FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- B.43. SIÇANLARDA NÖROTOKSİSİTE ÇALIŞMASI YÖNTEM
KAYNAKLAR (1) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lenf node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169. (2) Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A. (1994). The local lenf node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31. (3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lenf node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79. (4) Testing Method B.6. (5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lenf node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002. (6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E (1996). The local lenf node assay- A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997. (7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false pozitive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327-33. (8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lenf node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59. (9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lenf node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4. (10) National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lenf Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99- 4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov). (11) Testing method B.4. (12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, P.A. (1993) Results with OECD recommended pozitive kontrol sensitisers in the maximisation, Buehler and local lenf node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67. (13) Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lenf node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266. (14) Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lenf node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344-48.
Bu yöntem OECD TG 424 (1997)’ye eşdeğerdir. Bu test yöntemi, kimyasalların yetişkin hayvanlarda potansiyel nörotoksisitesini teyit için gerekli bilgiyi elde etmek veya daha ileride bunu karakterize etmek için tasarlanmıştır. Yöntem tekrarlı doz toksisite çalışmaları için mevcut test yöntemleriyle birleştirilerek veya ayrı bir çalışma olarak yürütülür. Bu yönteme dayanan çalışmalar tasarlanırken yardımcı olması için OECD’nin Nörotoksisite Test Uygulama Yöntemleri ve Stratejileri (1) ile ilgili Rehber Dokümanına başvurulması tavsiye edilir. Bu durum, yöntemin rutin kullanımı için test protokollerinin ve gözlemlerin değişiminin tavsiye edilmesinin düşünüldüğü durumlarda bilhassa önemlidir. Rehber, özel koşullar altında kullanılabilmesi için diğer test protokollerinin seçimini kolaylaştırmak için hazırlanmıştır. Gelişimsel nörotoksisite değerlendirmeleri bu yöntemin konusu değildir.
Kimyasallların toksik karakteristiklerinin değerlendirilmesinde nörotoksik etki potonsiyelinin göz önünde bulundurulması önemlidir. Daha önceki tekrarlı doz sistemik toksisite test yöntemleri potansiyel nörotoksisite taraması gözlemlerini içerir. Bu test yöntemi nörotoksik etkilerle ilgili daha fazla bilgi edinmek veya tekrarlı doz sistemik toksisite çalışmalarında gözlenen etkilerin teyit edilmesi amacıyla bir çalışma tasarlanmasında kullanılabilir. Ancak, belli sınıflara ait kimyasalların potansiyel nörotoksisiteleri üzerinde düşünülürken, kimyasalların önceden tekrarlı doz sistemik toksisite çalışmalarının işaret ettiği potansiyel nörotoksisitesi dikkate alınmaksızın, bu yöntem kullanılarak değerlendirilmesinin daha uygun olduğu önerilebilir. Bu gibi düşünceler örnek olarak, aşağıda belirtilenleri kapsar:
Bu yöntemin kullanılması uygun olduğunda başka örnekler de söz konusu olabilir; daha fazla detay için bakınız (1). Bu yöntem, bir kimyasalın nörotoksik cevabının ölçümü ve karakterizasyonunun sağlanması yanında, özgün histopatolojik ve davranışsal nörotoksisitesinin doğrulanmasında gereken kriterleri karşılamak için geliştirilmiştir. Geçmişte nörotoksisite, nöropatolojik lezyonlar ya da kriz, paraliz veya tremor gibi nörolojik fonksiyon bozuklukları kapsayan nöropatiyle eşdeğer kabul edilirdi. Her ne kadar nöropati önemli bir nörotoksisite belirtisiyse de, bugün nörotoksisitenin nöropati veya başkatipte çalışmalarda görülmeyen motor eşgüdüm kaybı, duyusal noksanlar, öğrenme ve hafıza bozuklukları gibi pek çok belirtisinin olabileceği açıktır. Bu nörotoksisite test yöntemi, yetişkin sıçanlardaki majör nörodavranışsal and nöropatolojik etkileri tespit etmek için tasarlanmıştır. Davranışsal etkiler, morfolojik değişiklikler olmasa bile, organizma üzerinde olumsuz etki yaratabilir fakat tüm davranış değişiklikleri sinir sistemine özgü değildir. Bu yüzden gözlenen herhangi bir değişiklik diğer tipteki sistemik toksisite yanında karşılıklı histopatolojik, hematolojik veya biyolojik verilerle birlikte değerlendirilmelidir. Bu yöntemde, nörotoksik cevabın ölçümünü ve karakterizasyonunu sağlaması istenen test uygulaması, sonrasında elektrofizyolojik ve/veya biyokimyasal araştırmalarla desteklenebilen özgün histopatolojik ve davranışsal prosedürleri kapsar (1)(2)(3)(4). Nörotoksikanlar sinir siteminde pek çok hedef üzerine çeşitli mekanizmalarla etki edebilirler. Testler, tüm maddelerin nörotoksik potansiyelini kapsamlı değerlendirebilecek tek bir dizi (single array) olmadığından gözlenen veya beklenen nörotoksisite türüne özgü diğer in vivo veya in vitro testlerin kullanılması gerekebilir. Bu test yöntemi ayrıca kimyasalın bilinen veya şüpheli zararlarını kanıtlamak, daha iyi bir ‘olumsuz etki gözlemlenmeyen seviye’ tahmininde bulunmak için; doz-cevap ölçümlerinin hassasiyetinin düzenli olarak artırılması veya karakterize edilmesi amaçlı OECD’nin Nörotoksisite Test Uygulama Yöntemleri ve Stratejileri (1) ile ilgili Rehber Dokümanında beyan edilen rehberle beraber kullanılabilir. Örneğin, çalışmalar nörotoksik mekanizmayı(ları) bulmak ve değerlendirmek veya temel nörodavranışsal ve nöropatolojik gözlem prosedürleri kullanılarak önceden elde edilen verileri tamamlamak amacıyla tasarlanabilir. Böyle çalışmalarda, bu yöntemde tavsiye edilen standart prosedürler kullanılarak oluşturulan verilerin – eğer bu veriler önceden mevcutsa- tekrarlanmalarına ve sonuçların yorumlanmasında göz önünde bulundurulmalarına ihtiyaç yoktur. Bu nörotoksisite çalışması, tek başına ya da birlikte kullanıldığında aşağıdaki özelliklere sahip bilgileri sağlar:
Bu test yönteminde test maddesi ağız yoluyla uygulanır. Dermal veya solunum gibi diğer uygulama yolları da uygun olabilir fakat tavsiye edilen prosedürlerin yeniden düzenlenmesi gerekebilir. Uygulama yolunun seçimiyle ilgili düşünceler insan maruz kalma profiline ve mevcut toksikolojik ve kinetik bilgilere bağlıdır.
Olumsuz etki: Muameleye bağlı olarak,organizmanın hayatta kalma, üreme ve çevreye uyum sağlama kabiliyetini azaltannormalden herhangi bir sapma. Doz: Uygulanan test maddesinin miktarı. Doz, ağırlık (g, mg) veya test hayvanının birim ağırlığı başına düşen test maddesinin ağırlığı (e.g. mg/Kg) veya sabit diyet konsantrasyonları (ppm) olarak ifade edilir. Dozaj: Doz, doz frekansı ve doz uygulanması süresini içine alan genel ifade. Nörotoksisite: Bir kimyasal, biyolojik veya fiziksel ajana maruz kalma sonucunda sinir sisteminin yapısında veya fonksiyonunda meydana gelen ters değişiklik Nörotoksikan: Nörotoksisiteye neden olma potansiyeli olan herhangi bir kimyasal, biyolojik veya fiziksel ajan. NOAEL: Hiçbir ters etkinin gözlemlenmediği seviye
Test edilecek kimyasal oral yolla, bir doz aralığında çeşitli gruplardaki laboratuvar kemirgenlerine uygulanır. Normalde tekrarlı dozlara ihtiyaç duyulur ve doz uygulama kürü 28 gün, subkronik (90 gün) veya kronik (1 yıl veya daha fazla) olabilir. Bu yöntemde beyan edilen prosedürler akut nörotoksisite çalışmalarında da kullanılabilir. Hayvanlar davranışsal ve/veya nörolojik anomalilerin belirlenmesi veya karakterizasyonu için test edilirler. Nörotoksikanlardan etkilenen davranış aralığı her bir gözlem süresi sonunda değerlendirilir. Testin sonunda her gruptan her bir cinsiyetten hayvanların alt kümesi in situ perfüze edilir ve beynin kısımları, spinal cord ve periferal sinirler hazırlanıp incelenir. Çalışma, tek başına nörotoksisite taranması veya nörotoksik etkilerin karakterize edilmesi çalışması olarak yürütüldüğünde her bir gruptaki tüm hayvanlar perfüzyon ve sonrasında histopatoloji (bakınız Tablo 1) için kullanılmazlar, bu yöntemin gerektirdiği standart incelemelerden elde edilen verileri tamamlayabilecek özgün nörodavranışsal, nöropatolojik, nörokimyasal veya elektrofizyolojik prosedürler için kullanılabilirler (1). Bu tamamlayaıcı protokoller bilhassa deneysel gözlemler veya beklenen etkiler kimyasalın özgün tipte ya da hedef nörotoksisitesine işaret ettiği zaman faydalı olabilir. Alternatif olarak, geriye kalan hayvanlar kemirgenlerdeki tekrarlı doz toksisitesi çalışmaları test yöntemlerinde istenilen değerlendirmeler için kullanılabilir. Bu test yönteminin protokolleri diğer test yöntemlerinin protokolleriyle birleştirildiğinde her iki çalışmanın gözlemleri için gerekli olanları sağlamak adına yeterli sayıda hayvana ihtiyaç vardır.
Tercih edilen tür sıçandır, diğer rodent türleri de gerekçeleri belirtilerek kullanılabilir. Yaygın olarak kullanılan laboratuvar suşlarının genç yetişkin ve sağlıklı olanları kullanılmalıdır. Dişilerin hiç dogum yapmamış olmaları ve hamile olmamaları gerekir. Doz uygulaması normalde sütten kesilmeden sonra mümkün olduğunca kısa sürede başlamalı tercihen hayvanlar altı haftalığı geçmemiş ve her koşulda dokuz haftalıktan küçük olmalıdırlar. Ne var ki bu çalışma diğer çalışmalarla birleştirildiğinde yaşla ilgili gerekliliğinin düzenlenmesine ihtiyaç duyulabilir. Çalışmanın başlangıcında kullanılan hayvanların ağırlık değişkenlikleri her iki cinsiyet için ortalama ağırlığın ± 20 %’sini geçmemelidir. Kısa süreli bir tekrarlı doz çalışması uzun süreli bir çalışmanın ön çalışması olarak yürütülürse her iki çalışmada kullanılan hayvanlar aynı ırk ve kaynaktan olmalıdır.
Deney hayvanları için oda sıcaklığı 20°C (± 3°C) olmalıdır. Ayrıca, bağıl nem oranı en az %30 olmalı ve tercihen %70’i geçmemelidir, odanın temizlenmesi sırası dışında, amaç %50-60 olmalıdır. Yapay ışık sistemi kullanılmalı, 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık şeklinde olmalıdır. Gürültülü belli aralıklarla gelen ses en azda tutulmalıdır. Beslenme için, geleneksel laboratuvar yiyecekleri ve sınırsız içme suyu sağlanabilir. Beslenme şeklinin seçimi bu yöntemle uygulandığında test maddesinin uygun bir karışımının temin edilmesi ihtiyacından etkilenebilir. Hayvanlar ayrı ayrı veya aynı cinsiyetten küçük gruplar halinde kafeslere yerleştirilebilirler.
Sağlıklı genç hayvanlar rastgele muamele ve kontrol grupları olarak ayrılırlar. Kafesler, yerleştirilmelerinden kaynaklanan olası etkileri en aza indirecek şekilde yerleştirilmelidir. Hayvanlar, tek olarak kimliklendirilirler ve laboratuar koşullarına alışmaları için çalışmanın başlamasından en az (5) beş gün öncesinden kafeslerinde tutulurlar.
Bu test yöntemi özel olarak test maddesinin oral yolla uygulanmasına işaret eder. Oral uygulama gavaj, besin, içme suyu veya kapsülle yapılabilir. Dermal veya solunum gibi diğer uygulama yolları da kullanılır ancak protokollerin yeniden düzenlenmesi tavsiye edilir. Uygulama yolunun seçimi, insan maruz kalma yolu ve mevcut olan toksikolojik ve kinetik bilgilere dayanır. Uygulama yolunun seçilme gerekçesi yanında bu yöntemin prosedürlerindeki düzenlemelerin sonuçları da gösterilmelidir. Gerektiğinde test maddesi uygun bir taşıyıcı içinde çözünebilir veya askıda kalabilir. Sulu çözeltinin/süspansiyonun kullanımı tavsiye edilir bunu tercih edilme sırasına göre yağda (ör.mısır yağı) çözeltinin/süspansiyonun kullanımı ve diğer taşıyıcılardaki mümkün çözelti/süspansiyon kullanımı izler. Taşıyıcının toksik karakteristiği bilinmelidir. İlaveten taşıyıcının test maddesinin soğurum, dağılım, metabolizma veya alıkonması ile ilgili, maddenin toksik karakteristiğini değiştirebilecek olan etkileri ve gıda ve su tüketimiyle ilgili veya hayvanın beslenme durumu üzerindeki etkiler gibi adı geçen karakteristiklerine önem verilmelidir.
Çalışma ayrı olarak yürütüldüğünde detaylı klinik ve fonksiyonel gözlemlerin yapılması için her bir doz ve kontrol grubu için en az 20 hayvan (10 dişi ve 10 erkek) kullanılmalıdır. Bu 10 erkek ve 10 dişi arasından seçilen en az beş erkek ve beş dişi, in situ perfüze edilmelidir ve çalışmanın sonunda detaylı nörohistopatoloji için kullanılır. Belli bir doz grubunda sadece sınırlı sayıda hayvanın nörotoksik etkiler için gözlemlendiği durumlarda, perfüzyon için seçilen hayvanların dahil edilmelerine önem verilmelidir. Çalışmanın tekrarlı doz toksisite çalışmasıyla birlikte yürütüldüğü durumlarda, her iki çalışmanın hedeflerini de karşılamak için uygun sayıda hayvan kullanılmalıdır. Çalışmaların çeşitli kombinasyonları için grup başına en az hayvan sayısı Tablo 1’de verilmiştir. Eğer arada hayvan öldürülmesi veya iyileşme gruplarının uygulama sonrasındaki tersinirlik, kalıcılık veya gecikmiş toksik etkiler için gözlenmesi planlanıyorsa veya tamamlayıcı gözlemler düşünülüyorsa o zaman gözlemler ve histopatoloji için gereken hayvan sayısının sağlanabilmesi için sayıları artırılmalıdır.
Genel olarak en az üç doz grubu ve bir kontrol grubu kullanılmalıdır, Diğer verilerin değerlendirilmesi sonucunda, 1000 mg/kg va/g dozda tekrarlı dozdan hiçbir etki beklenmiyorsa sınır testi yapılabilir. Eğer uygun veri yoksa kullanılacak dozların belirlenmesine yönelik olarak aralık belirlemek için bir çalışma yapılabilir. Test maddesi uygulanacak olanlar haricinde kontrol grubunda yer alan hayvanlara, test grubu denekleriyle eşit bir şekilde muamele edilmelidir. Test maddesi uygulanırken taşıyıcı kullanılmışsa, kontrol grubu kullanılan en yüksek hacimle taşıyıcıyı almalıdır.
Laboratuvar uygulama çalışmaları, kullanılan prosedürlerin çalışmayı yürütecek yetkinlikte olduğunu ve hassasiyetini göstermelidir. Böyle veriler otonomik belirtiler, duyusal tepkinlik, ekleme bağlı uzuvların kavrama gücü ve motor aktivite gibi gözlenmesi tavsiye edilen farklı sonnoktalardaki değişiklikleri tespit etmek ve uygun olduğunda nicelemek için muktedir olduğuna dair kanıt sağlamalıdırFarklı tipte nörotoksik cevaplara neden olan kimyasallarla ilgili bilgiler ve pozitif kontrol madde olarak kullanılabilenler kaynak 2-9’arasındadır. Eğer deneysel prosedürün önemli kısımları aynı kalırsa, geçmişe yönelik veriler kullanılabilir. Geçmişe yönelik verilerin periyodik olarak güncellenmesi tavsiye edilir. Test prosedürlerinin yürütülmesindeki bazı esas bileşenlerin uygulama laboratuarı tarafından değiştirildiği durumlarda, prosedürlerin hassasiyetlerinin devamlılığını gösteren yeni veriler oluşturulmalıdır.
Dozlar, test maddesi veya ilgili materyaller için mevcut herhangi bir toksisite ve ulaşılabilir (toksiko) kinetik veriler dikkate alınarak seçilmelidir. En yüksek doz ciddi zararlara ve ölüme neden olmadan nörotoksik etkilerin veya net sistemik toksik etkilerin indüklenmesi amacıyla seçilmelidir. Daha sonra, dozların, doza bağlı herhangi bir cevabı ve en düşük dozda herhangi bir olumsuz etkinin gözlemlenmediğini (NOAEL) gösterecek şekilde, azalan sıralaması seçilmelidir. Prensipte, dozlar öyle ayarlanmalıdır ki, sinir sistemindeki primer toksik etkiler sistemik toksisiteyle ilgili etkilerden ayırt edilebilsin. Azalan dozları ayarlamak için 2-3 kat arasındaki aralıklar genelde en uygunudur ve dördüncü bir test grubunun eklenmesi dozlar arasında geniş aralıklar (ör. 10 faktörden daha fazla) kullanılmasına çoğunlukla tercih edilir. İnsan maruz kalımıyla ilgili anlamlı bir tahmin varsa, dikkate alınmalıdır.
Eğer bu çalışma için tanımlanan protokoller kullanılarak uygulanan 1000 mg/kg vücut ağırlığı/gün doz bir sınır testi gözlenebilen herhangi bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve eğer yapısal olarak benzer maddelerle ilgili verilere dayanılarak toksisite beklenmiyorsa bu durumda üç doz kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. Beklenen insan maruz kalması daha yüksek bir oral doz kullanılması gerektiğine işaret edebilir. İnhalasyon, dermal uygulama gibi diğer uygulama yolları için, test maddesinin fizikokimyasal özellikleri sıkça maksimuma ulaşılabilir maruz kalma seviyesini kabul ettirebilir. Oral akut çalışmayı yürütmek için, sınır testi için en az doz 2000 mg/kg.
Hayvanlar test maddesiyle günlük olarak haftada yedi gün en az 28 gün boyunca muamele edilirler; 5-günlük doz uygulama kürü veya daha kısa süreli maruz kalma sürelerinin gerekçelendirilmesi gerekir. Test maddesi gavajla uygulandığında bu uygulama tek doz olarak gavaj yöntemi veya entübasyon kanülü kullanılarak yapılmalıdır. Sıvının tek seferde uygulanabilecek maksimum hacmi test hayvanlarının büyüklüğüne bağlıdır. Hacim normalde 1ml/100g vücut ağırlığını geçmemelidir ancak sulu çözeltilerde 2ml/100g vücut ağırlığı düşünülebilir. Normalde daha yüksek konsantrasyonlarda daha kötü etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için konsantrasyonu tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla test hacmindeki değişkenler en aza indirilir. İçme suyu veya diyet yoluyla uygulanan maddeler için, test maddesinin normal beslenme veya su dengesiyle etkileşmemesinin sağlanması gerekir. Test maddesi diyetin içinde sabit diyet derişimi (ppm) veya sabit doz uygulandığında hayvanın vücut ağırlığının esas alındığı durum kullanılır, alternatif bir durum gerekçelendirilmelidir. Doz, gavaj yoluyla uygulanan maddeler için günün benzer zamanlarında verilmelidir ve gerekiyorsa hayvanın vücut ağırlığı açısından sabit bir doz elde etmek için ayarlanmalıdır. Uzun süreli bir çalışmanın ön çalışması olarak tekrarlı doz çalışması yapıldığında her iki çalışmada da benzer diyetler kullanılmalıdır. Akut çalışmalar için eğer tek doz mümkün değilse, doz 24 saati geçmeyen periyotlarda daha küçük parçalar halinde verilebilir.
Tekrarlı doz çalışmalarında gözlem süresi dozaj süresini kapsamalıdır.. Akut çalışmalarda, uygulama sonrasında 14 gün gözlem yapılmalıdır. Uydu grubunda bulunan, muamele sonrasındaki sürede de maruz bırakılmamış hayvanlar için gözlemler bu süreyi de içine almalıdır. Gözlemler, yeterli aralıklarla ve herhangi bir davranışsal ve/veya nörolojik anomalilerin belirlenme olasığını artıracak şekilde yapılmalıdır. Gözlemler tercihen aynı günün aynı zamanlarında ve doz uygulamasından sonraki beklenen etkilerin en yüksek olduğu zamanlar göz önünde bulundurularak yapılmalıdır. Klinik gözlemlerin ve fonksiyonel testlerin sıklığı Tablo 2’de özetlenmiştir. Eğer daha önceki çalışmalardan elde edilen kinetik veya diğer veriler gözlemler, testler veya gözlem sonrası süreç için farklı zaman noktaları kullanılması gerektiğine işaret ediyorsa, en fazla bilgi elde edebilmek için alternatif bir program hazırlanmalıdır. Programdaki değişiklikler için gerekçe sağlanmalıdır.
Bütün hayvanlar günde en az bir defa sağlık koşullarıyla ilgili olarak, bunun yanında günde en az iki defa da hastalık ve ölüm oranları için dikkatlice gözlenmelidirler.
Detaylı klinik gözlemler bu amaçla seçilmiş tüm hayvanlar üzerinde (bakınız Tablo 1) ilk maruz kalmadan önce bir defa (karşılaştırmaya olanak sağlamak için) ve daha sonra da çalışmanın uzunluğuna bağlı olarak farklı aralıklarla (bakınız Tablo 2) yapılmalıdır. Uydu iyileşme gruplarındaki detaylı klinik gözlemler iyileşme sürecinin sonunda yapılmalıdır. Detaylı klinik gözlemler barındıkları kafesin dışındaki standart bir alanda yapılmalıdır. Gözlemler, gözlemdeki her ölçüm için gerekli ölçütleri veya skorlama ölçeklerini içeren skorlama sistemleri kullanılarak dikkatlice kaydedilmelidir. Kullanılan kriterler veya skalalar test uygulama laboratuarı tarafından açıkça tanımlanmalıdır. Test koşullarındaki değişkenlerin çok az olması (sistematik olarak muameleye bağlı değildir) ve gözlemlerin o andaki muamele hakkında bilgisi bulunmayan eğitimli gözlemciler tarafından yürütüldüğünü kesinleştirmek için çaba sarfedilmelidir. Gözlemlerin iyi tanımlanmış kriterlerin (‘normal’ aralık tanımı dahildir) her bir gözlem zamanında her bir hayvana sistematik şekilde uygulandığı yapılandırılmış bir modelde yürütülmesi tavsiye edilir. “Normal aralık” uygun şekilde belgelenmelidir. Gözlenen tüm belirtiler kaydedilmelidir. Yapılabiliyorsa, gözlenen belirtilerin şiddetleri de ayrıca kaydedilmelidir. Klinik gözlemlere ciltteki, kürkteki, gözlerdeki, mukoz membranlardaki değişiklikleri, salgılama başlaması, atılım ve otonomik aktivite (lakrimasyon, piloereksiyon, gözbebeği büyüklüğü, solunumla ilgili olağan dışı durumlar, idrar ve dışkı yapmayla ilgili beklenmedik belirtileri ve rengi bozulmuş idrar) dahil olmalı ancak gözlemler bunlarla sınırlı olmamalıdır. Vücudun pozisyonuna bağlı olarak alışılmamış herhangi bir cevap, aktivite seviyesi (azalmış veya artmış standart alan tetkikleri) ve hareket koordinasyonu ayrıca not edilmelidir. Yürümedeki değişiklikler (ör., paytak yürüyüş, ataksi), duruş (ör., kamburluk) ve kavramak, yerleştirmek veya diğer çevresel uyarılara reaktivite klonik veya tonik hareketlerin varlığı, konvülziyonlar, veya tremorlar, stereotipler (ör., kendi kendini temizleme, aşılmadık kafa hareketleri, tekrarlanan daire çizme) veya tuhaf davranış (ör., ısırmak veya aşırı yalama, kendini sakatlama, geriye doğru yürüme, seslendirme) veya saldırganlık kaydedilmelidir.
Detaylı klinik gözlemlere benzer olarak, fonksiyonel testler de maruz kalmadan önce sıkça bu amaç için seçilen tüm hayvanlarda yürütülmelidir (bakınız Tablo 1). Fonksiyonel testlerin frekansı da ayrıca çalışmanın süresine bağlıdır (bakınız Tablo 2). Tablo 2’de beyan edilen gözlem sürelerine ilaveten uydu iyileşme gruplarındaki fonksiyonel gözlemler de en son öldürülmelere mümkün olduğunca yakın zamanda yapılmalıdır. Fonksiyonel testler farklı duyuların uyarılmasına duyumsal tepkiyi [ör., işitsel, görsel ve proprioseptif uyarı(5)(6)(7)], ekleme bağlı uzuvların kavrama gücü değerlendirilmesi (8) ve motor aktivite değerlendirilmesini(9) içine alır. Motor aktivite ölçümleri aktivitedeki düşüşleri ve artışları ölçecek otomatik bir cihazla yapılmalıdır. Eğer tanımlanan başka bir sistem kullanılırsa, bu sistem nicel olmalı ve hassasiyeti ve güvenilirliği gösterilmelidir. Her bir cihaz zaman karşısındaki güvenilirliğinin ve cihazlar arasındaki tutarlılığının tespit edilmesi için test edilmelidir. Takip edilen prosedürlerle ilgili daha fazla ayrıntı ilgili kaynaklarda verilmiştir. Potansiyel nörotoksik etkilere işaret eden hiçbir veri yoksa (ör. Yapı-aktivite, epidemiyolojik veriler, diğer toksisite çalışmaları) duyu ve motor fonksiyonlar veya öğrenme ve hafıza ile ilgili daha özelleştirilmiş testlerle olası etkilerin detaylı olarak incelenebilmesi için bu testlerin içeriklerinin üzerinde durulmalıdır. Daha özelleştirilmiş testler ve kullanımları hakkında bilgiler (1)’de sağlanmıştır. İstisnai olarak, fonksiyonel testle etkileşecek kapsamda toksisite belirtileri gösteren hayvanlar o testtin dışında bırakılırlabilirler. Böyle durumlarda hayvanların test dışında bırakılmalarının gerekçesi belirtilmelidir.
90 güne kadar süren çalışmalar için, tüm hayvanlar haftada en az bir defa tartılmalı ve gıda tüketimi ölçümleriyle test maddesi su gerektiren bir ortamda uygulanmışsa su tüketimi ölçümleri, en az haftalık olarak yapılmalıdır. Uzun süreli çalışmalar için, tüm hayvanlar ilk 13 hafta için en az haftada bir defa ve daha sonra da her dört haftada bir en az bir defa tartılmalıdırlar. Gıda tüketimi ölçümleri ve test maddesi su gerektiren bir ortamda uygulanmışsa su tüketimi ölçümleri, hayvanların sağlık durumu veya vücut ağırlığı değişiklikleri başka türlüsünün uygulanması gerektiğine işaret etmediği sürece çalışmanın 13 haftası boyunca haftalık olarak, sonrasında da yaklaşık üç aylık aralıklarla yapılmalıdır. Vücut ağırlıkları tüm hayvanlar için ayrı ayrı test süresinin ilk 13 haftasında haftada bir defa ve daha sonra da her dört haftada bir en az bir defa kaydedilmelidir.
28 günden daha uzun süren çalışmalar için, oftalmolojik inceleme, oftalmoskop veya eşdeğeri uygun bir alet kullanmı test maddesi uygulanmadan önce ve çalışmanın sonunda, tercihen tüm hayvanlarda fakat en az en yüksek doz ve kontrol gruplarında yapılmalıdır. Eğer gözlerde değişiklik tespit edilirse veya klinik belirtiler ihtiyaç olduğunu gösterirse, tüm hayvanlar incelenmelidir. Uzun süreli çalışmalar için ayrıca 13 haftalık bir oftalmolojik çalışma yürütülmelidir. Eğer bu veriler daha önceki benzer süreli ve benzer doz seviyeli diğer çalışmalardan elde edilmişse oftalmolojik incelemelerin yürütülmesine gerek yoktur.
Nörotoksisite çalışmaları, tekrarlı doz sistemik toksisite çalışmalarıyla birlikte yürütüldüğü zaman hematolojik incelemeler ve klinik biyokimya belirlemeleri sistemik toksisite çalışmasıyla ilgiliyöntemde beyan edildiği şekilde yürütülmelidir. Örneklerin toplanması nörodavranış üzerindeki herhangi bir potansiyel etkinin en aza indirildiği bir yolla yapılmalıdır.
Nöropatolojik inceleme, çalşmanın in vivo aşaması süresince yapılan gözlemleri tamamlamak ve genişletmek amacıyla tasarlanmalıdır. En az 5 hayvandan cinsiyet/grup alınan dokular (bakınız Tablo 1 ve bir sonraki paragraf) bilinen perfüzyon ve sabitleme(fiksasyon) teknikleri kullanılarak in situ sabitlenmelidir (bakınız kaynak 3, ünite 5 and kaynak 4, bölüm 50). Gözlenen herhangi bir büyük değişiklik kaydedilmelidir. Çalışma, tek başına nörotoksisite taranması veya nörotoksik etkilerin karakterize edilmesi çalışması olarak yürütüldüğünde geriye kalan hayvanlar burada tanımlanan prosedürleri ve incelemeleri tamamlayabilecek olan özgün nörodavranışsal (10)(11) nöropatolojik (10)(11)(12)(13), nörokimyasal (10)(11)(14)(15) veya elektrofizyolojik (10)(11)(16)(17) prosedürler veya histopatolojik inceleme için gerekli hayvan sayısını artırmak için kullanılabilirler. Bu tamamlayıcı prosedürlerin kullanılması, deneysel gözlemler veya olumsuz etkilerin özel bir türü ya da nörotoksisite hedefini işaret ettiği durumlarda dikkate değerdir(2)(3). Alternatif olarak, geriye kalan hayvanlar tekrarlı doz çalışması yönteminde tarif edildiği şekildeki rutin patolojik değerlendirmeler için kullanılabilirler. Parafine yatırılmış tüm doku örneklerine hematoksilin ve eozin (H&E) gibi genel bir boyama prosedürü uygulanmalıdır ve mikroskobik inceleme yapılmalıdır. Eğer periferal nöropati belirtileri gözlenirse veya bundan şüphe edilirse, periferal sinir dokularının plastiğe yatırılmış örnekleri incelenmelidir. Klinik belirtiler ayrıca ilave yerlerin incelenmesini veya özel boyama prosedürleri kullanılmasını tavsiye etmektedir. İncelenecek daha fazla yer için rehber (3)(4)’te bulunabilir. Ayrıca, uygun özgün boyalar, özgün tipteki patolojik değişiklikleri göstermek için faydalı olabilir (18). Merkezi ve periferal sinir sisteminin temsili profilleri histolojik olarak incelenmelidir (bakınız kaynak 3, bölüm 5 ve kaynak 4, bölüm 50). İncelenen alanlar normalde önbeyin, beyin merkezi, hipokampus boyunca bir kesme, ortabeyin, cerebellum, pons, medulla oblongata, optik sinir ve retinayla birlikte göz, omuriliğin servikal ve lumbar bölgesi şişlikleri, dorsal kök ganglia, dorsal ve ventral kök lifleri, proksimal siyatik sinirler, proksimal tibial sinirler (dizde) ve tibial sinir bacak kası dallarını kapsar. Omurilik ve periferal sinir profili hem çapraz hem de enlemsel ve boylamsal profili kapsamalıdır. Sinir sisteminin vasküler yapısına dikkat edilmelidir. Bir iskelet kası örneği, özellikle de bacak kası, ayrıca incelenmelidir.Hücresel ve lif yapılı bölgelere ve MSS ve PSS ‘deki özellikle nörotoksikanlardan etkilendiği bilinen örneklere özel önem gösterilmelidir. Toksik maddeye maruz kalmadan kaynaklanan nöropatolojik değişikliklerle ilgili rehber, Kaynaklar kısmında bulunabilir (3)(4). Doku örneklerinin basamak basamak incelenmesi tavsiye edilir. Önce yüksek doz grubu kontrol grubuyla karşılaştırılır. Eğer bu gruplardan alınan örneklerde nöropatolojik değişikliklere rastlanmazsa sonraki analize gerek yoktur. Eğer nöropatolojik değişiklikler yüksek doz grubunda görülürse, o zaman ara ve düşük doz gruplarından alınan potansiyel olarak etkilenmiş doku örnekleri kodlanmalı ve sıralı şekilde incelenmelidir. Nitel incelemelerde nöropatolojik değişikliklerle ilgili herhangi bir kanıt bulunursa, sinir sisteminin tüm bölgelerinde bu değişiklikleri gösteren ikinci bir inceleme yapılmalıdır. Potansiyel olarak etkilenen her bir bölgenin tüm doz gruplarından kesimler kodlanmalı ve bu kod bilinmeden rast gele incelenmelidir. Her bir lezyonun frekansı ve ciddiyeti kaydedilmelidir. Bütün doz gruplarının bölgeleri oranlandıktan sonra, kod kırılabilir ve doz-cevap ilişkisini değerlendirmek için istatiksel analiz yapılabilir. Her bir lezyonun farklı derecelerdeki şiddeti tanımlanmalıdır. Nöropatolojik bulgular davranışsal gözlemler ve ölçümler, bunun yanında da test maddesiyle ilgili önceki ve eş zamanlı sistemik toksisite çalışmalarından elde veriler bağlamında değerlendirilmelidir.
|