FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B). B.33 BİRLEŞTİRİLMİŞ KRONİK TOKSİSİTE/KANSEROJENİTE TESTİ YÖNTEM
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B). B. 34. TEK NESİLLİ ÜREME TOKSİSİTESİ TESTİ YÖNTEM
VERİLER Veriler her bir test grubu için, testin başlangıcındaki hayvan sayısını, test sırasında tümör oluşumu gözlenen hayvan sayısını ve gözden çıkarılmayı takiben tümör bulunan hayvan sayısını gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Gözlenen tüm sonuçlar uygun bir istatistiksel yöntemle değerlendirilmelidir. Geçerli herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılabilir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Maruz kalma düzeneğinin tarifi: tasarım, tip, boyutlar, hava kaynağı, parçacık ve aerosol üreten sistem, havalandırma yöntemi, egzos havasının muamele edilmesi ve hayvanların test odacığında barınma yöntemi. Sıcaklık, nem ve uygun durumlarda aerosol konsantrasyonunun veya parçacık büyüklüğünün kararlılığını ölçme ekipmanı tarif edilmelidir. Maruz kalma verileri: çizelge haline getirilmeli ve ortalama değerler, değişkenlik ölçümü (ör. standart sapma) ve aşağıda belirtilenler dahil edilmelidir: (a) Soluma düzeneğindeki hava akış hızları (b) Havanın nemi ve sıcaklığı; (c) yazılı konsantrasyonlar (test maddesinin toplam miktarı, havanın hacmiyle bölünmüş solunum düzeneğine yedirilir.) (d) taşıyıcının yapısı, eğer kullanıldıysa; (e) test solunum bölgesindeki mevcut konsantrasyon (f) ortada bulunan parçacık büyüklüğü (uygun yerlerde),
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B). B.33 BİRLEŞTİRİLMİŞ KRONİK TOKSİSİTE/KANSEROJENİTE TESTİ
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Yok.
Birleştirilmiş kronik toksisite kanserojenite testinin amacı bir maddenin uzatılan maruz kalmayı takiben memeli türlerindeki kronik ve kanserojenik etkilerini belirlemektir. Bu amaçla kanserojenite testi en az bir muamele uydu grubu ve kontrol uydu grubuyla bütünlenir. Yüksek doz uydu grubu için kullanılan doz, kanserojenite testindeki yüksek doz grubundan daha fazla olabilir. Kanserojenite testindeki hayvanlar, kanserojenik cevap yanında genel toksisite için de incelenirler. Muamele edilen uydu grubundaki hayvanlar genel toksisite için incelenirler. Test maddesi, normalde çeşitli gruplardaki deney hayvanlarına, grup başına tek doz olacak şekilde haftanın yedi günü uygun bir yolla, yaşam sürelerinin önemli bir kısmında uygulanır. Test maddesine maruz kalma sırasında ve sonrasında, deney hayvanları toksisite belirtilerine ve tümör gelişmesine karşı günlük olarak gözlenirler.
Yok.
Hayvanlar testten en az beş gün öncesinden, deneysel beslenme ve barınma koşulları altında tutulurlar. Testten önce sağlıklı ve genç hayvanlar rastgele kontrol ve uygulama gruplarına ayrılırlar. Deney hayvanları Tercih edilen tür sıçandır. Daha önceki çalışma sonuçlarına dayanılarak diğer türler (kemirgen veya kemirgen olmayan) kullanılabilir. Yaygın olarak kullanılan genç sağlıklı laboratuar suşlarına uygulama yapılır ve doz uygulaması mümkün olduğunca sütten kesildikten hemen sonra başlamalıdır. Deneyin başında, hayvanlardaki ağırlık değişkenliği aralığı her iki cinsiyet için de, uygun ortalama değerin % 20’sini geçmemelidir. Subkronik bir solunum çalışması uzun süreli bir çalışmanın ön çalışması olarak yürütüldüğü zaman her iki çalışmada da aynı tür ve ırk kullanılmalıdır. Sayı ve cinsiyet Kemirgenlerde her bir doz ve eş zamanlı kontrol grubu için en az 100 hayvan (50 dişi ve 50 erkek) kullanılmalıdır. Dişilerin, doğum yapmamış (nulipar) olmaları ve hamile olmamaları gerekir. Eğer arada da hayvanların öldürülmesi planlanıyorsa, çalışma tamamlanmadan önce öldürülmesi planlanan hayvan sayısı artırılmalıdır. Tümör haricindeki patoloji değerlendirmeleri için uydu kontrol grupları cinsiyet başına 10 hayvan içerirken, muamele edilen uydu grup(lar) her bir cinsiyet için en az 20 hayvan içermelidir. Doz ve maruz kalma sıklığı Kanserojenite test uygulamaları için eş zamanlı kontrol grubuna ek olarak en az üç doz kullanılmalıdır. En yüksek doz tümör haricindeki etkilere bağlı olarak, normal yaşam süresini büyük ölçüde değiştirmeden, kilo almanın hafif baskılanması gibi çok az (%10’dan daha az) toksik etki oluşturmalıdır. En düşük doz hayvanın normal gelişimine, büyümesine ve ömrüne etki etmemeli veya herhangi bir toksisite belirtisi oluşturmamalıdır. Genelde, bu değer en yüksek dozun % 10’undan daha az olmamalıdır. Ara doz(lar), yüksek ve düşük doz arasında orta seviyede oluşturulmalıdır. Doz seviyelerinin seçiminde, önceki toksisite testlerinden ve çalışmalarından elde edilen sonuçlar dikkate alınmalıdır. Kronik toksisite test uygulama grupları için, muamele edilmiş ilave gruplar ve eş zamanlı bir kontrol uydu grubu testte yer almalıdır. Muamele edilen uydu grubundaki hayvanlar en yüksek dozda belirgin toksisite belirtileri göstermelidirler. Maruz kalma sıklığı normal şartlarda günlüktür. Eğer kimyasal, içme suyuyla veya besinle karıştırılarak veriliyorsa, bu sürekli olmalıdır. Kontroller Test maddesine maruz kalma dışında, uygulama gruplarına her hususta eşdeğer olan eş zamanlı bir kontrol grubu kullanılmalıdır. Aerosolleri kapsayan ağız yoluyla ya da biyolojik aktivitesi karakterize edilmemiş emülsifiyerin kullanıldığı gibi özel durumlarda , taşıyıcıya maruz kalmayan ek bir kontrol grubu ayrıca kullanılmalıdır. Uygulama yolu Üç ana uygulama yolu. oral(ağız yolu), dermal(deri yolu) ve inhalasyon(soluma yolu)’dur Uygulama yolunun seçimi test maddesinin fiziksel ve kimyasal özelliklerine ve insanlardaki benzer maruz kalma yoluna bağlıdır. Oral yolla ilgili çalışmalar Test maddesinin gastrointestinal yolla emildiği durumlarda ve yutma yolu insanların maruz kalabileceği yollardan biriyse, kontrendikasyon olmadığı sürece uygulamanın oral yolla yapılması tercih edilir. Hayvanlar test maddesini besinle, içme suyunda çözünmüş olarak veya kapsül şeklinde alabilirler. İdeal olarak haftada yedi gün günlük olarak doz uygulaması yapılır çünkü haftada beş gün doz verilmesi, doz verilmeyen sürede toksik etkilerin iyileşmesine ya da yok olmasına neden olabilir ve sonuçları, son değerlendirmeyi etkileyebilir. Ancak, pratik düşüncelere dayanarak haftada beş gün doz uygulamasının da kabul edilebilir olduğu düşünülmektedir. Dermal yolla ilgili çalışmalar Cilt lezyonlarınıntetiklenmesiiçin model sistem oluşturulması ve insandaki asıl maruz kalma yoluna benzemesi için, cilt boyanarak cilde ait maruz kalma seçilebilir. İnhalasyonla (solunumla) ilgili çalışmalar İnhalasyonla ilgili çalışmalar diğer uygulama yollarından daha karmaşık teknik problemler yarattığından, burada bu uygulama yoluyla ilgili detaylı bir rehber sunulmuştur. Özel durumlarda trake içi damlatmanın (damla damla akıtma) geçerli bir alternatif oluşturacağı not edilmelidir. Uzun süreli maruz kalmalar genellikle planlanmış insan maruz kalımına göre şekillendirilir, hayvanlara gerek günlük olarak odacığın dengeye ulaşmasından sonraki altı saat, haftanın beş günü (aralıklı maruz kalma) veya olası çevresel maruz kalma ile ilgili olarak haftada yedi gün, günde 22-24 saat (sürekli maruz kalma), yaklaşık olarak bir saat hayvanları günlük olarak besledikten sonra benzer zamanlarda ve odacığın içinde muamele yapılır. Her iki durumda da hayvanlar genellikle test maddesinin sabit konsantrasyonlarına maruz kalırlar. Aralıklı ve sürekli maruz kalma arasındaki temel fark, ilkinde hayvanların günlük maruz kalmasınınetkilerini iyileştirebilecekleri 17-18 saatlik, hatta hafta sonları için daha uzun bir süreye sahip olmalarıdır. Aralıklı veya sürekli maruz kalma seçimi çalışmanın amaçlarına ve benzerinin uygulanacağı insan maruz kalmasına bağlıdır. Ancak, belli teknik zorluklar göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin, çevresel koşullar için sürekli maruz kalmanın avantajları, maruz kalma sırasındaki beslenme ve su içme ihtiyacıyla, uygulanabilir daha karmaşık aerosol ve buhar ihtiyacıyla, izleme testleriyle dengelenebilir. Maruz kalma odacıkları Hayvanlar, yeterli oksijen içeriği ve eşit olarak dağılmış maruz kalma atmosferi temin etmek için saat başına en az 12 hava değişikliğinde dinamik hava akışı sağlamak amacıyla tasarlanmış soluma odacıklarında test edilmelidirler. Kontrol ve maruz kalma odacıklarının yapıları ve tasarımları, test maddesine maruz kalma dışındaki tüm hususlarda maruz kalma koşullarını karşılaştırılabilir kılmak için, eşdeğer olmalıdır. Test maddesinin etrafa akmasını engellemek amacıyla, genellikle, odacığın içinde hafif bir negatif basınç sağlanır. Odacıklar, test hayvanlarının sıkışmasını en aza indirmelidir. Genel bir kural olarak, odacığın atmosferinin kararlılığını sağlamak amacıyla test hayvanlarının toplam ‘hacimleri’ test odacığının hacminin % 5’ini geçmemelidir. Ölçümler ve izlemeler aşağıdaki gibi olmalıdır: (i) Hava akışı: Hava akışının odacık boyunca hızı tercihen sürekli izlenmelidir. (ii)Konsantrasyon: Günlük maruz kalma süresi boyunca test maddesinin konsantrasyonu, ortalama değerin +/- %15’inden daha fazla değişkenlik göstermemelidir. Bu çalışmanın toplam süresi boyunca, günlük konsantrasyonların uygulanabildiği kadar sabit olması sağlanmalıdır. (iii) Sıcaklık ve nem: kemirgenler söz kunusuysa, test maddesini askıda bırakmak için su kullanılan durumlar haricinde test atmosferinde sıcaklık 22 ± 2 °C derece ve nem oranı da % 30 ve %70 arasında olmalıdır. Tercihen her ikisi de sürekli izlenmelidir. iv) Parçacık büyüklüğü ölçümleri: parçacık büyüklük dağılımı sıvı veya katı aerosol içeren bir odacık ortamında tayin edilmelidir. Aerosol partikülleri kullanılan deney hayvanlarının soluyabileceği büyüklükte olmalıdır. Oda atmosferinden alınan örnekler hayvanların soluk alma bölgesinde olmalıdır. Hava örneği, hayvanların maruz kaldığı parçacık dağılımını yansıtmalı ve gravimetrik temelde askıda kalan tüm aerosolleri, hatta solunabilir olmayanları bile açıklamalıdır. Parçacık büyüklüğü analizleri, aerosolün kararlılığını sağlamak için ve sonrasında da maruz kalmalar sırasında gereken sıklıkta, hayvanların maruz kaldığı parçacık dağılımının tutarlılığını yeterli şekilde tayin etmek için. Çoğunlukla üretim sisteminin geliştirilmesi sırasında yürütülmelidir. Çalışmanın süresi Kanserojenite testinin süresi test hayvanlarının normal yaşam sürelerinin önemli bir kısmını içine alır. Testin sona erdirilme süresi fare ve hamster için 18 ay, sıçanlar için 24 ay olmalıdır ancak daha uzun yaşam süresine sahip ve/veya kendiliğinden tümör oluşturma oranı az olduğu bilinen belli hayvan suşları için, sonlandırma süresi fare ve hamster için 24 ay, sıçan için 30 ay olmalıdır. Alternatif olarak, böyle uzamış bir çalışmanın sonlandırılması kontrol veya en düşük doz grubundaki sağ kalan hayvanların sayısı % 25’e ulaştığı zaman kabul edilebilirdir. Cinsiyete bağlı farklı cevapların açık olduğu bir test sonlandırılırken her cinsiyet ayrı ayrı düşünülmelidir. Sadece yüksek doz grubundakilerin belirgin toksisite nedenleriyle zamanından önce öldüğü durumlarda, toksik oluşumların diğer gruplarda problem yaratmaması sağlandığında, bu durumun sonlandırmayı tetiklemesi söz konusu değildir. Negatif test sonuçlarının kabul edilebilir olması için, otoliz (hücrelerin, enzimler sayesinde kendi kendine parçalanması), yamyamlık veya yönetim problemlerine bağlı olarak herhangi bir grubun % 10’dan fazla kaybı olmamalı ve fare ve hamster için 18 ayda, sıçan için 24 ayda sağ kalımları tüm gruplarda % 50’den az olmamalıdır. Her bir cinsiyet için doz uygulanan 20 hayvandan ve cinsiyet başına ilişkili 10 kontrol hayvanından oluşan, kronik toksisite testlerinin uygulanması için kullanıl an bir uydu grup testte en az 12 ay bulunmalıdır. Bu hayvanların gerontolojik (ihtiyarlıkla ilgili) değişikliklerle karmaşık hale gelmemiş test maddesiyle ilgili patoloji incelemesi için gözden çıkarılma planları yapılmalıdır. İşlem Gözlemler Kafeslerin günlük olarak gözlenmelerine deri ve tüylerdeki, gözlerdeki, mukoz zardaki değişiklerin yanında, solunum, dolaşım, otonomik ve merkezi sinir sistemi, alt motor(somamotor) aktivite ve davranış durumları dâhildir. Muamele edilen uydu gruptaki hayvanların uygun aralıklarla klinik muayeneleri yapılmalıdır. Hayvanların düzenli olarak gözlenmeleri, hayvanların çalışmada yamyamlık, dokuların otolizi veya yanlış yerleştirilme nedeniyle kayıplarının olmamasının sağlanabilmesi için gereklidir. Ölmek üzere olan hayvanlar fark edildiğinde uzaklaştırılmalı ve hayvanlara otopsi yapılmalıdır. Nörolojik ve oküler değişiklikler, ölüm oranı dâhil tüm klinik belirtiler tüm hayvanlar için kaydedilmelidir. Tümör gelişimine özel önem verilmelidir: her bir gözle görünür büyüklükteki veya açıkça görülebilen tümörlerin ortaya çıkma zamanı; yeri, boyutları, görünüşü ve ilerlemesi kaydedilmelidir. Gıda tüketimi ölçümleri (ve madde içme suyuyla uygulanmışsa su tüketimi ölçümleri,) hayvanların sağlık durumu veya vücut ağırlığı değişiklikleri başka türlüsünün uygulanması gerektiğine işaret etmediği sürece çalışmanın 13 haftası boyunca haftalık olarak, sonrasında da yaklaşık üç aylık aralıklarla yapılmalıdır. Vücut ağırlıkları tüm hayvanlar için ayrı ayrı test süresinin ilk 13 haftasında haftada bir defa ve daha sonra da her dört haftada bir en az bir defa kaydedilmelidir. Klinik incelemeler (muayeneler) Hematoloji Hematolojik inceleme (ör. Hemoglobin içeriği; toplam hücre hacmi, toplam kırmızı kan hücresi, toplam beyaz kan hücresi, trombositler veya pıhtılaşma potansiyelinin diğer ölçümleri) üçüncü ayda, altıncı ayda ve sonrasında da yaklaşık altı aylık aralıklarla ve deney sonlandırılmadan önce yapılmalıdır. İncelemeler kemirgen olmayan hayvanlardan ve 10 sıçan/cinsiyet şeklinde tüm gruplardan alınan kan örneklerinde yapılır. Eğer mümkünse, örnekler her aralıkta aynı sıçanlardan alınmalıdır. Eğer kafesteki gözlemler çalışma sırasında hayvanın sağlığında bozulma olduğu işaret ederse, etkilenen hayvanların ayırıcı kan sayımları yapılmalıdır. Ayırıcı kan sayımı en yüksek doz grubundaki hayvanlarla ve kontrol hayvanlarından alınan örneklerde yapılır. Ayırt edici kan sayımı bir sonraki düşük doz grubu(grupları) için sadece en yüksek grup ve kontrol arasında büyük bir tutarsızlık varsa veya böyle bir durum patolojik bulgularla gösteriliyorsa yapılır. İdrar analizi İdrar örnekleri tüm kemirgen olmayan hayvanlardan ve 10 sıçan/cinsiyet şeklinde tüm gruplardan, eğer mümkünse, hematolojik incelemede olduğu gibi aynı aralıktaki aynı sıçanlardan analiz için toplanmalıdır. Aşağıdaki incelemeler her bir hayvan için ayrı ayrı ya da kemirgenler için bir araya getirilen örnek/cinsiyet/gruplarda yapılır: -görünüş: her bir hayvan için ayrı ayrı hacim ve yoğunluk, -protein, glukoz, keton, gizli kan (yarı-nicel), -sediment mikroskopisi (yarı-nicel). Klinik kimya Yaklaşık altı aylık aralıklarla ve testin sonunda, kan örnekleri klinik biyokimya incelemeleri için tüm kemirgen olmayan hayvan gruplarından ve 10sıçan/cinsiyet olacak şekilde, eğer mümkünse, her aralıkta aynı sıçanlardan alınır. Ek olarak, kemirgen haricindeki hayvanlardan ön hazırlık için de numune alınmalıdır. Plazma bu örneklerden hazırlanır ve aşağıdaki tayinler yapılır: -toplam protein konsantrasyon, -albumin konsantrasyon, -karaciğer fonksiyon testleri (alkalin fosfataz etkinliği, glutamik piruvik transaminaz 1 etkinliği ve glutamik okzaloasetik transaminaz2 etkinliği), gamma glutamil transpeptidaz, ornitin dekarboksilaz, -açlık kan şekeri gibi karbonhidrat metabolizması, -kan üre azotu gibi böbrek fonksiyon testleri. Nekroskopi (kapsamlı otopsi) Çalışmadaki deney sırasında ölenler ve ölmek üzere olup öldürülenler de dâhil bütün hayvanlara tam teşekküllü nekroskopi yapılmalıdır. Hayvanların gözden çıkarılmalarından önce, ayırıcı kan sayımı için tüm hayvanlardan kan örnekleri toplanmalıdır. Bütün büyük görülebilen doku bozulmaları, tümörler veya tümör şüphesi olan doku bozulmaları muhafaza edilmelidir. Büyük ölçekteki gözlemlerle mikroskobik bulgular arasında ilişki sağlanmasına çalışılmalıdır. Tüm organ ve dokular histopatolojik inceleme için muhafaza edilmelidirler. İncelenen doku ve organlar aşağıdaki gibidir: beyin (3) (ilik/dokular arası köprüler, beyincik zarı(serebellar korteks), beyin zarı(serebral corteks) ), hipofiz tiroit (paratiroit dahil), timus doku, akciğerler (trake dahil), kalp, aort, tükrük bezleri, karaciğer (1), dalak, böbrekler (1), adrenaller (1), özofagus, mide, oniki parmak bağırsağı(duodenum), ince bağırsak(jejunum), ince bağırsağın son bölümü(ileum), kör bağırsak (caecum), kolon, rektum, uterus, idrar kesesi, lenf nodülleri, pankreas, yumurtalıklar (1), yardımcı cinsiyet organları, dişi meme bezleri, deri, kas sistemi, periferal, sinir, spinal cord (boyna ait(servikal),göğse ait( toraks), bele ait(lumbar) ), kemik iliği ve kalça kemiği,göğüs kemiği (eklem dahil) ve gözler. Akciğerlerin şişirilmesi ve idrar kesesinin sabitleyiciyle muamele edilmesi bu dokuları muhafaza etmek için en iyi yoldur; solunum çalışmalarında akciğerlerin şişirilmesi uygun histopatolojik inceleme için önemlidir. Solunum çalışmaları gibi özel çalışmalarda burun, yutak ve gırtlak dahil tüm soluk alıp verme yolu muhafaza edilmelidir. Diğer klinik incelemeler yapıldığı takdirde, bu işlemlerden elde edilecek bilgiler mikroskobik incelemelerden önce elde mevcut olmalıdır çünkü bu bilgiler patologlar için anlamlı bir rehber olabilir. Histopatoloji Kronik toksisite test uygulamaları için: Yüksek doz uydu grubu ve kontrol grubundaki tüm hayvanların muhafaza edilen tüm organlarına detaylı inceleme yapılmalıdır. Yüksek doz uydu grubunda test maddesine bağlı patolojiye rastlanırsa, diğer uydu gruplarındaki tüm hayvanların hedef organları tam ve detaylı bir histopatolojik incelemeye tabi tutulmalıdır. Bunu yanında, aynı şekilde kanserojenite testi uygulama kısmındaki muamele gruplarının hedef organları da çalışmanın sonunda incelenmelidir. Kanserojenite testi uygulama kısmı için: (a) Test sırasında ölen veya gözden çıkarılan hayvanların organ ve dokularında ve kontrol ve yüksek doz grubundaki hayvanlara tam histopatolojik inceleme yapılmalıdır; (b) Herhangi bir organdaki bütün büyük gözle görülebilir tümörler veya tümör şüphesi olan doku bozulmaları mikroskop altında incelenmelidir. (c) Yüksek doz ve kontrol gruplarında neoplastik doku bozulmalarının görülüş sıklığı anlamlı bir değişiklik varsa, diğer ve gruplardaki ilgili organ veya dokularda histopatolojik inceleme yapılmalıdır. (d) Eğer yüksek doz gruplarındaki hayatta kalmalar, kontrol grubundakilerden daha azsa o zaman bir sonraki daha düşük doz grubu detaylı olarak incelenmelidir; (e) Yüksek doz grubunda toksik veya diğer etkilerin uyarıldığına dair belirtiler varsa, bu durum neoplastik cevabı etkiler, bir sonraki daha düşük doz grubu detaylı olarak incelenmelidir;
Veriler her bir test grubu için, testin başlangıcındaki hayvan sayısını, test sırasında tümör oluşumu veya toksik etki gözlenen hayvan sayısını ve gözlenme zamanını, gözden çıkarılmayı takiben tümör bulunan hayvan sayısını gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Gözlenen tüm sonuçlar uygun bir istatistiksel yöntemle değerlendirilmelidir. Bilinen herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılabilir
Test raporu, mümkünse, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Maruz kalma düzeneğinin tarifi: tasarım, tip, boyutlar, hava kaynağı, parçacık ve aerosol üreten sistem, havalandırma yöntemi, ekzos havasının muamele edilmesi ve hayvanların test odacığında barınma yöntemi. Sıcaklık, nem ve uygun durumlarda aerosol konsantrasyonun veya parçacık büyüklüğünün kararlılığını ölçme ekipmanı tarif edilmedilir. Maruz kalma verileri: çizelge haline getirilmeli ve ortalama değerler , değişkenlik ölçümü (ör. standart sapma) ve aşağıda belirtilenler dahil edilmelidir: (a) soluma düzeneğindeki hava akış hızları (b) havanın nemi ve sıcaklığı; (c) yazılı konsantrasyonlar (test maddesinin toplam miktarı, havanın hacmiyle bölünmüş solunum düzeneğine yedirilir.) (d) taşıyıcının yapısı, eğer kullanıldıysa; (e) test solunum bölgesindeki mevcut konsantrasyon (f) medyan parçacık büyüklüğü (uygun yerlerde),
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B). B. 34. TEK NESİLLİ ÜREME TOKSİSİTESİ TESTİ
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Yok.
Test maddesi kademeli dozlarda dişi ve erkeklerin bulunduğu çeşitli gruplara uygulanır. Erkekler büyümeleri süresince ve en az bir tam sperm oluşması döngüsü boyunca, test maddesinin sperm oluşması işlemi üzerindeki olumsuz etkilerini ortaya çıkarmak için (farelerde yaklaşık 56 gün, sıçanlarda 70 gün) doza maruz kalmalıdırlar. Anne babadan oluşan (P) neslin dişileri en az iki tam cinsellik aktivitesi durumu döngüsü boyunca test maddesinin cinsellik aktivitesi durumu üzerindeki olumsuz etkilerini ortaya çıkarmak için doza maruz kalmalıdırlar, Hayvanlar daha sonra çiftleştirilir. Test maddesi her iki cinsiyete de çiftleşme süresi boyunca uygulanır ve daha sonra sadece dişilere hamilelik ve emzirme süresi boyunca uygulanmaya devam edilir. Solunum yoluyla yapılan uygulamalarda yöntemin değişikliği gerekecektir.
Yok.
Hazırlıklar Testten önce sağlıklı genç yetişkin hayvanlar rastgele seçilir ve uygulama ve kontrol gruplarına ayrılırlar. Hayvanlar testin uygulanmasından önce en az beş gün deneysel barınma ve beslenme koşullarında tutulurlar. Test maddesinin diyet veya içme suyuyla uygulanması tavsiye edilir. Diğer uygulama yolları da ayrıca kabul edilebilir. Bütün hayvanlara uygun deneysel süreç boyunca aynı yöntemle doz verilmelidir. Doz uygulanmasını kolaylaştırmak için taşıyıcı veya başka bir katkı maddesi kullanılmışsa, bunların toksik etki oluşturmadığı bilinmesi gerekir. Doz uygulanması haftada yedi gün şeklinde olmalıdır. Deney hayvanları Türlerin seçimi Sıçan veya fare tercih edilen türlerdir. Önceden deneysel işlemlere maruz bırakılmamış sağlıklı hayvanlar kullanılmalıdır. Doğurganlığı az olan suşlar kullanılmamalıdır. Test hayvanları tür, ırk, cinsiyet, ağırlık ve/veya yaşa göre tanımlanmalıdır. Doğurganlıkla ilgili makul bir değerlendirme yapabilmek için, hem erkek hem de dişilerle çalışılmalıdır. Tüm test ve kontrol hayvanları doz uygulanmasına başlamadan önce memeden kesilmelidir. Sayı ve cinsiyet Her bir muamele ve kontrol grubu yeterli sayıda yaklaşık 20 hamile dişi olacak şekilde hayvan içermelidir. Amaç maddenin P nesli hayvanlarında doğurganlık, hamilelik ve anaç davranışlar üzerindeki potansiyelini ve gebeliğin başlamasından emzirmenin sonlanmasına kadar F1 dölü üzerindeki potansiyelini anlamlı şekilde değerlendirmek için yeterli sayıda hamilelik ve döl meydana getirmektir. Test koşulları Gıda ve içecek istenildiği kadar sağlanmalıdır. Doğuma yakın hamile dişiler ayrı ayrı gebelik ve doğum kafeslerine yerleştirilmelidirler ve yuva yapmak için gerekli malzemeler sağlanmalıdır. Doz seviyeleri En az üç muamele grubu ve bir kontrol grubu kullanılmalıdır. Eğer test maddesi uygulanırken bir taşıyıcı kullanılmışsa, kontrol grubu taşıyıcıyı kullanılan en yüksek hacimde almalıdır. Eğer test maddesi diyetle uygulanır veya kullanımının azalmasına neden olursa, sonrasında çift-beslenme kontrol grubunun kullanılmasının gerekli olduğu düşünülebilir. İdeal olarak, test maddesinin fiziksel/kimyasal doğası veya biyolojik etkileriyle sınırlanmadıkça, en yüksek doz toksisiteyi indüklemeli fakat parental (P) (ana-babaya ait) hayvanlarda ölüme (mortalite) neden olmamalıdır. Ara doz(lar) test maddesinin oluşturduğu en az seviyedeki toksisite etkileri neden olmalıdır ve düşük doz anne-baba veya döllerde herhangi bir gözlenebilir olumsuz etkiye neden olmamalıdır.Sonda veya kapsülle uygulandığında her bir hayvana verilen dozajlar her bir hayvanın ayrı ayrı vücut ağırlığına bağlı olmalı ve vücut ağırlığındaki değişikliklere göre haftalık olarak ayarlanmalıdır. Hamilelik boyunca dişiler için, eğer istenirse, dozajlar hamileliğin 0 ve 6. günlerindeki vücut ağırlığına dayanmalıdır. Sınır testi Düşük toksisiteye sahip maddeler söz konusu olduğunda, en az 1000 mg/kg vücut ağırlığı/gün’e eşdeğer doz, üreme performansıyla etkileşimi olduğuna dair herhangi bir iz bırakmazsa, diğer doz seviyeleriyle ilgili çalışmaların gerekli olmadığı düşünülebilir. Eğer yüksek doz seviyeleriyle ilgili başlangıç çalışmaları maternal toksisiteyle ilgili kesin kanıtlar meydana getiriyor fakat üreme üzerinde hiçbir olumsuz etki yaratmıyorsa, diğer doz seviyeleriyle ilgili çalışmaların gerekli olmadığı düşünülebilir. Testin performansı Deneysel program Parental (P) erkeklerin günlük doz uygulamaları yaklaşık beş-dokuz haftalıkken başlamalıdır. Bu süre zarfında hayvanlar sütten kesilmiş olmalı ve en az beş gün ortama alıştırılmalıdırlar. Sıçanlarda doz uygulaması çiftleşme döneminden önceki 10 hafta devam eder (fare için bu sekiz haftadır). Erkekler çiftleşme süresinin sonunda öldürülmeli ve incelenmelidir veya alternatif olarak, ikinci bir yavrunun meydana gelmesi olasılığına karşın testte tutulabilirler ve çalışma sonlanmadan öldürülmeleri ve incelenmeleri gerekir. Parental (P) dişiler için doz uygulaması en az beş gün alışma süresinden sonra başlamalıdır ve çiftleşmeden önce en az iki hafta devam etmelidir. P dişilerinin günlük doz uygulaması 3-haftalık çiftleşme süresi, hamilelik boyunca ve F1 dölü sütten kesilinceya kadar devam etmelidir. Test maddesinin biyolojik birikimi gibi var olan diğer bilgilere dayanılarak doz uygulama planının yeniden düzenlenmesi düşünülebilir. Çiftleşme işlemi Üreme toksisite çalışmalarında ya 1:1 (bir erkeğe bir dişi) ya da 1:2 (bir erkeğe iki dişi) şeklinde çiftleştirme kullanılabilir. 1:1 çiftleştirmesi esas alınarak, hamilelik gerçekleşinceye veya üç hafta geçinceye kadar bir dişi aynı erkekle yerleştirilir. Dişiler her sabah sperm veya vajinal tıkaç varlığı için incelenmelidir. Hamileliğin 0 ıncı günü, sperm veya vajinal tıkacınbulunduğu gün olarak tanımlanır. Yavrusu olmayan çiftler kısırlığın gözle görülür nedenini belirlemek için değerlendirilmelidir. Bu değerlendirmeye ispatlanmış diğer erkek ve dişilerle çiftleşme fırsatları, üreme organlarının mikroskop altında incelenmesi ve cinsellik aktivitesi durumu döngüsünün ve spermatogenezin incelenmesi gibi bazı işlemler dahildir. Yavru büyüklükleri Doğurganlık çalışması sırasında doz uygulanan hayvanların normal doğum yapmalarına ve yavrularını sütten kesilinceye kadar beslemelerine yavrular standardize edilmeden izin verilir. Standardizasyonun yapıldığı durumlarda aşağıdaki işlem önerilir. Doğumdan sonraki 1. ve 4. gün arasında her bir yavrunun büyüklüğü fazladan yavrular atılarak, mümkün olduğunca yavru başına dört erkek ve dört dişi olacak şekilde ayarlanır. Erkek ve dişi yavruların sayısının yavru başına her bir cinsiyetten dört adet olmasını engellediği durumlarda kısmi düzeltmeler (örneğin beş erkek ve üç dişi) kabul edilir. Sekizden daha az sayıda yavrular için düzeltme yapılması uygun değildir. Gözlemler Test süresi boyunca her bir hayvan günlük olarak en az bir defa gözlenmelidir. İlgili davranışsal değişiklikler, zor ve uzamış doğum belirtileri ve ölüm dâhil toksisitenin tüm belirtileri kaydedilmelidir. Çiftleşme öncesi ve çiftleşme sürelerinde, gıda tüketimi günlük olarak ölçülebilir. Doğum sonrasında ve süt salgılanması sırasındaki gıda tüketimi ölçümleri (ve test maddesi içme suyuyla verilmişse su tüketimi ölçümleri) yavruların tartıldığı aynı gün yapılmalıdır. P erkekleri ve dişileri dozun uygulandığı ilk gün ve sonrasında en az haftalık olarak tartılmalıdır. Bu gözlemler her bir yetişkin hayvan için ayrı ayrı rapor edilmelidir. Hamilelik süresi hamileliğin 0. gününden itibaren hesaplanmalıdır. Her yavru doğumdan hemen sonra yavruların sayı ve cinsiyetlerinin, ölü ve canlı doğumların ve büyük anomalilerin olup olmadığının belirlenmesi için incelenmelidir. Ölü yavrular ve 4üncü gün gözden çıkarılan yavrular olası bozukluklar için muhafaza edilir ve çalışılırlar. Canlı yavrular sayılmalı ve deney sonlandırılıncaya kadar yavrular doğumdan sonraki sabah ve 4. , 7. günlerde ve sonrasında da haftalık olarak ayrı ayrı tartılmalıdır. Dişilerde veya döllerde gözlenen fiziksel ve davranışsal anomaliler kaydedilmelidir. Patoloji Otopsi P nesli hayvanları çalışma boyunca gözden çıkarılma ve ölüm zamanlarında gözle görülerek yapısal anomalilere veya patolojik değişikliklere karşı, üreme sistemi organlarına özel önem verilerek incelenmelidir. Ölmüş veya ölmek üzere olan yavrular bozukluklar için incelenmelidir. Histopatoloji Bütün P hayvanlarının yumurtalık, uterus, serviks, vajina, testis, epididimis, seminal kese, prostat, pıhtılaşma bezleri, hipofiz bezleri ve hedef organları mikroskobik inceleme için muhafaza edilmelidir. Bu organların diğer çoklu doz çalışmalarında incelenmediği durumlarda, tüm yüksek doz ve kontrol grubuna ait hayvanların ve çalışma sırasında ölen hayvanların organları mikroskop altında incelenmelidir. Bu hayvanlar arasında anomali gösteren organlar diğer tüm P hayvanlarında incelenmelidir. Bu durumlarda, büyük patolojik değişiklik gösteren tüm dokular mikroskop altında incelenmelidir. Çiftleşme işlemlerinde tavsiye edildiği gibi kısırlık şüphesi olan hayvanların üreme organları da mikroskop altında incelenmelidir.
|