FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
C.3. TATLI SU YOSUNLARI VE SİYANOBAKTERİ BÜYÜME YAVAŞLATMA (İNHİBİSYON) TESTİ
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Varyasyon katsayısı (CV)
- Büyüme ortamı
- Etki gözlemlenmeyen konsantrasyon (NOEC)
- Belirli büyüme hızı
C.3. TATLI SU YOSUNLARI VE SİYANOBAKTERİ BÜYÜME YAVAŞLATMA (İNHİBİSYON) TESTİ
Bu yöntem, OECD TG 201(2006) ile eşdeğerdir (1).
Test yöntemleri, bilimsel ilerlemeler ışığında periyodik olarak gözden geçirilmekte ve güncellenmektedir. Test yöntemi C.3’ün, ek türleri içermesi ve kimyasalların risk değerlendirmesi ve sınıflandırılması için olan gereksinimleri karşılaması için revize edilmesi gerekmekteydi. Revizyon, ilk kabulden sonra meydana gelen yaygın uygulamalara, su yosunu (alg) toksisite alanındaki bilimsel ilerlemeye ve yaygın olarak düzenleyicilerdeki kullanıma dayalı olarak tamamlanmıştır.
Aşağıdaki tanımlar ve kısaltmalar, bu Test Yönteminin amaçları için kullanılmaktadır: Biyokütle: verilen hacme göre ifade edilen popülasyonda bulunan canlı maddenin kuru ağırlığıdır; örneğin mg alg/litre test çözeltisi. Genellikle biyokütle, kütle olarak tanımlanır fakat bu test içerisinde bu sözcük, her hacim için olan kütleyi tanımlamaktadır. Bu test ile biyokütle yerine geçebilecek hücre sayımı, floresans vb. değerler de ölçülür ve bundan dolayı bu ölçümler için de “biyokütle” terimi kullanılır. Varyasyon katsayısı (CV):standart sapmanın ortalamaya oranı olarak tanımlanmış olan parametre değişkenliğinin boyutsuz ölçümüdür. Bu yüzdelik değer olarak da ifade edilebilir. Tekrar kontrol kültürlerindeki belirli büyüme hızı ortalamasının ortalama varyasyon katsayısı, aşağıdaki gibi hesaplanmalıdır: 1. Ayrı ayrı tekrarlar için günlük veya bölüm başınahesaplanan büyüme hızlarının dışında kalan belirli büyüme hızı ortalamasının %CV’si hesaplanır. 2. Tekrar kontrol kültürlerinde günlük veya bölüm başına hesaplanan belirli büyüme hızı varyasyonunun ortalama katsayısını almak için nokta 1’deki hesaplanmış bütün değerlerin ortalama değeri hesaplanır. ECx: belirtilen maruz kalma süreci (eğer tam ya da normal test sürecindedeğişiklik varsa açıkça bahsedilir) içerisinde test organizmalarının büyümesindeki % x (örn. %50) indirgenmesiyle sonuçlanan test ortamında çözünen test maddesinin konsantrasyonudur. Büyüme hızından (r) ya da verimden (y) elde edilen bir EC değerini açık bir biçimde belirtmek için, ‘ErC’ ve ‘EyC’ sembolleri sırasıyla kullanılır. Büyüme ortamı: test yosununun test maddesine maruz bırakıldığı ve büyüdüğü tam sentetik kültür ortamıdır. Test maddesi normal olarak, test ortamında çözündürülür. Büyüme hızı (ortalama büyüme hızı): maruz kalma sürecinde biyokütledeki logaritmik artıştır. Etkinin gözlemlendiği en düşük konsantrasyon (LOEC): kontrol ile karşılaştırıldığında verilen maruz kalma sürecinde büyüme üzerine istatistiksel olarak dikkate değer bir şekilde azaltma etkisi olan (p < 0,05) gözlemlenmiş test edilmiş en düşük konsantrasyondur. Bununla birlikte yukarıdaki bütün test konsantrasyonlarının, LOEC’de gözlemlenmiş olana eşit ya da bundan daha büyük zararlı etkisi olması gereklidir. Bu iki koşula kanaat getirilemediğinde, LOEC’in (ve nitekim NOEC’in) nasıl seçildiğini göstermek için tam bir açıklama verilmelidir. Etki gözlemlenmeyen konsantrasyon (NOEC): LOEC’den hemen sonra gelen test konsantrasyonudur. Tepki değişkeni: biyokütleyi tanımlayan farklı hesaplama yöntemleriyle herhangi bir ölçülmüş parametreden toksisite tahmini için elde edilen değişkendir. Bu yöntem için büyüme hızı ve verim, direkt ya da bahsi geçen vekillerden herhangi birinin biyokütlesinin ölçülmesinden elde edilen tepki değişkenidir. Belirli büyüme hızı: gözlem (bu Test Yöntemindeki, biyokütle) ve ilgili zaman aralığı parametresinin doğal logaritma farklılığının bölümü olarak tanımlanmış olan tepki değişkenidir. Verim: maruz kalma sürecinin başlangıcında ölçüm değişkeninden çıkan maruz kalma süreci bitimindeki biyokütleyi ifade etmek için ölçüm değişkeni değeridir.
Bu Test Yöntemi, test koşulları altında muhtemelen suda duran ve suda çözünen maddelere kolay bir şekilde uygulanabilir. Uçucu, hızlı adsorbe eden, renklendirilmiş, su içerisinde az çözünen maddelerin ya da test ortamında besinlerin veya minerallerin kullanılabilirliğini etkileyebilecek olan maddelerin test edilmesi için, anlatılan süreçte birtakım değişiklikler gerekebilir (örn. kapalı sistem, test küvetinin şartlarının değiştirilmesi). Bazı uygun değişiklikler üzerine kılavuz (2), (3) ve (4) içerisinde verilmektedir.
Bu testin amacı, maddenin tatlı su mikroalginin ve/veya siyanobakterinin büyümesi üzerine etkilerini belirlemektir. Üssel büyüyen test organizmaları, normal olarak 72 saat boyunca seri kültürdeki test maddesine maruz bırakılır. Oldukça kısa test süresine rağmen birçok nesil üzerinde etkiler değerlendirilebilir. Sistem tepkisi, test maddesinin değişik konsantrasyonlarına maruz bırakılmış su yosunu serilerindeki büyümenin azalmasıdır. Tepki, kontrol kültürlerine maruz bırakılmamış tekrarların ortalama büyümelerine kıyasla maruz kalma konsantrasyonunun fonksiyonu olarak değerlendirilir. Toksik etkilere sistem tepkisinin tam ifadesi için (optimum hassasiyet), kültürlerin yeterli besin koşulları ve zaman aralığında sürekli ışık altında sınırlandırılmamış üssel büyümesine izin verilerekbelirli büyüme hızı ölçülür. Büyüme ve büyümenin engellenmesi, zaman fonksiyonu olarak su yosunu biyokütlesinin ölçümleriyle niceliklendirilir. Su yosunu biyokütlesi, hacim başına kuru ağırlık olarak tanımlanır, örneğin mg alg/litre test çözeltisi. Bununla birlikte kuru ağırlığı ölçmek zordur ve bu sebeple vekil parametreler kullanılır. Diğer vekil parametreler, hücre hacmi, floresans, optik yoğunluk ve benzerlerini içerir. Ölçülmüş vekil parametre ile biyokütle arasındaki çevirme faktörü bilinmelidir. Test sonlanma noktası, maruz kalma sürecinde biyokütledeki (ortalama büyüme hızı) logaritmik artış olarak ifade edilen büyüme engellenmesidir. Testlerde kaydedilmiş olan belirli büyüme hızlarından, %x yavaşlama ile sonuçlanan konsantrasyon belirlenir (örneğin %50)hızve ErCx (e.g. ErC50) olarak ifade edilir. Bu yöntemin uygulanması için sonuçların hesaplanması, aşağıda bölüm 2.2 içerisinde açıklanan sonuçlardan dolayı ortalama büyüme hızına dayanmalıdır. Bu test yöntemi içerisinde kullanılan değişebilir ek tepki verimdir, bu konu ile ilgili olarak bazı ülkelerdeki belirlidüzenleyici gereksinimleri yerine getirmek gerekebilir. Verim, maruz kalma başlangıcındaki biyokütle ilemaruz kalma bitimindeki biyokütle arasındaki fark olarak tanımlanmıştır. Testlerde kaydedilen verimden, verimin yaklaşık olarak belirlenmiş %x yavaşlamaya (örn. %50) sebep olan konsantrasyon hesaplanır ve EyCx (örn. EyC50) olarak üretilir. Ek olarak, LOEC ve NOEC istatiksel olarak belirlenebilir.
Test koşullarının oluşturulmasında faydalı olabilecek olan test maddesi hakkında bilgi, yapısal formülü, ışıktaki kararlılığı, test koşulları altındaki kararlılığı, ışık absorpsiyon özelliklerini, pKa ve sudaki biyobozunabilirliği içeren dönüşüm çalışmalarının sonuçlarını içerir. Suda çözünürlük, oktanol su dağılım katsayısı (Pow) ve test maddesinin buhar basıncı bilinmeli ve rapor edilmiş olan iyileştirme etkinliği ile test çözeltisi içerisindeki madde niceliklendirme için geçerliliği kabul edilmiş olan yöntem ve tespit limiti kullanılabilir olmalıdır.
Uluslararası onay testinde kullanılan 3,5 diklorofenol gibi referans madde(ler), test prosedürü kontrolü aracı olarak kullanılabilir. Potasyum dikromat, yeşil alg için referans madde olarak kullanılabilir. Referans maddesinin yılda en az iki kez test edilmesi makbuldür.
Testin geçerli olarak kabul edilmesi için, aşağıdaki performans ölçütlerini karşılaması gerekmektedir: Kontrol kültürlerindeki biyokütle, 72 saatlik test süresi içerisinde en az 16 kat artmış olmalıdır. Bu, 0,92 gün–1belirli büyüme hızına denk gelir. En sık kullanılan türler için, büyüme hızı genellikle çok yüksektir (bakınız Ek-I). Bu değerlendirme ölçütü, Ek-I’de listelenmiş olan daha yavaş büyüme hızına sahip türler olduğunda karşılanamayabilir. Bu durumda, test süresi boyunca büyümenin üssel olmasını sağlamak için kontrol kültürlerindeki test süresi en az 16 kat büyüme elde edilene kadar uzatılmalıdır. Test esnasında limitsiz üssel büyümeyi elde etmek için minimum çarpım katsayısının 16 olması kaydıyla test süresi en az 48 saate indirilebilir. Kontrol kültürlerinde (bakınız ‘değişkenlik katsayısı’, bölüm 1.2) bölüm başına belirlibüyüme hızı (0-1, 1-2 ve 2-3 gün, 72- saatlik testler için) için değişkenlik katsayısının ortalaması %35’i geçmemelidir. Bölüm başına belirli büyüme hızının hesaplanması için bölüm 2.2.1’deki ikinci paragrafa bakınız. Bu değerlendirme ölçütü, tekrar kontrol kültürleri için hesaplanmış olan varyasyon katsayısının ortalama değerine uygulanır. Kontrol kültürlerindeki testin tamamı boyunca ortalama büyüme hızının varyasyon katsayısı, Pseudokirchneriellasubcapitatave Desmodesmussubspicatus ile testler içerisinde %7’yi geçmemelidir. Daha az sıklıkta test edilen diğer türler için, bu değer %10’unu geçmemelidir.
Test çözeltisi ile temas edecek olan test kapları ve diğer düzenekler tamamen camdan ya da diğer kimyasal olarak inert malzemelerden yapılmış olmalıdır. Test çözeltisinin bileşimini veya alg büyümesini etkileyecek organik veya inorganik kirleticilerin karışmasını önlemek için bu malzemeler yıkanmalıdır. Test kapları, test esnasında ölçümler için yeterli hacimde kültüre ve atmosferden yeterli kütlede CO2 transferine izin veren normal cam şişe boyutlarında olacaktır (bakınız bölüm 1.8.9, ikinci paragraf). Analitik tayinler için yeterli olması gereken sıvı hacmine dikkat edilir (bakınız bölüm 1.8.11, beşinci paragraf). Buna ilaveten, aşağıdaki malzemelerin bazıları ya da tamamı gerekecektir: — Kültür düzeneği: seçilen inkübasyon sıcaklığının ± 2 °C’de korunduğu etajer ya da hazne tavsiye edilir. — Işık ölçüm aygıtları: ışık kuvvetinin ölçüm yönteminin ve özellikle alıcı tipinin (kollektör) ölçülen değeri etkileyeceğini dikkate almak önemlidir. Ölçümler, tercihen küresel (4 π) alıcı (ölçüm düzleminin üstünde ve altındaki bütün açılardan direkt ya da yansıtılan ışığa tepki gösterir) ya da 2 π alıcı (ölçüm düzleminin üstündeki bütün açılardan ışığa tepki gösterir) kullanılarak yapılacaktır. — Alg biyokütlesini belirlemek için düzenekler. Alg biyokütlesi için en sık kullanılan vekil parametre olan hücre sayımı; elektronik tane sayacı, sayma hazneli mikroskop ya da akışlı hücre ölçer kullanarak yapılabilir. Diğer biyokütle vekilleri; akışlı hücre ölçer, florimetre, spektrofotometre ya da renk ölçer kullanarak ölçülebilir. Hücre sayımını kuru ağırlık ile ilişkilendiren çevrim faktörü hesaplama yapmak için kullanışlıdır. Spektrofotometre kullanırken düşük biyokütlekonsantrasyonlarında kullanışlı ölçümler yapılmasını sağlamak için en az 4 cm ışık yoluna sahip küvetleri kullanmak gerekebilir.
Birçok iliştirilmemiş mikroalg ve siyanobakteri türü kullanılabilir. Ek-I’de listelenmiş olan suşların, Test Yöntemi içerisinde belirlenmiş olan test prosedürünü kullanarak uygun olabilecekleri gösterilmiştir. Eğer diğer türler kullanılır ise, suş ve/veya köken rapor edilmelidir. Seçilmiş test alginin üssel büyümesinin, genel koşullar altında test süresi boyunca elde edilebileceği teyit edilmelidir.
İki alternatif büyüme ortamı, OECD veya AAP ortamı tavsiye edilir. Bu ortamların bileşimleri, Ek-II içerisinde gösterilmektedir. İki ortamın başlangıç pH değeri ve tampon kapasitesinin farklı olduğu dikkat alınmalıdır. Buna bağlı olarak testlerin sonuçları, iyonlaştırıcı maddeler test edilirken kullanılan ortama bağlı olarak değişebilir. Büyüme ortamının modifikasyonu, belirli amaçlar için gerekli olabilir, örneğin farklı pH değerlerinde test etme veya metalleri ve şelatlama ajanlarını test etme. Modifiye edilmiş ortamın kullanımı detaylı bir şekilde tanımlanmalı ve gerekçelendirilmelidir (3), (4).
Test kültürlerindeki başlangıç biyokütle, bütün test kültürlerinde aynı olmalı ve besin azalması riski olmaksızın inkübasyon süresi boyunca üssel büyümeye izin vermek için yeterli düzeyde düşük olmalıdır. Aşağıdaki başlangıç hücre konsantrasyonları tavsiye edilir:
Etki oluşması muhtemel konsantrasyon aralığını belirlemek için aralık bulma testlerinin sonuçları baz alınabilir. Kesin final testi için 3,2’yi aşmayan bir çarpan ile geometrik serilerde düzenlenmiş en az beş konsantrasyon seçilmelidir. Konsantrasyon tepki eğrisi düz olan test maddeleri için daha yüksek bir çarpan gerekçelendirilebilir. Konsantrasyon serileri, tercihen alg büyüme hızının %5- 75 engellenmesine neden olan aralığı kapsamalıdır.
Test tasarımı, her test konsantrasyonunda üç tekrar içermelidir. Eğer NOEC tayinine gereksinim yoksa konsantrasyon miktarını arttırmak ve her konsantrasyon için tekrar sayısını azaltmak üzere test tasarımı değiştirilebilir. Kontrol tekrarlarının sayısı en az üç olmalıdır ve tercihen her test konsantrasyonu için kullanılan tekrar miktarının iki katı olmalıdır. Test maddesi konsantrasyonlarının analitik tayini için ayrı test çözelti grubu hazırlanabilir (bakınız bölüm 1.8.11, dördüncü ve altıncı paragraf). Test maddesini çözündürmek için bir çözücü kullanıldığında, test tasarımı, test kültürlerinde kullanılan aynı konsantrasyonlarda çözücü içeren ek kontrolleri de içermelidir.
Test edilecek algin, test koşullarına uymasını sağlamak ve test çözeltilerine aşılarken üssel büyüme fazında olduğunu temin etmek amacıyla, test ortamındaki aşı kültürü, testin başlangıcından 2-4 günönce hazırlanır. Test başlangıcına kadar aşıkültüründe etkili olması için üssel büyümeye izin vermek amacıyla alg biyokütlesi ayarlanmalıdır. Aşı kültürü, test kültürleri gibi aynı koşullarda inkübe edilecektir. Kültür koşulları altında test suşlarının büyümesinin normal aralık içerisinde olmasını sağlamak için aşı kültüründe biyokütledeki artış ölçülür. Örnek alg kültürleme prosedürü, Ek-III içerisinde tanımlanmaktadır. Test esnasında eş zamanlı hücre bölünmesinden kaçınmak için aşı kültüründe ikinci üretme (propagasyon) adımına gerek duyulabilir.
Bütün test çözeltileri, aynı konsantrasyondaki büyüme ortamını ve aynı başlangıç test algi biyokütlesini içermelidir. Seçilen konsantrasyonların çözeltileri, genellikle büyüme ortamı ve aşı kültür ile test maddesinin stok çözeltisinin karıştırılmasıyla hazırlanır. Stok çözeltileri normal olarak test ortamında test maddesini eriterek hazırlanır. Aseton, t-butil alkol ve dimetilformamit gibi çözücüler, test ortamına su çözünürlüğü düşük olan maddeleri eklemek için taşıyıcı olarak kullanılabilir (2), (3). Çözücü konsantrasyonu, 100 µl/l’yi geçmemeli ve test serilerindeki bütün kültürlere (kontroller dahil) eklenmelidir.
Test kapları hava geçiren kapaklar ile kapatılır. Kaplar çalkalanır ve kültür düzeneğinin içine yerleştirilir. Test esnasında süspansiyon içerisindeki algi korumak ve CO2 transferini kolaylaştırmak önemlidir. Bu amaçla sabit çalkalama ve karıştırma kullanılmalıdır. Kültürler, ± 2°C’de kontrol edilen 21 ila 24°C aralığındaki sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Tropikal türler gibi Ek-I’de listelenmiş olanlar haricindeki türler için geçerlilik kriterlerini tamamlayabilme şartıyla daha yüksek sıcaklıklar uygun olabilir. Şişelerin inkübatör içerisine rastgele yerleştirilmesi ve hergün yerlerinin değiştirilmesi tavsiye edilir. Kontrol ortamı pH’ı, test esnasında 1,5 birimden daha fazla artmamalıdır. Test pH’ına yakın pH derecesindekısmen iyonlaşan metal ve bileşikler için tekrarlanabilir ve iyi tanımlanmış sonuçlar elde etmek amacıyla pH seviyesini sınırlamak gerekli olabilir. < 0,5 pH birimleri akımı teknik olarak uygulanabilirdir ve ortamdan test çözeltisine yeterli oranda transfer edilen CO2 kütlesi ile erişilebilir, örneğin çalkalama oranını arttırarak. Başlangıç biyokütlesini ya da test süresini azaltarak CO2 ihtiyacını azaltmak diğer olasılıktır. Kültürlerin inkübe edildiği yüzey, sürekli ve eşit miktarda (‘soğuk beyaz’ veya ‘günışığı’ tipi) floresan aydınlatma almalıdır. Alg ve siyanobakterisuşlarının ışık gereksinimleri çeşitlilik gösterir. Işık yoğunluğu kullanılan test organizmasına göre seçilmelidir. Tavsiye edilen yeşil alg türleri için test çözeltilerindeki ışık yoğunluğu uygun bir alıcı kullanılarak ölçüldüğünde fotosentez için etkili olan 400-700 nm dalga boyu aralığındaki 60-120 µE∙m–2∙s–1 aralığından seçilecektir. Özellikle Anabaenaflos-aquae gibi bazı türler düşük ışık yoğunluğunda iyi yetişir ve yüksek yoğunlukta zarar görebilir. Buna benzer türler için ortalama ışık yoğunluğu 40-60 µE∙m–2∙s–1aralığından seçilmelidir. (Tavsiye edilen ışık yoğunluğu olan 60-120 µE∙m–2∙s–1 değeri, Lüks olarak kalibre edilmiş ışık ölçüm aygıtlarında soğuk beyaz ışık için yaklaşık olarak 4440-8880 lüks/ışık aralığına denk gelir.). Işık yoğunluğu, inkübasyon alanı üzerindeki ortalama ışık yoğunluğundan ± %15’ten daha fazla çeşitlenmeyecektir.
Test süreci normal olarak 72 saattir. Bununla birlikte, bölüm 1.7’de bütün geçerlilik kriterlerini sağlaması kaydıyla daha kısa ya da uzun test süreçleri kullanılabilir.
Her cam şişe içerisindeki alg biyokütlesi, test süresi esnasında en az günlük olarak belirlenir. Eğer ölçümler, test çözeltisinden pipetle çıkarılan küçük hacimler üzerinde yapılır ise bunlar değiştirilmemelidir. Biyokütle ölçümü, mikroskop ya da elektronik tane sayacıyla (hücre sayımı ve/veya biyohacim) elle hücre sayımı yapılarak gerçekleştirilir. Sitometri, in vitro veya in vivo klorofil floresans (6) (7) ya da optik yoğunluk gibi alternatif teknikler, test içinde oluşan biyokütle aralığı üzerinde gösterilebilecek olan biyokütle ile yeterli korelasyon sağlayarak kullanılabilir. Çözeltilerin pH’ı, testin başlangıcında ve bitiminde ölçülür. Kullanılan konsantrasyon aralığındaki test maddesinin tayini için sağlanmış analitik prosedür uygunsa, başlangıç konsantrasyonlarını doğrulamak ve test esnasındaki maruz kalma konsantrasyonlarının muhafazası için test çözeltileri analiz edilmelidir. Düşük ve yüksek test konsantrasyonu testinin başlangıç ve bitiminde test maddesi konsantrasyonunun ve beklenen EC50 düzeyi etrafındaki konsantrasyonunun analizi, maruz kalma konsantrasyonunun test esnasında nominal değerlerden %20 daha az çeşitlendireceği muhtemel olduğu yerde yeterlidir. Testin başlangıcı ve bitimindeki bütün test konsantrasyonlarının analizi, nominalin muhtemelen %80-120 içerisinde kalamayacağı konsantrasyonlarda tavsiye edilir. Uçucu, stabil olmayan ya da kuvvetlice adsorbe eden test maddeleri için test maddesi kaybını daha iyi tanımlamak amacıyla maruz kalma esnasında 24 saatlik aralıkta analiz etmek için ek numune alma tavsiye edilir. Bu maddeler için fazla tekrarlara ihtiyaç duyulabilir. Her durumda test maddesi konsantrasyonlarının, sadece her test konsantrasyonunda bir tekrar kabı üzerinde uygulanmasına ihtiyaç vardır (ya da tekrar ile toplanmış kapların içeriğinde). Test esnasında maruz kalma konsantrasyonlarının analizi için özel olarak hazırlanmış test ortamı, test için kullanılanlara aynı şekilde muamele edilmelidir, örneğin alg ile inoküle edilmelidirler ve özdeş koşullar altında inkübe edilmelidir. Eğer çözündürülmüş test maddesi konsantrasyonunun analizi gerekir ise, algi ortamdan ayırmak gerekli olabilir. Ayırma işlemi, algin gerektiği kadar çökelmesi için tercihen düşük g-kuvvetindeki santrifüjle yapılmalıdır. Test edilen madde konsantrasyonunun nominalin ± %20’si içerisinde tatmin edici olarak muhafaza edildiğine ve test yoluyla başlangıç konsantrasyonun ölçüldüğüne dair kanıt var ise sonuçların analizi nominale ya da ölçülmüş başlangıç değerlere dayanabilir. Eğer nominalden ya da ölçülmüş başlangıç konsantrasyondan sapma, sonuçların analizinden ± %20 daha büyük ise sonuçların analizi maruz kalma esnasında geometrik ortalama konsantrasyonuna ya da test maddesi konsantrasyonunun sapmasını açıklayan modellere (3) (8) dayanır. Alg büyüme yavaşlatma testi, diğer kısa dönem sucul toksisite testlerinden daha dinamik bir test sistemidir. Bunun sonucu olarak özellikle düşük konsantrasyonlarda test edilmiş adsorbe edici maddeler için asıl maruz kalma konsantrasyonlarının belirlenmesi zor olabilir. Bu gibi durumlarda çözeltideki maddenin artan alg biyokütlesineadsorpsiyon yoluyla dâhil olması, test sisteminden kaybolması anlamına gelmez. Test sonuçları analiz edildiğinde, büyüme yavaşlatmasinde azalmayla seyreden test aşamasında test maddesi konsantrasyonunazalıp azalmadığı kontrol edilmelidir. Böyle bir durumda test maddesi konsantrasyonunun (8) sapmasını tanımlayan uygun model uygulaması dikkate alınabilir. Aksi takdirde başlangıç (nominal ya da ölçülmüş) konsantrasyonlarda sonuçların analizini temel almak uygun olabilir.
Mikroskobik gözlem, normal ve sağlıklı bir aşı kültürün görünümünü doğrulamak ve test bitiminde herhangi bir anormal alg görünümünü gözlemlemek için uygulanmalıdır.
Bazı koşullar altında, örneğin öncül testlerde, test maddesinin 100 mg∙l–1 kadar ya da test ortamındaki (hangisi daha düşük ise) kendi çözünürlük limitine kadar olan konsantrasyonlarda toksik etki olmadığını belirttiğinde, kontrol grubu veya bir doz grubunu (100 mg∙l–1 ya da çözünürlük limitine eşit olan konsantrasyon) kapsayan sınır test üstlenilebilir. Bunun, maruz kalma konsantrasyonunun analiziyle desteklenmesi şiddetle tavsiye edilir. Doz tekrarlarının sayısının altı olması hariç sınır testine önceden tanımlanmış bütün test koşulları ve geçerlilik kriterleri uygulanır. Kontrol ve doz gruplarındaki tepki değişkenleri, ortalamaları karşılaştırmak için istatistiksel test kullanarak analiz edilebilir, örneğin Tek anakütle ortalaması için parametrik hipotez sınaması (Student’s t-test). Eğer iki grubun varyansları eşit değil ise, eşit olmayan varyanslar için ayarlanmış t-test uygulanmalıdır.
İrradiyasyon (ışık yoğunluğu) bu Test Yönteminde belirtilen aralığın en yüksek bitiminde olmalıdır: 120µE m-2 s-1 ya da daha yüksek. Işık yolu, test çözeltisinin hacminin azaltılmasıyla kısaltılmalıdır (5-25 ml aralıkta). Kültür yüzeyinde alglerin yüksek irradiyasyona maruz kalmasını sağlamak için yeterli uyarma (örnek olarak ölçülü çalkalama) uygulanmalıdır.
|