FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

RAPORLAMA

1. 
   Test raporu
   

Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir:

Test kimyasalı:

• 
  kimlik verileri ve CAS no., eğer biliniyorsa
  
• 
  fiziksel doğa ve saflık
  
• 
  çalışmayla bağlantılı fizikokimyasal özellikler
  
• 
  kararlılık ve fotokararlılık, eğer biliniyorsa
  

Çözücü:

• 
  çözücü seçimi için gerekçe
  
• 
  test kimyasalının bu çözücüdeki çözünürlüğü
  
• 
  uygulama ortamında bulunan çözeltinin yüzdesi (EBSS or PBS)
  

Hücreler:

• 
  hücrelerin türü ve kaynağı
  
• 
  mikoplazma yokluğu
  
• 
  hücre pasaj sayısı, eğer biliniyorsa
  
• 
  hücrelerin UVA duyarlılığı, in vitro 3T3’de kullanılan irradyasyon ekipmanıyla tayin edilir.
  

Test koşulları (a); muamele öncesinde ve sonrasında inkübasyon:

• 
  kültür ortamının türü ve kompozisyonu
  
• 
  inkübasyon koşulları (CO₂ konsantrasyon, sıcaklık, nem)
  
• 
  inkübasyon süresi (uygulama öncesi, uygulama sonrası)
  

Test koşulları (b); kimyasalla muamele:

• 
  UV/vis irradyasyonun hem varlığında hem de yokluğunda kullanılan test kimyasalı konsantrasyonlarının seçimi için gerekçe
  
• 
  test kimyasalının sınırlı çözünürlğü söz konusu olduğunda ve sitotoksisite gözlenmemişse, test edilen en yüksek konsantrasyon için gerekçe
  
• 
  muamele ortamının türü ve kompozisyonu (tampon tuz çözeltisi)
  
• 
  kimyasalla muamele süresi
  

Test koşulları (c) ;ışınlama:

• 
  kullanılan ışık kaynağı için gerekçe
  
• 
  ışık kaynağının spektral irradyans karakteristiği
  
• 
  kullanılan filtrelerin transmisyon / absorpsiyon
  
• 
  radyometrenin karakteristiği ve kalibrasyonuyla ilgili detaylar
  
• 
  ışık kaynağının test sisteminden uzaklığı
  
• 
  bu mesafedeki UVA irradyansı, mW/cm²n olarak ifade edilir.
  
• 
  UV/vis ışığa maruz kalma süresi
  
• 
  UVA dozu (irradyans zaman), J/cm²ile ifade edilir
  
• 
  irradyasyon sırasında hücre kültürlerine ve eş zamanlı olarak karanlıkta tutulan hücre kültürlerine uygulanan sıcaklık
  

Test koşulları (d); NRU testi

• 
  NR ortamının kompozisyonu
  
• 
  NR inkübasyon süresi
  
• 
  inkübasyon koşulları (CO₂ konsantrasyonu, sıcalık, nem)
  
• 
  NR ekstraksiyon koşulları (ekstraktant, süre)
  
• 
  optik yoğunluğunun spektrofotometrik okumaları için kullanılan dalga boyu
  
• 
  ikinci dalga boyu (referans), eğer kullanıldıysa
  
• 
  eğer kullanıldıysa, spektrofotometrik körün içeriği
  

Sonuçlar

• 
  test kimyasalının her bir konsantrasyonunda elde edilen hücre yaşama kabiliyeti, kontrollerin ortalama yaşayabilirlik yüzdesi olarak ifade edilir
  
  • 
    konsantrasyon cevap eğrisi (test kimyasal konsantrasyonu vs. bağıl hücre yaşama kabiliyeti), eş zamanlı olarak +UVA ve –UVA deneylerinden elde edilir
    
  • 
    konsantrasyon cevap eğrisi verilerinin analizleri: eğer mümkünse EC₅₀ (+UVA) ve EC₅₀ (-UVA)’nın hesaplama zamanı/hesaplanması
    
• 
  Foto İritasyon Faktörü (PIF) ya da Ortalama Foto Etki (MPE) hesaplanarak UVA/vis irradyasyonun varlığında ve yokluğunda elde edilen iki konsantrasyon-cevap eğrisinin karşılaştırılması,
  
• 
  fototoksik potansiyelin sınıflandırılması
  
• 
  testin kabul edilme kriterleri (a), eşzamanlı negatif kontrol:
  
• 
  ışınlanmış ve ışınlanmamış hücrelerin bağıl yaşama kabiliyeti (NR ekstraktının optik yoğunluğu)
  
• 
  negatif kontrolün geçmişe dayalı verileri, ortalama ve satandart sapma
  
• 
  testin kabul edilme kriterleri (b), eşzamanlı pozitif kontrol:
  
• 
  pozitif kontrol kimyasalının EC₅₀ (+UVA) ve EC₅₀ (-UVA) ve PIF değerleri
  
• 
  pozitif kontrol kimyasalının geçmişe dayalı verileri: EC₅₀(+UVA) ve EC₅₀(-UVA) ve PIF, ortalama ve Standart sapma
  

Sonuçların tartışılması.

Yorumlar.

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L’Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W. and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxicology in Vitro 8, 793-796.
   
2. 
   Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test forphototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, 7-8.
   
3. 
   Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W and Brantom, P. (1998) EU/COLIPA "In vitro phototoxicity" validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxicology in Vitro 12, 305-327.
   
4. 
   OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods – OECDPublications O ffice, Paris, 1996.
   
5. 
   Lovell W. W. (1993). A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential. Toxicology in Vitro 7, 95-102.
   
6. 
   Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic substances. In "Research progress in organic, biological and medicinal chemistry" Vol. 3 part 1. North Holland Publishin g Co, Amsterdam, pp. XI-XXXV.
   
7. 
   Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2. ATLA 22, 314-348.
   
8. 
   Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In "The science of photobiology"; edited by KC Smith. Plenum Press, New York; 2nd edition, pp. 79-110.
   
9. 
   Borenfreund, E. and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters 24, 119-124.
   
10. 
    Lambert L. A, Warner W.G. and Kornhauser A. (1996). Animal models for phototoxicity testing. In “Dermatotoxicology”; edited by FN Marzulli and HI Maibach. Published by Taylor & Francis, Washington DC; 5th Edition, pp. 515 -530.
    
11. 
    Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987). Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes. Cancer Research 47, 1825-1829.
    
12. 
    ZEBET / ECVAM / COLIPA - Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test. Drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project "In Vitro Photoirritation".
    
13. 
    Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998). A Study on the Phot otoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phot otoxicity Test. ATLA 26, 679-708.
    
14. 
    Holzhütter, H.G. and Quedenau, J. (1995) Mathematical modelling of cellular responses to external signals. Journal of Biological Systems 3, 127-138.
    
15. 
    Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA 25, 445 -462.
    

Ek-I


B.42. CİLT DUYARLILIĞI: BÖLGESEL LENF DÜĞÜMÜ YÖNTEMİ

1. 
   YÖNTEM
   

Bu yöntem OECD TG 429 (2002)’ye eşdeğerdir.

1. 
   Giriş
   

Bölgesel Lenf Düğümü Yönteminin (LLNA) geçerliliği onaylanmış ve uyarlanmış hali yeni bir yöntem olarak kabul edilmiştir (1)(2)(3). Hayvanlarda cilt hassasiyeti potansiyelinin tayini için kullanılan ikinci yöntemdir. Diğer yöntemde (B.6) kobay testleri özellikle de kobay maksimizasyon testi ve Buehler testi (4) kullanılır.

LLNA ciltte hassasiyet oluşturan kimyasalların belirlenmesi için alternatif sunar ve ciltte hassasiyete neden olma potansiyelinden yoksun kimyasalların saptanmasını sağlar. Bu durum, LLNA’nın tüm koşullarda kobay testi yerine kullanılabileceği anlamına gelmez fakat eşit değerdeki yönteme tercih edilir ancak pozitif ve negatif sonuçların genellikle daha fazla doğrulanmaya gerek olmadığını gösterdiği durumlarda alternatif olarak uygulanabilir.
LLNA gerek bilimsel ilerleme açısından gerek hayvan refahı açısından belli avantajlar sağlar. Cilt hassasiyetinin indüksiyon fazını çalışılır ve doz cevap değerlendirmesi için uygun nicel veriler sağlanır. LLNA’nın geçerliliği ile ilgili detaylar ve ilgili çalışmayla ilgili bir derleme yayınlanmıştır (5)(6)(7)(8). İlaveten, kobay test yöntemleri için uygun pozitif kontrol madde olarak tavsiye edilen ılımlı/orta şiddette hassaslaştırıcıların, LLNA’da kullanımların uygun olduğu da ayrıca not edilmelidir (6)(8)(9).
LLNA in vivo bir yöntemdir ve bu sebeple temas hassaslaştırıcı aktivitenin değerlendirilmesinde hayvan kullanımı kaçınılmazdır. Ancak, bu amaç için gereken hayvan sayısını azaltma potansiyeli vardır, ayrıca hayvanların temas hassasiyet test uygulamalarında kullanıldığı yol için önemli bir iyileştirme önerir. LLNA hassasiyetin harekete geçirilmesi fazı boyunca kimyasallarla uyarılan immünolojik olayları göz önünde bulundurulmasına dayanır. Kobay testinden farklı olarak LLNA’da deride aşırı duyarlılık reaksiyonlarının ortaya çıkması gerekmez. Ayrıca, LLNA’da kobay maksimizasyon testinde olduğu gibi adjuvan kullanılmasına gerek yoktur. Bu nedenle LLNA hayvanların acı, stres çekmesini azaltır. LLNA’nın geleneksel kobay testlerinden daha fazla avantajı olmasına rağmen, geleneksel kobay testlerinin kullanımını gerektirecek belli sınırlamaların (ör. LLNA’da belli metallerle yanlış negatif bulgular, belli cilt tahriş edicileriyle yanlış pozitif bulgular) olduğunun da bilinmesi gerekir (10).
Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

2. 
   Test yönteminin ilkesi
   

LLNA’nın temelini oluşturan ilke şudur: duyarlılık geliştiriciler kimyasal uygulamanın lenf düğümündeki lenfositlerin primer proliferasyonlarını (çoğalmalarını) harekete geçirirler. Bu proliferasyon (çoğalma) uygulanan dozla ve allerjenin potansiyeliyle orantılıdır ve hassasiyetin basit anlamıyla tarafsız ve nicel ölçümünün elde edilmesini sağlar. LLNA bu proliferasyonu, test gruplarının proliferasyonunun taşıyıcıyla muamele edilmiş kontrol grubundakilerle karşılaştırıldığı bir doz-cevap ilişkisi olarak algılar. Muamele grubundaki proliferasyonun, kontrol grubundakine oranı, Uyarılma İndeksi olarak adlandırılır ve bir test maddesinin potansiyel cilt hassaslaştırıcısı olarak ilave değerlendirmelerinin yapılmasının öncesinde en az üç olmalıdır. Burada tanımlanan yöntemler hücre çoğalmasının ölçülmesi için radyoaktif işaretleme kullanılmasına dayanır. Proliferasyonun değerlendirilmesinde uygulanabilen diğer sonlanma noktaları için gerekçe ve uygun bilimsel destek, metodolojinin tanımı ve tüm alıntılar da dâhil, sağlanmalıdır.

3. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Hazırlıklar
   

1. 
   Barınma ve beslenme koşulları
   

Hayvanlar ayrı ayrı barındırılırlar. Deney hayvanları için oda sıcaklığı 20°C (± 3°C) olmalıdır. Ayrıca, bağıl nem oranı en az %30 olmalı ve tercihen %70’i geçmemelidir, odanın temizlenmesi sırası dışında, amaç %. 50-60 olmalıdır. Yapay ışık sistemi kullanılmalı, 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık şeklinde olmalıdır. Beslenme için, kemirici yemi ve sınırsız içme suyu sağlanabilir.

2. 
   Hayvanların hazırlanması
   

Hayvanlar gelişigüzel seçilirler ve ayrı ayrı kimliklendirilebilmeleri için işaretlenirler. (fakat hiçbir şekilde kulaklarından işaretlenmezler) ve doz uygulamaya başlanmadan 5 gün öncesinden laboratuvar koşullarına uyum sağlamaları için kafeste tutulurlar. Teste başlanmadan önce bütün hayvanlar gözlenebilen cilt lezyonlarının bulunmadığının kesinleştirilmesi için incelenirler.

2. 
   Test Koşulları
   

1. 
   Deney Hayvanları
   

Fare bu test için seçilen türdür. CBA/Ca or CBA/J ırkı, genç yetişkin nulipar fakat hamile olmayan dişi fareler kullanılır. Çalışmanın başında hayvanlar 8–12 haftalık olmalıdır ve ağırlık değişkenliği en az olup ortalama ağırlığın % 20’sini geçmemelidir. LLNA cevabında ırk ve/veya cinsiyete özgü anlamlı değişikliklerin olmadığını gösteren yeterli veri elde edildiğinde diğer suşlar ve erkekler de kullanılabilir.

2. 
   Güvenilirlik kontrolü
   

Pozitif kontroller testin uygun performansta olduğunu göstermek ve laboratuvarın testi yürütmeye hazır olduğunu göstermek için kullanılır. Pozitif kontrol, >3 stimülasyon (uyarılam) indeksinde(SI) negatif kontrol grubunun üzerinde bir artışa neden olacağı bilinen bir maruz kalma seviyesinde, pozitif bir LLNA cevabı oluşturmalıdır. Pozitif kontrol dozu olarak indüksiyonun açık olduğu fakat aşırıya kaçmadığı doz seçilmelidir. Tercih edilen maddeler hekzil sinnamik aldehit (CAS No 101-86-0, EINECS No 202-983- 3) ve merkaptobenzotiyazoldür (CAS No 149-30-4, EINECS No 205-736-8). Uygun gerekçeleri bulunan, yukarıdaki kriterleri sağlayan diğer kontrol maddelerinin kullanıldığı durumlar da söz konusu olabilir.

Normalde bir pozitif kontrol grubu her bir yöntem için gerekebilirken test laboratuvarlarının altı ayın üzerinde ya da daha geniş bir süredeki memnun edici cevabın tutarlılığını göstermek için geçmişe yönelik uygun pozitif kontrol verilerinin olduğu durumlar bulunabilir. Bu durumlarda, pozitif kontrollerle daha az sıklıkta 6 ayı geçmeyen aralıklarla test uygulanması uygun olabilir. Ayrıca pozitif kontrol madde uygun cevabı ortaya çıkardığı bilinen taşıyıcı içinde test edilmelidir (ör., aseton: zeytin yağı). Standart olmayan bir taşıyıcı içinde (klinik/kimyasal açıdan ilgili formülasyon) test uygulamanın gerekebileceği belli düzenleyici durumlar olabilir. Böyle durumlarda, pozitif kontrolün bu geleneksel olmayan taşıyıcıyla olası etkileşimi test edilmelidir.

3. 
   Hayvan sayısı, doz seviyeleri ve taşıyıcı seçimi
   

Doz grubu başına en az dört hayvan kullanılır, test maddesinin, test maddesinin taşıyıcısıyla muamele edilen negatif kontrol grubunun ve uygunsa, pozitif kontrolün en az üç derişimi bulunur. Hayvan verilerinin ayrı ayrı toplanmasının gerektiği bu durumlarda grup başına en az beş hayvan kullanılır. Test maddesiyle muamele edilmemeleri dışında, kontrol grubundaki hayvanlar muamele grubundaki hayvanlarla aynı şekilde elleçlenmeli ve muamele edilmelidirler.

Doz ve taşıyıcı seçimi¹ belirtilen tavsiyelere dayanır. Dozlar %100, %50, %25, %10, %5, %2.5, %1, %0.5 vs. şeklindeki konsantrasyon dizileri arasından seçilir. Üç ardışık konsantrasyonun seçiminde, mümkün yerlerde, mevcut olan ileri toksisite ve dermal tahriş verileri göz önünde bulundurulmalıdır, böylece en yüksek konsantrasyonda sistemik toksisite ve fazla bölgesel deri tahrişinden kaçınılırken maruz kalma maksimize edilir.(2)(11).
Taşıyıcı seçilirken; test maddesinin uygulanabilmesi için uygun çözelti/süspansiyon oluştururken aynı zamanda test konsantrasyonunu ve çözünürlüğünü maksimuma çıkarmasına dikkat edilir. Tercih sırasına göre tavsiye edilen taşıyıcılar aseton/zeytin yağı (4:1 v/v), dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol ve dimetil sülfoksittir (2)(10) fakat yeterli bilimsel gerekçe sunulduğu takdirde diğerleri de kullanılabilir. Belli durumlarda klinik olarak uygun bir çözücü veya içinde test maddesinin piyasaya sunulduğu ticari bir formülasyonun ilave bir kontrol olarak kullanılması gerekebilir. Hidrofilik materyaller deriyi ıslatan ve hemen uzaklaşmayan taşıyıcı sistemine dâhil edilmesi sağlanırken özel dikkat gösterilmelidir. Bu yüzden sulu taşıyıcılardan bütünüyle kaçınılmalıdır.

3. 
   Test yöntemi
   

1. 
   Deneysel takvim
   

Yöntemin deney takvimi aşağıdaki gibidir:

• 
  1.Gün:
  

Hayvanlar ayrı ayrı işaretlenir ve her bir hayvanın ağırlığı kaydedilir. Test maddesinin 25µl’lik uygun seyreltilmiş açık uygulaması, tek başına taşıyıcı veya pozitif kontrol (uygunsa),her bir kulağın arkasına yapılır.

• 
  2. ve 3. Günler:
  

1. gün uygulanan protokol tekrarlanır.

• 
  4. ve 5. Günler:
  

Uygulama yok.

• 
  6. Gün:
  

Her bir hayvanın ağırlığı kaydedilir. 20 µCi (7.4e + 8 Bq) 3H-metil timidin içeren 250µl fosfat tamponlu tuz çözeltisini (PBS) bütün test ve kontrol farelerine kuyruk damarından enjekte edilir. Alternatif olarak 2 µCi (7.4e + 7 Bq) ¹²⁵I-iododeoksiüridin ve 10^-5 M florodeoksiüridin içeren 250 µL PBS çözeltisini tüm farelere kuyruk damarından enjekte edilir.
Beş saat sonra hayvanlar öldürülür. Her bir kulaktan çekilen kulağa ait (airukular) lenf düğümü kesilip çıkartılır ve her bir deney grubu için PBS içinde bir araya getirilir (bir araya getirilen muamele grubu yaklaşımı); alternatif olarak her bir hayvanın ayrı ayrı lenf düğümü çiftleri kesilip çıkartılır ve her bir hayvan için PBS içinde bir araya getirilebilir (bireysel hayvan yaklaşımı). Nodül tanımlanması ve diseksiyonu hakkındaki detaylar ve şekiller kaynak 10’un Ek I’inde bulunabilir.

2. 
   Hücre süspansiyonlarının hazırlanması
   

Gerek bir araya getirilen muamele gruplarından gerek ayrı ayrı hayvanlardan iki taraflı alınan lenf düğümü hücrelerinin (LNC) tek hücre süspansiyonu 200 µm-gözenekli paslanmaz çelik ince kafes tel yardımıyla hafif mekanik ayrıştırma hazırlanır. Lenf düğümü hücreleri fazladan PBS’le iki kere yıkanır ve % 5’lik trikloroasetik asitle(TCA) 4 °C’de 18 saat çöktürülür (2). Pelletler 1 ml TCA tekrar askıya alınırlar ve 3H-sayımı için 10 ml sintilasyon sıvısı içeren sintilasyon viyallerine veya 125I-sayımı için gama sayan tüplere doğrudan aktarılırlar.

3. 
   Hücre çoğalmasının belirlenmesi (birleşik radyoaktivite)
   

³H-metil timidin katılımı dakika başına dezentegrasyon(dağılma) (DPM) olarak β-sintilasyon sayımıyla ölçülür. ¹²⁵I-iyododeoksiüridin katılımı ¹²⁵I-sayımı ile ölçülür ve ayrıca DPM olarak ifade edilir. Kullanılan yaklaşıma bağlı olarak katılım DPM/muamele grubu (bir araya getirme yaklaşımı) veya DPM/hayvan (bireysel yaklaşım) olarak ifade edilir.

4. 
   Gözlemler
   

1. 
   Klinik gözlemler
   

Hayvanlar günde bir defa herhangi bir klinik belirti -ya uygulama yerinde bölgesel tahriş ya da sistemik toksisite- için dikkatlice gözlenmelidirler. Tüm gözlemler düzenli bir şekilde her bir hayvan için ayrı ayrı olacak şekilde kaydedilmelidir.

2. 
   Vücut ağırlıkları
   

Bölüm 1.3.3.1’te belirtildiği gibi ayrı ayrı her hayvanın ağırlığı testin başında ve hayvanların öldürülmesi sırasında tartılmalıdır.

4. 
   Sonuçların hesaplanması
   

Sonuçlar uyarılma indeksi (SI) olarak ifade edilir. Havuzda toplama yaklaşımı kullanılırken SI her bir muamele grubu için olan bir araya getirilen radyoaktif katılımın bir araya getirilen taşıyıcı kontrol grubunun katılımına bölünmesiyle elde edilir, bu da ortalama bir SI sağlar. Bireysel yaklaşım kullanılırken SI ortalama DPM/ her bir test maddesi pozitif kontrol grubundaki hayvanın ortalama DPM/çözücü/taşıyıcı kontrol grubu için hayvana bölünmesiyle elde edilir. Bu durumda, taşıyıcıyla muamele edilmiş kontroller için ortalama SI 1’dir.

SI hesaplanmasında bireysel yaklaşımın kullanılması verilerin istatiksel analizlerinin performansını olanaklı kılar. Uygun istatiksel analiz yöntemi seçilirken, araştırmacı değişkenlerin olası eşitsizliklerinin ve veri dönüşümü veya parametrik olmayan istatiksel analiz gerektiren ilgili diğer problemlerin farkında olmalıdır. Verileri yorumlamak için uygun bir yaklaşım, muamele ve taşıyıcı kontrol grubuna ait tüm bireysel verilerin değerlendirilmesi ve bunlardan yola çıkarak, güvenilirlik sınırı da dikkate alınarak en uygun doz cevap ilişkisini elde etmektir (8)(12)(13). Ne var ki, araştırmacı cevapların alternatif ölçümlerin kullanılmasının (ör., ortalama yerine ortanca) veya aykırı cevapların ayıklanmasının gerekebileceği bir gruptaki hayvanlar için ayrı ayrı olası “aykırı„ cevaplara karşı tetikte olmalıdır.
Pozitif bir cevaba bağlı olarak karar verme süreci doz-cevap ilişkisine yönelik düşünceler, uygun yerlerde istatiksel anlamlılıkla birlikte ≥3 şeklinde bir uyarım indeksini kapsar (3)(6)(8)(12)(14).
Eğer elde edilen değerlerin netleştirilmesi gerekiyorsa, test maddesinin bilinen cilt hassaslaştırıcılarıyla yapısal ilişkisinin olup olmadığı, ciltte çok fazla tahrişe neden olup olmadığı ve görülen doza bağlı cevabın doğası gibi çeşitli özelliklerinin üzerinde durulmalıdır. Bu ve diğer düşünceler başka bir yerde detaylı olarak tartışılmıştır (7).

2. 
   VERİLER
   

Veriler, ortalama ve ayrı ayrı DPM değerlerini ve taşıyıcı kontrolü de dahil her bir doz grubu için, için uyarılma indekslerini gösteren tablo halinde özetlenmelidir

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir:

Test maddesi:

• 
  kimlik verileri (e.g., CAS numarası, varsa, kaynak; saflık; bilinen safsızlıklar; lot numarası);
  
• 
  fiziksel doğası ve fizikokimyasal özellikleri (ör. uçuculuk, kararlılık, çözünürlük);
  
• 
  eğer karışımsa, bileşenlerin bileşimi ve bağıl yüzdeleri
  

Taşıyıcı:

• 
  kimlik verileri [saflık; konsantrasyon (nerede uygunsa); kullanılan hacim]
  
• 
  taşıyıcı seçimi için gerekçe.
  

Test hayvanları:

• 
  kullanılan farenin ırkı;
  
• 
  hayvanların mikrobiyolojik durumu, bilindiğinde;
  
• 
  hayvanların kaynağı, barınma koşulları, diyet, vs.
  
• 
  hayvanların sayı, yaş ve cinsiyeti;
  

Test koşulları:

• 
  test maddesinin hazırlanması ve uygulanmasıyla ilgili detaylar;
  
• 
  doz seçimi için gerekçe, eğer yürütülmüşse aralık bulma çalışmasından elde edilen sonuçlar dâhildir, taşıyıcı ve test maddesi konsantrasyonları ve uygulanan maddenin toplam miktarı
  
• 
  gıda ve su kalitesiyle ilgili detaylar (beslenme türü/kaynağı, su kaynağı dâhildir).
  

Güvenilirlik kontrolü:

• 
  madde, derişim ve kullanılan taşıyıcıya ait bilgiler dahil son güvenilirlik kontrolü sonuçlarının özeti.
  
• 
  test uygulama laboratuvarı için eş zamanlı ve/veya geçmişe dayalı pozitif and negatif kontrol veriler
  

Sonuçlar:

• 
  hayvanların doz uygulamasının başında ve planlanan öldürülme zamanındaki ayrı ayrı ağırlıkları.
  
• 
  ortalama (biraraya getirme yaklaşımı) ve ayrı ayrı (bireysel yaklaşım) DPM değerlerini gösteren tabloyla birlikte her iki yaklaşıma ait aralık değerleriyle her bir doz (taşıyıcı kontrol de dâhildir) grubu için uyarım indeksi.
  
• 
  uygun yerlerde istatiksel analizler
  
• 
  her bir hayvan için toksisite belirtilerinin başlangıcı, uygulama yerindeki dermal tahriş dâhildir, eğer varsa,
  

Sonuçların tartışılması:

• 
  sonuçlar, doz-cevap analizi ve istatiksel analizlerle ilgili kısa bir açıklama, uygun yerlerde test maddesinin cilt hassaslaştırıcısı olup olmadığına dair açıklama ile birlikte.
  

4.