetik işlemler ve mikroskobik analizlerin detayları, tercihen resimleriyle,
  
• 
  istatistiksel değerlendirme
  
• 
  sonuçların tartışılması
  
• 
  sonuçların yorumlanması.
  

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

4. 
   KAYNAKLAR
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

B.26. SUB-KRONİK ORAL TOKSİSİTE TESTİ - KEMİRGENLERDE TEKRARLANAN DOZDA 90 – GÜNLÜK ORAL TOKSİSİTE ÇALIŞMASI

1. 
   YÖNTEM
   

Bu sub-kronik oral toksisite test yöntemi OECD TG 408 (1998)’e eşdeğerdir.

1. 
   Giriş
   

Kimyasalın toksik özelliklerinin değerlendirilmesi ve yorumlanmasında, tekrarlı dozlar verilerek sub-kronik oral toksisite belirlenmesi, akut veya 28-gün tekrarlı doz toksisite testlerinden kimyasalın toksisitesi hakkında başlangıç bilgisi elde edildikten sonra yapılmalıdır. 90 günlük çalışma sütten kesilme sonrası olgunlaşma ve yetişkinliğe ulaşıncaya kadarki büyümeyi de içine alan uzun bir zaman aralığında tekrarlı maruz kalmadan kaynaklanabilecek olası sağlık tehlikeleriyle ilgili bilgi sağlar. Çalışma ana toksik etkiler hakkında bilgi sağlayarak, hedef organlara ve birikim olasılığına işaret eder ve kronik çalışmalar için dozların belirlenmesinde ve insanın maruz kalması durumlarında, güvenlik kriterlerinin oluşturulmasında kullanılan, hiçbir olumsuz etkinin gözlenmediği dozun tahmin edilmesini sağlar.

Yöntem, nörolojik sonlanma noktaları üzerinde ilave vurgulara işaret eder ve bağışıklık sistemiyle ilgili etkilerle, üreme üzerindeki etkilere dikkat çeker. Hayvanların klinik gözlemlerinin dikkatlice yapılmasının gerekliliği, dolayısıyla mümkün olduğunca fazla bilginin elde edilmesi ayrıca vurgulanır. Bu çalışma, kimyasalların ileride daha detaylı araştırmaların yapılmasına ön ayak olacak olan nörotoksik (sinir sistemi üzerinde toksisite gösteren), immunolojik (bağışıklık sistemi üzerinde etki gösteren) veya üreme organı etkilerinin tanımlanmasına olanak sağlamalıdır.
Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Doz: Uygulanan test maddesinin miktarıdır. Doz ağırlık (g, mg) veya test hayvanının birim ağırlığı başına düşen test maddesi ağırlığı (örneğin, mg/kg) veya sabit diyet derişimi olarak (ppm) ifade edilir.

Dozaj: doz, doz frekansı ve doz uygulanma süresini içine alan genel ifadedir.
NOAEL: Olumsuz etkinin gözlemlenmediği seviye.

3. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Test maddesi deney hayvanlarının muhtelif gruplarına oral yolla kademeli dozlarla, grup başına bir doz olacak şekilde, 90 gün boyunca uygulanır. Uygulama süresi boyunca hayvanlar toksisite belirtileri için yakından gözlenirler. Test sırasında ölen ya da öldürülen hayvanlara otopsi yapılır, ayrıca testin sonunda sağ kalan hayvanlar öldürülürler ve onlara da otopsi yapılır.

4. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Hayvanların hazırlanması
   

Laboratuvar koşullarına en az 5 gün uyum sağlamış sağlıklı hayvanlar ve daha önceden deneysel işlemlere maruz kalmayan, hayvanlar kullanılmalıdır. Test hayvanları tür, ırk, kaynak, cinsiyet, ağırlık ve/veya yaşlarına göre karakterize edilmelidirler. Hayvanlar kontrol ve uygulama gruplarına rastgele ayrılırlar. Kafesler, yerleştirilmelerinden meydana gelebilecek olası etkiler en aza indirilecek şekilde ayarlanmalıdır. Her hayvana kendisine özgü bir kimlik numarası verilmelidir.

2. 
   Dozların hazırlanması
   

Test maddeleri sonda veya diyetle veya içme suyuyla uygulanır. Oral (ağız yolu ile) uygulama yöntemi bu çalışmanın amacına ve test maddesinin fiziksel/kimyasal özelliklerine bağlıdır.Gerekli olduğunda test maddesi çözülür veya uygun bir taşıyıcıda süspansyon haline getirilir. Uygun olan her yerde sulu çözelti/süspansiyon kullanımının ilk önce düşünülmesi tavsiye edilir, bunu yağda (örneğin, mısır yağı) çözelti/emülsiyon (dağılma şeklinde) kullanımı ve diğer taşıyıcılardaki olası çözelti kullanımı izler. Su dışındaki taşıyıcıların toksik özellikleri bilinmelidir. Test maddesinin uygulama koşullarındaki kararlılığı belirlenmelidir.

3. 
   Test koşulları
   

1. 
   Deney hayvanları
   

Tercih edilen tür sıçandır, ancak fare gibi diğer kemirgen türleri de kullanılabilir. Yaygın olarak kullanılan sağlıklı,genç,yetişkin laboratuvar suşlarına uygulama yapılır. Dişiler doğum yapmamış olmalı ve hamile olmamalıdırlar. Dozun uygulanması mümkün olabildiğince memeden kesildikten sonra başlamalıdır ve her koşulda hayvanlar 9 haftalıktan daha genç olmalıdırlar. Çalışmanın başında kullanılan hayvanların ağırlık değişiklikleri en az seviyede olmalı ve her cinsiyetin ortalama ağırlığının %20’sini geçmemelidir. Çalışma uzun süreli bir kronik toksisite çalışmasının ön çalışması olarak yürütülüyorsa, her iki çalışmada da aynı ırk ve kaynaktan hayvanlar kullanılmalıdır.

2. 
   Sayı ve cinsiyet
   

Her bir doz için en az 20 hayvan (on dişi ve on erkek) kullanılmalıdır. Arada da hayvan öldürülmesi planlanıyorsa, çalışma tamamlanmadan önce,öldürülmesi planlanan hayvan sayısı artırılmalıdır. Bir kimyasal ya da yakın bir benzeri ile ilgili daha önceki bilgilere dayanılarak, uygulama süresi sonrasında toksik etkilerin tersinirlikleri veya kalıcılıklarının gözlenebilmesi için kontrol ve en yüksek doz grubu için 10 (cinsiyet başına beş) hayvandan oluşan ilave bir ikincil grubun yer alması üzerinde düşünülmelidir. Muamele sonrasındaki bu sürenin uzunluğu gözlenen etkilere bağlı olarak uygun şekilde sabitlenmelidir.

3. 
   Doz
   

Sınır testinin yürütüldüğü durumlar haricinde (bakınız 1.4.3.4), en az üç doz ve eş zamanlı kontrol kullanılır. Doz seviyeleri tekrarlı doz veya aralık bulma çalışmalarının sonuçlarına dayanabilir ve test bileşiğinin veya ilgili materyallerin metabolizması veya toksiko kinetiğiyle ilgili ilave bilgiler de dikkate alınmalıdır. Test maddesinin fizikokimyasal doğası veya biyolojik etkileri tarafından sınırlanmadıkça, seçilecek en yüksek doz toksisiteye sebep olmalıdır fakat ölüm ve şiddetli rahatsızlıklara sebep olmamalıdır. Doz seviyelerinin azalan dizisi dozlamaya bağlı cevap veya olumsuz etkinin gözlemlenmediği seviye (NOAEL) gösterecek şekilde seçilmelidir. İki –dört kat aralıklar azalan doz seviyeleri için genelde en uygunudur ve dördüncü bir test grubunun ilave edilmesi, doz grupları arasında geniş aralıklar kullanılmasına (örneğin, 6-10 kattan daha fazla) genellikle tercih edilir. Kontrol grubu, muamele edilmemiş bir kontrol grubu olmalı veya test maddesi uygulanırken taşıyıcı kullanılmışsa taşıyıcı-kontrol grubu olmalıdır. Test maddesiyle muamele edilenler hariç, kontrol grubundaki hayvanlar test grubundakilerle eşit koşullarda bulunmalıdır. Taşıyıcı kullanılmışsa, kontrol grupları kullanılan en yüksek hacimdeki taşıyıcıyı almalıdır. Test maddesi diyetle uygulanır ve gıda alımının azalmasına neden olursa, sonrasında bir çiftin beslendiği kontrol grubunun kullanılması test modelindeki toksikolojik değişikliklere bağlı azalmaların ayırt edilmesi açısından faydalı olabilir.

Taşıyıcı ve diğer katkı maddelerinin: absorpsiyon, dağılım, metabolizma veya test maddesinin alıkonması üzerine etkiler, test maddesinin toksik özelliğini değiştirebilecek olan kimyasal özellikleri üzerine etkiler veya gıda ve su tüketimi veya hayvanların beslenme durumu üzerine etkiler gibi karakteristik özellikleri göz önüne alınmalıdır.

4. 
   Sınır testi
   

Bir test tek bir dozda, en az 1000 mg/kg vücut ağırlığı/gün’e eşdeğer, çalışma için tanımlanan yöntemler kullanılarak, hiçbir olumsuz etkinin gözlenmediği durum meydana geliyorsa ve yapısal olarak benzer maddelerle ilgili verilere dayanılarak toksisite beklenmiyorsa, o zaman üç doz kullanılarak yürütülen tam bir çalışmanın yapılmasına gerek duyulmayabilir. Sınır testi, insan maruz kalımının daha yüksek bir dozun kullanılması gerekliliğine işaret ettiği durumlar haricinde uygulanır.

5. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Dozların uygulanması
   

Hayvanlar test maddesiyle 90 gün boyunca haftanın her günü muamele edilerek doza maruz bırakılırlar. Başka bir doz kürü, örneğin haftada beş gün, kullanılacaksa gerekçelendirilmelidir. Test maddesi sondayla uygulanması tek doz olarak, gavaj yöntemi kullanılarak ve uygun entübasyon kanülüyle yapılır. Tek seferde uygulanabilecek olan maksimum sıvı hacmi, test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. Sulu çözeltiler için 2 ml/100g vücut ağırlığının kullanılması haricinde, hacim 1 ml/100g vücut ağırlığını geçmemelidir. Normalde daha yüksek konsantrasyonlarda şiddetli etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için konsantrasyonun tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla test hacmindeki değişkenler en aza indirilmelidir.

Diyet veya içme suyuyla uygulanan maddeler için, test maddesi içeriğinin, miktarlarının normal beslenme veya su dengesiyle etkileşmediğinin garanti edilmesi önemlidir. Test maddesi ya sabit diyet konsantrasyonu (ppm) ya da hayvanların vücut ağırlığı üzerinden kullanılabilen sabit doz olarak uygulandığında, kullanılan alternatif belirtilmelidir. Sondayla uygulanan maddeler için, doz her gün yakın zamanlarda verilmelidir ve hayvan vücut ağırlığına dayanarak sabit doz elde etmek için gerektiği şekilde ayarlanmalıdır. 90-günlük bir çalışma uzun süreli bir kronik toksisite çalışmasının hazırlık aşaması olarak kullanılıyorsa, her iki çalışmada da benzer diyetler kullanılmalıdır.

2. 
   Gözlemler
   

Gözlem süresi en az 90 gün olmalıdır. İkincil gruptaki takip eden gözlemler için planlanan hayvanlar uygun bir süre daha herhangi bir muamele yapılmadan, kalıcı toksik etkiler veya toksik etkilerin düzelme durumu için gözlem altında tutulmalıdır. Genel klinik gözlemler, günde en az bir defa tercihen günün aynı zamanlarında ve doz uygulamasından sonraki beklenen etkilerin pik süreleri göz önünde bulundurularak yapılmalıdır. Hayvanların klinik koşulları kaydedilmelidir. Günde en az iki defa, genellikle çalışmanın başında ve sonunda, tüm hayvanlar hastalık ve ölüm belirtileri için incelenirler. İlk maruz kalımdan önce bir kere (karşılaştırılmalarına olanak sağlar) ve daha sonra da haftada en az bir defa, tüm hayvanlara detaylı klinik gözlemler yapılmalıdır. Bu gözlemler kafeslerin dışındaki standart bir ortamda tercihen her seferinde aynı zamanda yapılmalıdır. Gözlemler dikkatlice, tercihen test uygulama laboratuvarı tarafından açıkça anlatılan skorlama sistemleri kullanılarak kaydedilmelidir. Test koşullarındaki değişimlerin en az olması ve gözlemlerin tercihen gözlemciler tarafından yapıldığının garanti edilmesi için çaba gösterilmelidir. Not alınan belirtiler ciltteki, kürkteki, gözlerdeki, mukoz (sümüksü) membranlardaki değişiklikleri, salgılama başlaması, atılım ve otonomik aktiviteyi (lakrimasyon, piloereksiyon (çoklu kasılma), gözbebeği büyüklüğü, solunumla ilgili olağan dışı durumlar) içermeli ancak bunlarla sınırlı olmamalıdır.Yürüyüşteki değişiklik, duruş ve klonik veya tonik hareketlerin varlığı yanında dokunmaya cevap, stereotipler (kendi kendini temizleme, rutin olarak kendi etrafında dönme) veya tuhaf davranışı (örneğin kendini sakatlama, geriye doğru yürüme) ayrıca kaydedilmelidir (1).

Oftalmoskop (gözlerin incelenmesi için kullaınlan sistem) ve eşdeğeri uygun bir alet kullanılarak yapılan oftalmolojik (göze bağlı) incelemeler test maddesine maruz kalımdan önce ve çalışma sonlandırılırken, tercihen tüm hayvanlara ancak en azından yüksek doz ve kontrol grubundakilere yapılmalıdır. Gözlerde değişikliğe rastlanırsa, tüm hayvanlar incelenmelidir.
Maruz kalma süresinin sonuna doğru ve her koşulda 11 haftadan erken olmayacak şekilde, farklı yaklaşımları uyarıcı duyusal reaktivite (1) (örneğin, işitsel, görsel ve propriyoseptif uyarı) (2), (3), (4), kavrama gücünün değerlendirilmesi (5) ve motor aktivite değerlendirmesi (6) yapılmalıdır. Yöntemlerle ilgili takip edilecek daha fazla ayrıntı ilgili kaynaklarda verilmiştir. Ancak kaynaklarda belirtilenler dışında da alternatif yöntemler kullanılabilir. Çalışmanın sonuna doğru yürütülen fonksiyonel gözlemler, diğer çalışmalardan elde edilmiş veriler varsa ve günlük klinik gözlemler herhangi bir fonksiyonel bir zarar ortaya çıkarmazlarsa, ihmal edilebilir.

İstisnai olarak, fonksiyonel gözlemler ayrıca aksi takdirde fonksiyonel test performansıyla anlamlı olarak etkileşecek boyutta toksisite belirtileri gösteren gruplar için de ihmal edilebilir.

1. 
   Vücut ağırlığı ve gıda/su tüketimi
   

Bütün hayvanlar en az haftada bir kez tartılmalıdırlar. Gıda ve su tüketimiyle ilgili ölçümler en az haftada bir yapılmalıdır. Test maddesi içme suyuyla uygulanıyorsa, su tüketimi ayrıca en az haftada bir ölçülmelidir. Su tüketimi ayrıca içme aktivitesinin değiştiği beslenme veya sonda ile besleme çalışmalarında da göz önünde bulundurulmalıdır.

2. 
   Hematoloji ve klinik biyokimya
   

Uygulanabiliyorsa kan örnekleri, uygun koşullar altında adı belirtilen bölgeden alınmalı ve saklanmalıdır. Test süresinin sonunda kan örnekleri hayvanların öldürülmelerinden hemen önce ya da öldürme işleminin bir parçası olarak alınırlar. Test süresinin sonunda ve ara kan örnekleri alındıktan sonra: Hematokrit, hemoglobin derişimi, eritrosit sayımı, toplam ve türevsel lökosit sayısını ve pıhtılaşma süresi, platelet sayımı ve pıhtılaşma zaman/potansiyel ölçümü gibi hematolojik incelemeler yapılmalıdır.

Dokulardaki, özellikle de böbrek ve karaciğerdeki, temel toksik etkileri araştırmak için her bir hayvandan öldürülmelerinden hemen önce ya da öldürme işleminin bir parçası olarak (ölmek üzere bulunanlar ve/veya çalışma arasında öldürülenlerden başka) alınan kan örneklerinde klinik biyokimya tayinleri yapılmalıdır. Hematolojik incelemelere benzer şekilde, biyokimyasal testler için ara örnekler alınması söz konusu olabilir. Hayvanlardan kan numunesi alınmadan önceki gece aç bırakılmaları tavsiye edilir¹. Plazma ve serumdaki incelemelere sodyum, potasyum, glikoz, toplam kolesterol, üre, kan üre azotu, kreatin, toplam protein ve albumin ve hepatoselüler etkilerin göstergesi olan ikiden fazla enzim (alenin amino transferaz, aspartat amino transferaz, alkalin fosfataz, gama glutamil transpeptidaz ve sorbitol dehidrogenaz gibi) dahildir. İlave enzimler (hepatik veya diğer kaynaklı) ve safra asiti bazı durumlarda faydalı bilgi sağladıklarından dolayı ayrıca incelenebilir.
İsteğe bağlı olarak, görüntü, hacim, osmolite veya özgül ağırlık, pH, protein, glikoz ve kan/kan hücreleri üriner analiz belirlemeleri çalışmanın son haftasında zamana bağlı idrar hacmi toplamı kullanılarak yapılabilir. İlaveten, genel doku hasarlarının serum göstergelerini araştırmak için de çalışmalar yapılmalıdır. Maddenin bilinen özellikleri kalsiyum, fosfor, açlık trigliseritleri, özel hormonlar, methemoglobin ve kolinesteraz gibi ilgili metabolik profilleri etkileyebiliyorsa ya da böyle bir şüphe varsa diğer belirlemeler yapılmalıdır. Bunların belli sınıftaki kimyasallar için veya duruma göre yapılması gerekir.
Sonuç olarak, türlere ve verilen bir maddenin gözlenen ve/veya beklenen etkisine bağlı olarak esnek bir yaklaşıma ihtiyaç vardır.
Geçmişe dayalı taban çizgisi verileri yetersizse, doz uygulamasına başlamadan önce hematolojik ve klinik biyokimya değişkenlerinin belirlenip belirlenmemesi düşünülmelidir, genellikle bu verilerin muameleye başlamadan önce oluşturulması tavsiye edilmez (7)

3. 
   Tam teşekküllü otopsi
   

Çalışmadaki bütün hayvanlara tam teşekküllü otopsi yapılmalıdır. Buna, vücudun dış yüzeyindeki tüm ofirislerin ve kafatasının, göğüs ve karın boşluklarının ve bunların içeriklerinin incelenmesi dâhildir.

Tüm hayvanların karaciğer, böbrekler, adrenaller, testis, epididimis, mesane, yumurtalıklar, timus, dalak, beyin ve kalbi (ölmek üzere bulunanlar ve/veya çalışma arasında öldürülenlerden başka) yapışık dokulardan ayrılmalı, parçalara ayrıldıktan sonra kurumasından olabildiğince kaçınılarak ıslak ağırlıkları tartılmalıdır.
Aşağıdaki dokular her iki doku tipi için de uygun sabitleyici ortamda muhafaza edilmelidir. Sonrasında bütün büyük lezyonların, beyin (tipik bölgeler- medulla/pons, serebrum, serebellum), spinal cord (omurilik) (üç düzeyde - servikal, mid-torasik ve lumbar), hipofiz, tiroit/paratiroit, timus, özafagus, tükrük salgıları, mide, ince ve kalın bağırsak (Peyer plakları dahildir), karaciğer, pankreas, böbrekler, adrenal, dalak, kalp, trake, akciğerler aort, gonadlar, uterus, yardımcı cinsiyet organları, dişi meme bezi, prostat, idrar torbası, safra kesesi, lenf nodülleri (tercihen bir lenf nodülü uygulama yolunu kapsar, diğeri ise uygulama yolundan uzakta, sistemik etkileri kapsar), periferal sinir (siyatik veya tibiyal) tercihen kasa oldukça yakın kemik iliği kesiti (ve/veya taze kemik iliği aspiratı ), deri ve gözler (oftalmolojik inceleme sırasında değişiklik gözlenirse) histopatolojik incelemelerinin yapılması istenir. Klinik ve diğer bulgular başka dokuların da incelenmesi gerektiğini önerebilir. Ayrıca, test maddesinin bilinen özelliklerine dayanılarak hedef organ olabileceği düşünülen herhangi bir organ muhafaza edilmelidir.

4. 
   Histopatoloji
   

Yüksek doz grubunun ve kontrol grubunun muhafaza edilen organ ve dokularında tüm histopatolojik incelemeler yapılmalıdır. Yüksek doz grubunda muameleye bağlı değişikliler gözlenirse, bu incelemeler diğer dozlama gruplarına ait hayvanlarda da yapılmalıdır. Bütün büyük lezyonlar incelenmelidir. İkincil izleme grubu kullanılıyorsa, muamele edilen gruplarda etki gözlendiği belirlenen organların histopatolojik incelemeleri yapılmalıdır.

2.