FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- B.44 DERİ ABSORPSİYONU : İN Vİ V O YÖNTEMİ YÖNTEM
VERİLER
Her bir veri ayrı ayrı sağlanmalıdır. İlaveten tüm veriler her bir test veya kontrol grubu için testin başındaki hayvan sayısını, test sırasında ölü bulunan veya insani gerekçelerle öldürülen hayvan sayısını ve ölüm veya öldürülme zamanlarını, toksisite belirtisi gösteren sayıyı, toksik etkilerin başlangıç zamanı, süresi ve şiddeti dahil gözlenen toksisite belirtilerinin tanımlarını, lezyonların türü ve şiddetiyle birlikte lezyon gösteren hayvan sayısını gösteren tablo şeklinde özetlenmelidir.
Çalışmanın bulguları, nörodavranışsal ve nöropatolojik etkilerin (eğer tamamlayıcı incelemeler varsa, yanında nörokimyasal veya elektrofizyolojik etkiler de görülür) ve gözlenen diğer olumsuz etkilerin karşılıklı ilişkisi ve ciddiyeti açısından değerlendirilmelidir. Uygun durumlarda, rakamsal sonuçlar uygun ve genellikle kabul görmüş istatiksel yöntemlerle değerlendirilmelidir. İstatiksel yöntemler çalışma tasarlanırken seçilmelidir.
Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir: Test maddesi
Test hayvanları:
Test koşulları:
Gözlemler ve Test Prosedürleri:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması;
Sonuçlar
(1) OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation. (2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation. (3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals. (4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/ London. (5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003. 16.6.2004 EN Official Journal of the European Union L 216/261 (6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704. (7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283. (8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236. (9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Nörotoksikological Assessments. Nörotoksikol. Teratol., 13, 599-609. (10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York. (11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York. (12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695. (13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352. (14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452. (15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378. (16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology.In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299- 335. (17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology.. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726-742. (18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
B.44 DERİ ABSORPSİYONU:İN VİVO YÖNTEMİ
Bu test yöntemi OECD TG427(2004) ile eşdeğerdir.
Kimyasallara maruz kalma genellikle deri yoluyla gerçekleşirken laboratuvar hayvanları üzerinde yapılan toksikolojik çalışmaların birçoğunda ağız yoluyla uygulanmaktadır. Bu yöntemde açıklanan invivoderiden absorbsiyon çalışması, dermal maruz kalmayı takiben güvenlik değerlendirmesinde tahmini değerlerin oral çalışmalardan hesaplanmasında iyi bir bağlantı sağlar. Maddenin, bir sirkülasyona ulaşabilmesinden önce ciltte bulunan çok sayıdaki hücre katmalarını aşması gerekmektedir. Birçok madde için belirleyici katman oranı, ölü hücrelerden oluşan korundur (stratum corneum). Cilt yoluyla geçirgenlik, maddenin moleküler ağırlığı ve konsantrasyonu gibi faktörlere ek olarak hem kimyasalın lipofilisitesine hem de epidermisin dış katman kalınlığına bağlıdır.Genellikle, kobay farelerinin (guinea pigs) ve maymunlarının cildi insan cildine daha benzer ikentavşan ve sıçanların cildi, insanların cildinden daha geçirgendir. Ciltten absorpsiyon ölçme yöntemi, in vivo ve in vitro olmak üzere iki kategoriye ayrılabilir. Çeşitli laboratuvar türlerinde yapılan in vivo yöntem, emilimi üzerine faydalı bilgiler sağlayabilir. İn vitro yöntem, son zamanlarda geliştirilen bir yöntemdir.Bu yöntem, hayvan ya da insanların tam ya da kısmen kalın cildinden sıvı haznesine geçmesini sağlar. İn vitro yöntem farklı test yöntemlerinde açıklanmaktadır (1). Hem in vivo hem de in vitro yöntemlerin uygunluğu üzerine daha detaylı bilgi sağladığı için, gösterilen durum içerisinde en uygun yöntemin seçiminde yardımcı olması amacıyla Cilt Absorpsiyonu Çalışmalarının Yürütülmesi için OECD Kılavuz Dokümanlarına(2) danışılması tavsiye edilmektedir. Bu yöntemde açıklanan in vivo yöntem, cilt yolu ile sistemik bölge içerisine nüfuz eden test maddesinin belirlenmesine olanak sağlar.Tekniğin yıllardır yaygın bir kullanımı vardır(3)(4)(5) (6)(7). İn vitro ciltten absorpsiyon çalışmaları birçok uygun durumlarda yapılabilmesine rağmen bazı durumlarda sadece in vivo çalışma gerekli olan veriyi sağlayabilir. Fizyolojik ve metabolik olaraksağlamsistem kullanması,birçok toksisite çalışmalarına özgün türler kullanması vediğer türler ile kullanımı için değiştirilebilmesi in vivo yöntemin avantajlarıdır. Canlı hayvanların kullanılması, güvenilir sonuçlara olanak sağlayan radyoaktif olarak işaretlenmiş maddelere ihtiyaç duyulması, başlangıç absorpsiyon fazını belirlemede karşılaşılan zorluklar ve tercih edilen türler (sıçanlar) ile insan cildinin geçirgenliğindeki farklılıklar ise dezavantajlarıdır. Hayvan cildi genellikle daha geçirgendir ve buna bağlı olarak insan cilt absorpsiyonu abartılabilmektedir (6) (8) (9). Kostik/aşındırıcı maddeler canlı hayvanlarda test edilmemelidir.
Absorbe olmayan doz: maruz kalmadan sonra cilt yüzeyinden yıkanan ve oklüzif olmayan örtü üzerinde bulunan ve maruz kalma esnasında buharlaşan dozu temsil eder. Absorbe olan doz (in vivo): cilt bölgesindeki uygulamanın bitiminden sonra idrar, kafesin yıkanması,dışkı, solunmuş hava (eğer ölçülmüş ise), kan, dokular (eğer toplanmış ise)ve kalan kadavra, içerisinde bulunanlardan oluşur. Absorbe edilebilir doz:yıkandıktan sonra cilt üzerinde ya da içerisinde kalanı temsil eder.
Tercihen radyoaktif olarak işaretlemiş test maddesi, kullanılmakta olan örnek karışımı temsil edecek şekilde bir ya da daha fazla uygun doz seviyelerinde tüyleri kesilmiş hayvan cildine uygulanır. Test karışımının, ağızdan alınımını önlemek amacıyla uygun bir örtü altında (yarı- oklüzif ya da oklüzif) belirli bir süre boyunca cilt ile temas halinde kalması sağlanır. Maruz kalma süresinin bitiminde örtü kaldırılır ve cilt uygun temizlik ürünü ile temizlenir. Bu örtü ve temizleyici maddeler, analiz için tutulur ve cildin üzeri yeni bir örtü ile kapatılır. Hayvanlar, maruz kalmadan önce, maruz kalma esnasında ve sonrasında, ayrı metabolik kafeslerde barındırılır, dışkı ve solunmuş hava analiz için saklanır. Uçucu radyoaktif metabolitlerin az yada hiç oluşmadığına dair yeterli bilgi varsa solunmuş hava toplanmayabilir. Her çalışma normal olarak test karışımına maruz bırakılacak olan birçok hayvan grubunu içerir. Bu hayvanların bir grubu maruz kalma süresinin sonunda öldürülür. Diğer gruplar ise belirlenen zaman aralıklarında öldürülür (2). Örnekleme sonunda kalan hayvanlar öldürülür, analiz için kan toplanır, uygulama alanı analiz için alınır ve kadavra vücuttan atılmamış maddeler için analiz edilir. Numuneler uygun yöntemler ile test edilir ve cilt absorpsiyonu seviyesi tahmin edilir (6) (8) (9).
Sıçan en yaygın kullanılan türlerdendir, fakat insan deri absorpsiyon oranına daha benzer olan tüysüz türler ve cinsler de kullanılabilir (3) (6) (7) (8) (9). En yaygın kullanılan laboratuvar türlerinden aynı cinsiyetli (varsayılan cinsiyet erkek) genç-ergin sağlıklı hayvanlar kullanılmalıdır. Çalışmanın başlangıcında kullanılan hayvanların ağırlık değişimleri en az olmalı ve ortalama ağırlığın ±%20’sini geçmemelidir.Örnek olarak, 200g–250g erkek sıçanların, özellikle bu aralığın yarısının üstünde olması uygundur.
Bir cinsiyetten en az dört hayvanın olduğu bir grup, her test karışımı ve her bir belirlenmiş bitiş süresi için kullanılmalıdır. Her hayvan grubu, örneğin maruz kalma süresi (genellikle 6 ya da 24 saat) bitiminde ve sonraki durum (örneğin 48 ve 72 saat) gibi farklı zaman aralıklarından sonra öldürülür. Eğer erkek ve dişiler arasındaki dermal toksisitedeki önemli farklılıkları gösteren mevcut veri var ise daha duyarlı cinsiyet seçilmelidir. Eğer bu gibi veriler yok ise daha sonra her iki cinsiyetten biri kullanılabilir.
Deney hayvanları için oda sıcaklığı 22°C (± 3°C) olmalıdır. Ayrıca, bağıl nem oranı en az %30 olmalı ve tercihen odanın temizlenmesi sırası dışında, %70’i geçmemelidir, hedef % 50-60 olmalıdır. Yapay ışık sistemi kullanılmalı, 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık şeklinde olmalıdır. Besleme için, geleneksel laboratuvar yiyecekleri kullanılabilir ve bu yiyecekler limitsiz içme suyu ile birlikte kolayca ulaşılabilir olmalıdır.Çalışma esnasında ve tercihen çevreye uyum sağlama esnasında da, hayvanlar, metabolik kafeslerde ayrı ayrı barındırılmalıdır. Yiyecek ve su taşması sonuçları etkileyebileceği için bu gibi durumların olma olasılığı en aza indirilmelidir.
Hayvanlar bireysel olarak tanınmaları için işaretlenir ve laboratuvar koşullarına uyum sağlaması için çalışma başlangıcından en az beş gün önce kafeslerine konur. Çevre koşullarına uyum sağlama sürecini takiben, doz uygulamasından yaklaşık olarak 24 saat önce her hayvanın omuz ve arka kısmındaki belirli alanlardaki tüyler kesilir. Zarar görmüş ciltteki geçirme özellikleri sağlam ciltten farklıdır ve cildin aşınmadan korunması için dikkat edilmelidir. Tüylerin kesilme işleminden sonra, test maddesini cilde uygulanmadan yaklaşık 24 saat önce (Bkz. Bölüm1.4.7)cilt yüzeyi, sebumu ortadan kaldırmak için aseton ile silinmelidir. İlave sabun ve suyla yıkama tavsiye edilmemektedir,çünkü herhangi bir sabun kalıntısı test maddesinin absorpsiyonunu kolaylaştırabilir. Uygulama alanı, cildin her cm2lik alanı için, absorbe edilen test kimyasalının miktarının güvenilir bir şekilde hesaplanmasına izin verecek kadar, tercihen 10 cm2, geniş olmalıdır. 200-250gr vücut ağırlığı olan sıçanlar bu uygulama alanı için uygundur. Hazırlık aşamasından sonra hayvanlar metabolik kafeslerine tekrar konur.
Test maddesi, cilde nüfuz etme özellikleri çalışılacak olan bir öğedir. Tercihen, test maddesi radyoaktif olarak işaretlenmelidir.
Test maddesi karışımı (örn. cilde uygulanan saf, seyreltilmiş ya da test kimyasalı içeren formülasyon), insanların ve diğer potansiyel hedef türlerin maruz kalabilecekleri karışımla aynı (ya da gerçeğine uygun) olmalıdır. Test karışımında, herhangi bir farklılık olması durumunda bu gerekçelendirilmelidir. Gerekli olduğunda, test maddesi uygun bir aracı içinde çözündürülür ya da dağıtılır. Sudan başka kullanılan diğer aracıların absorpsiyon özellikleri ve test maddesi ile olası etkileşimi bilinmelidir.
Cilt yüzeyinde uygulama yapılacak alan belirlenir. Bu alana miktarı bilinen test karışımı eşit miktarda uygulanır.Bu miktar normal olarak olası insan maruz kalmasında, genellikle katılar için 1-5 mg/cm2, sıvılar için 10 μl/cm2’ye kadardır. Diğer miktarlar, öngörülen kullanım koşullarına, çalışmanın amacına veya test karışımının fiziksel özelliklerine bağlı olarak gerekçelendirilmelidir. Uygulamayı takiben, temizlenmiş alan tımarlanmadan korunmalıdır. Tipik cihaz örneği Şekil 1 de gösterilmektedir. Normal olarak uygulama alanı oklüzif olmayan örtüyle (örn. geçirgen naylon tül örtü) korunacaktır. Bununla birlikte sonsuz uygulamalar için uygulama alanı kapalı olmalıdır (oklüzif). Yarı uçucu test maddesinin buharlaşarak test maddesinin geri kazanım oranını kabul edilemeyecek düzeyde azaltması (ayrıca bkz. Bölüm 1.4.10, ilk paragraf) durumunda, uygulama cihazını aktif karbon filtre ile örterek buharlaşan test maddesini yakalamak gerekir (bkz. Şekil 1). Uygulama cihazının cilde zarar vermemesi, test karışımını absorbe etmemesi ve test karışımı ile etkileşime girmemesi gerekir. Hayvanlar dışkılarını toplamak için ayrı metabolik kafeslerine tekrar konur.
Maruz kalma süresi, uygulamanın başlangıcı ile test karışımının yıkanarak ciltten uzaklaştırılması arasında geçen zaman aralığıdır. Beklenilen insan maruz kalma süresine dayalı olarak ilgili maruz kalma zaman aralığı (genellikle 6 ya da 24 saat) kullanılmalıdır. Maruz kalma süresini takiben, hayvanlar belirlenen sonlandırma işlemine kadar metabolik kafeslerde muhafaza edilmelidir. Hayvanlarda, çalışma boyunca düzenli aralıklarda toksisite/anormal reaksiyonların belirtileri gözlemlenmelidir. Maruz kalma sürecinin bitiminde temizlenen cilt, görülebilir cilt tahrişi belirtileri için gözlemlenmelidir. Metabolik kafesler, çalışma süresince idrar ve dışkıların ayrı toplanmasına olanak sağlamalıdır. Ayrıca kafesler, belirli miktarda üretildiklerinde (> % 5) analiz edilmesi gereken 14C- karbon dioksit ve uçucu 14C- karbon bileşiklerinin toplanmasına da uygun olmalıdır. İdrar, dışkı ve tutucu sıvılar (örn. 14C- karbon dioksit ve uçucu 14C- bileşikleri), her örnekleme sürecinde her gruptan ayrı olarak toplanmalıdır. Uçucu radyoaktif metabolitlerin az oluştuğuna ya da hiç oluşmadığına dair yeterli bilgi var ise açık kafesler kullanılabilir. Dışkı, ilk cilt teması başlangıcından 24 saate kadar ve sonra günlük olarak deney bitimine kadar maruz kalma sürecinde toplanır. Belirli zaman aralıklarında normal olarak üç kez dışkı toplanması yeterli iken, test karışımının öngörülen amacı ya da mevcut kinetik veri, çalışma için daha uygun ya da ilave süre önerebilir. Maruz kalma sürecinin bitiminde koruyucu aparat her hayvandan alınır ve analiz için ayrı olarak tutulur. Bütün hayvanların uygulama yapılan cilt bölgesi, uygun bezler kullanarak temizlik ajanı ile en az üç kez temizlenir. Vücudun diğer kısımlarına bulaşmasını engellemek için gerekli önlemler alınmalıdır. Temizlik ürünü, örneğin sıvı sabun çözeltisi gibi tipik normal hijyen uygulamasında kullanılan temizlik ajanı olmalıdır. Sonunda cilt kurutulmalıdır. Bütün bezler ve çamaşırlar analiz edilmek üzere tutulmalıdır. Sonraki aşamalar için grupları oluşturacak bu hayvanların kendi kafeslerine götürülmeden önce temizlenen bölgelerini korumak için, yeni örtüler kullanılmalıdır.
Her grup için, ayrı hayvanlar belirlenen zamanda öldürülmeli ve kanları analiz edilmek üzere toplanmalıdır. Koruyucu aparat ya da örtü, analiz edilmek üzere tutulmalıdır. Her bir hayvanın belirlenen uygulama bölgesinden ve doz uygulaması yapılmamış benzer bölgesinden deri alınarak farklı analizlerde kullanılır. Test kimyasalının eğilimi hakkında daha fazla bilgi sağlamak amacıyla bilinen epidermisten korunu (stratum corneum) ayırmak için uygulama alanı bölünebilir. Maruz kalma sürecinden sonraki süreç içinde test kimyasalının eğiliminin belirlenmesi test kimyasalının stratum corneum içindeki davranışı ile ilgili bazı belirtileri sağlamalıdır. Cilt bölünmesini kolaylaştırmak için (son cilt temizliği ve hayvanın öldürülmesinden sonra) koruyucu örtü kaldırılır. Uygulama alanındaki cilt, cildi çevreleyen dairesel halkalar ile birlikte sıçandan kesilip çıkartılır ve tahta üzerine iğnelenir. Yapışkan bant şerit, nazikçe bastırılarak cilt yüzeyine uygulanır ve korun (stratum corneum) bant ile alınır. Bütün korunlar (stratum corneumlar) alınana ve ardışık bant şeritleri cilt yüzeyine yapışmayıncaya kadar uygulamaya devam edilir. Her hayvan için, bütün bant çubukları bir kapta toplanır ve korunu (stratum corneum) çözmek için doku parçalayıcı eklenir. Artık kadavratarafından yapılan absorpsiyon dozu analiz etmeden önce herhangi bir potansiyel hedef doku ayrı ölçüm için saklanabilir. Her bir hayvan cesedi analiz için saklanmalıdır. Genellikle toplam içeriğin analizi yeterli olacaktır. Hedef organlar ayrı analizler için saklanabilir (diğer çalışmalarda belirtilmiş ise). Hayvanların planlanmış sonlanma esnasında idrar kesesi içinde bulunan idrar, önceden toplanan idrara eklenmelidir. Belirlenmiş ölüm esnasında metabolik kafeslerden dışkı toplanmasından sonra, kafesler ve tutucular uygun çözücü ile yıkanmalıdır. Diğer potansiyel kirlenmiş malzemeler aynı şekilde analiz edilmelidir.
Bütün çalışmalarda uygun geri kazanım (örn. ortalama radyoaktivite % 100 ± 10) olmalıdır. Bu oranın dışında elde edilen geri kazanımlar ise gerekçelendirilmelidir. Her numunede uygulanan doz miktarı, uygun onaylanmış prosedürlerle analiz edilmelidir. İstatiksel değerlendirmeler, her bir uygulamadaki tekrarlar için varyans ölçümünü içermelidir.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||