-
YÖNTEM
Bu akut toksisite testi OECD TG 213(1998) test yöntemi ile eşdeğerdir.
-
Giriş
Bu toksisite testi yetişkin işçi arılara bitki koruma ürünleri ve diğer kimyasalların ağızdan akut toksisitesini belirlemek için tasarlanan bir laboratuvar metodudur.
Maddelerin toksik karakterini hesaplama ve değerlendirilmesinde, örneğin arıların belirli bir kimyasala maruz kalması olasıysa balarılarının akut ağızdan toksisitenin belirlenmesi gerekebilir. Akut ağızdan toksisite testi pestisitler ve diğer kimyasalların arılara karşı olan toksisitesini belirlemek için yürütülür. Bu testin sonuçları ilave değerlendirme gereğini açıklamak için kullanılmalıdır. Özel olarak, bu yöntem pestisitlerin arılara olan zararlarını tespit için kullanılan ve yarı-alan ve alan toksisite deneylerine dayanan programlarda kullanılabilir (1). Pestisitler aktif maddeler olarak ya da formüle edilmiş ürünler olarak test edilebilir.
Test prosedürünün kesinliğini test etmek için ve arıların duyarlılığını doğrulamak için toksik bir standart kullanılmalıdır.
-
Tanımlar ve birimler
Akut ağızdan toksisite: Test maddesinin tek bir dozunun ağızdan verilmesini takiben maksimum 96 saatlik periyotta oluşan olumsuz etkilerdir.
Doz: Test maddesinin tüketilen miktarıdır. Doz test hayvanı başına (μg/arı) uygulanan test maddesinin kütlesi (μg) olarak ifade edilir. Her bir arı için gerçek doz arıların hepsi birlikte beslendiği için hesaplanamaz ancak ortalama bir doz belirlenebilir. (toplam tüketilen test maddesi/ bir kovandaki arıların sayısı)
LD50 (Ortanca ölümcül doz) Ağızdan = Ağız yolu ile verildiğinde hayvanların %50’sinin ölümüne neden olan ve istatistiksel olarak türetilen maddeye ait tekil dozdur. LD50 değeri arı başına düşen μg cinsinden test maddesi olarak ifade edilir. Pestisitler için, test maddesi ya aktif bir madde olabilir ya da aktif maddelerden bir ya da birkaçını içeren formüle edilmiş bir ürün olabilir.
Ölüm : Hayvan tamamen hareketsiz ise ölü olarak kayıt edilir.
-
Test yönteminin ilkesi
Yetişkin işçi arılar (apis mellifera) sukroz çözeltisi içinde dağıtılmış, farklı dozlarda test maddesine maruz bırakılır. Kontrol arıları test maddesi içermeyen aynı beslenmeye tabi tutulur. Ölüm günlük olarak en azından 48 saatte kaydedilir ve kontrol edilir ve kontrol değerleri ile karşılaştırılır. Eğer ölüm hızı 24 saat ve 48 saatlik sürelerde artıyor ancak ölüm oranı kabul edilebilir seviyede kalıyorsa, yani ≤ %10, testin süresi maksimum 96 saate çıkarılabilir. 24 saat ve 48 saatlik LD50 değerlerini test uzatıldığı takdirde 72 saat ve 96 saatlik sürede LD50 değerlerini hesaplamak için sonuçlar analiz edilir.
-
Testin geçerliliği
Testin geçerli olması için aşağıdaki şartlar uygulanır:
-
Toplam kontrollerin sayısının ortalama ölüm oranı testin sonunda %10’u geçmemelidir.
-
Toksik standardın LD50 değerinin belirlenen aralıkta olması
-
Test yönteminin tanımlanması
-
Arıların toplanması
Aynı ırktan gelen, aynı yaşta, aynı besleme durumunda vs. genç işçi arılar kullanılmalıdır. Arılar yeterince beslenmiş, sağlıklı, bilinen fizyolojik durumda ve bilinen geçmişe sahip hastalıklı olmayan kraliçe kolonisinden elde edilmelidir. Arılar sabah alıp kullanılabilir ya da akşam toplanıp bir sonraki günkü test için saklanabilir. Yavru arı içermeyen peteklerden toplanan arılar uygundur. İlkbaharın başında ya da sonbaharın sonunda arılar değişik bir fizyolojide olduğu için bu dönemde arı toplanmasından kaçınılmalıdır. Eğer testler ilkbaharın başında ya da sonbaharın sonunda gerçekleştirilecekse, arılar inkübatöre alınır 1 hafta süreyle arı ekmeği ve sukroz çözeltisi ile beslenir (taraktan toplanan polen) . Antibiyotik, anti-varroa ürünleri gibi kimyasal maddelerle muamele edilen arılar son muameleden dört hafta geçene dek toksisite testleri için kullanılmamalıdır.
-
Barınma ve besleme koşulları
Temizlemesi kolay ve iyi havalandırılmış kovanlar kullanılır. Paslanmaz çelik, tel ağ, plastik ve kullan-at türü ağaç gibi herhangi bir uygun malzeme kafeslerde kullanılabilir. Kovan başına 10 arılık gruplar tercih edilir. Test kovanlarının büyüklüğü arıların sayısı için uygun ve yeterince alan içerecek şekilde olmalıdır.
Arılar 25 ±2 ˚C sıcaklıkta ve karanlıkta deney odalalarında saklanmalıdır. Normal olarak %50–70 olan bağıl nem test süresince kaydedilmelidir. Muamele ve gözlemleri içeren elleçleme prosedürleri gün ışığında yapılabilir. 500 g/L (50% w/v)son derişime sahip sükroz çözeltisi besin olarak kullanılmalıdır. Verilen dozlardan sonra, besin ad-libitum olarak sağlanmalıdır. Besleme sistemi her bir kafeste besin alımını kaydedecek şekilde olmalıdır.(bölüm 1.6.3.1’e bakınız.) Cam tüp (yaklaşık 50 mm uzunluğunda ağız kısmı 10 mm genişliğinde ve alt kısmı 2 mm çapına kadar daralan) kullanılabilir.
-
Arıların hazırlanması
Toplanan arılar deney odasına rast gele dağıtılmış test kovanlarına rasgele yerleştirilir. Arılar testin başlangıcından önce 2 saat kadar aç bırakılabilirler. Arıların hepsinin testin başlangıcında bağırsak içeriklerinin aynı olması için besinsiz bırakılmaları önerilir. Test başlamadan önce ölmek üzere olan arılar alınmalı ve sağlıklı olanları ile değiştirilmelidir.
-
Dozun hazırlanması
Test maddesinin su ile karışır olduğu durumlarda madde %50’lik sukroz çözeltisinde dağıtılabilir. Teknik ürünler ve sudaki çözünürlükleri düşük olan maddelerde, organik çözücü, emülsiyon oluşturucu yada arılar için düşük toksisiteye sahip dağıtıcılar (örneğin aseton, dimetilformamit, dimetilsülfoksit gibi taşıyıcılar) kullanılabilir. Kullanılan taşıyıcının konsantrasyonu test maddesinin çözünürlüğüne bağlıdır ve test edilen bütün madde konsantrasyonları için aynı olmalıdır. %1’lik taşıyıcı konsantrasyonu uygundur ve bu değer aşılmamalıdır.
Uygun kontrol çözeltileri hazırlanmalı (yani test maddesini çözmek için çözücü veya dağıtıcı kullanıldığı zaman).İki ayrı kontrol grubu kullanılmalıdır: Sudaki çözelti ve kullanılan doz ayarlama çözeltilerinde kullanılan konsantrasyonda çözücü/taşıyıcı ile sükroz çözeltisidir.
-
İşlem
-
Test ve kontrol grupları
Test edilen doz sayısı ve tekrarlar LD50‘nin %95’lik güven aralığında belirlenmesindeki istatistiksel ölçütleri sağlamalıdır. Normal olarak test için LD50 aralığını kapsayan ve aralarında 2.2 faktörünü geçmeyecek şekilde değişen geometrik seri halinde 5 doz gereklidir. Ancak toksisite eğrisine (doz oranına karşı-ölüm oranı) göre seyreltme oranı ve konsantrasyonların sayısı belirlenmelidir ve sonuçların analizinde seçilen istatistikî yöntem dikkate alınmalıdır. Bir aralık bulma testi uygun dozdaki konsantrasyonların bulunmasını sağlar.
10 arıdan oluşan en az 3 tekrar her bir konsantrasyon ile doz ayarlanmalıdır. 10 arıdan oluşan en az 3 kontrol grubu test grubuna paralel olarak yürütülmelidir. Kullanılan çözücü/taşıyıcılar içinde kontrol grupları dâhil edilmelidir (Bakınız bölüm 1.5.4).
-
Toksik standart
Bir toksik standat test serileri içinde yer almalıdır. Beklenen LD50 değerini kapsayacak en az 3 doz seçilmelidir. Her test dozunda her biri 10 arı içeren en az 3 tekrar kovanı kullanılmalıdır. Tercih edilen toksik standart rapor edilen 24 saatlik ağızdan LD50 değeri 0.10–0.35 μg/arı olan dimetoat’tır. Ancak beklenilen doz cevabı doğrulayacak verinin bulunduğu diğer toksik standartlarda kullanılabilir (örneğin, Parathion).
-
Maruz kalma
-
Dozların uygulanması
Her test grubu arısı uygun derişimde test maddesi içeren %50’lik sukroz çözeltisinin100–200 μl’si ile temin edilmelidir. Düşük çözünürlükteki, formülasyonunda düşük konsantrasyonlu ya da düşük toksisitesi olan ürünler için ise daha büyük bir hacim gereklidir aynı zamanda daha yüksek yüzdeli sukroz çözeltileri kullanılmalıdır. Grup başına tüketilen besin izlenmelidir. Tüketildikten sonra (genellikle 3–4 saat içinde), besleyici kap kovandan alınmalı ve sadece sukroz çözeltisi içeren bir başkası ile değiştirilmelidir. Sukroz çözeltileri ad-libitum olarak sağlanmalıdır. Bazı bileşikler için, test dozunun yüksek konsantrasyonlarda reddedilmesi çok az besin tüketilmesine ya da hiç besin tüketilmemesine neden olabilir. Maksimum 6 saat sonra, tüketilmeyen besin sadece sükroz çözeltisi ile değiştirilmelidir. Tüketilen besin hesaplanmalıdır (Hacim/ kalan besin ağırlığının ölçümü ile).
-
Süre
Testin süresi test çözeltisi sukroz çözeltisi ile değiştirildikten sonra tercihen 48 saattir. Eğer ölüm oranı ilk 24 saatte %10 ‘dan fazla artmaya devam ederse, ilk test süresi kontrolün ölüm oranı %10 geçmeyecek şekilde 96 saate çıkarılmalıdır.
-
Gözlemler
Ölüm, testin başlangıcından 4 saat sonra ve 24 saat ve 48 saatte kaydedilir (dozu verdikten sonra). Eğer daha uzun bir gözlem süresi gerekiyorsa kontrolün ölüm oranı %10 geçmeyecek şekilde maksimum 96 saate kadar 24 saatlik aralıklarla daha ileriki tespitler yapılmalıdır.
Grup başına tüketilen besin miktarı hesaplanmalıdır. Verilen 6 saatlik sürede muamele edilen ve muamele edilmemiş besinin tüketim hızlarının karşılaştırılması muamele edilen besinin uygunluğu hakkında bilgi sağlayabilir. Test süresi içinde gözlenen bütün beklenmeyen davranış etkileri kaydedilmelidir.
-
Sınır testi
Bazı durumlarda (test maddesinin düşük toksisiteye sahip olduğu beklenen durumlarda) LD50 ‘nin bu değerden daha yüksek olduğunu göstermek için 100 μg/ arı kullanarak bir limit testi uygulanmalıdır. Test dozu için 3 tekrar test grubu; bağıl kontroller, tüketilen besin miktarının değerlendirilmesi, toksik standartın kullanımını içeren aynı prosedür kullanılmalıdır. Eğer ölüm gerçekleşirse tam bir çalışma yürütülmelidir. Eğer alt ölümcül etkiler gözlenirse (bakınız 1.6.4) bunlar kaydedilmelidir.
-
VERİLER VE RAPORLAMA
-
Veriler
Veriler, her bir muamele grubu, kontrol ve toksik standart gruplar, kullanılan arı sayısı, her gözlem zamanında izlenilen ölüm, ters davranış gösteren arı sayısını gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Ölüm verileri uygun istatistiksel yöntemlerle analiz edilir. (istatistiksel ihmal birimi analizi, binom olasılığı, ortalama)(3)(4). Doz-cevap eğrisi önerilen her bir gözlem zamanında çizilir ve %95 güven aralığında ortalama ölüm dozları(LD50) ve eğrinin eğimi hesaplanır. Abbott düzeltmesi kullanılarak ölüm kontrolü üzerinde düzeltmeler yapılabilir.(4)(5). Muamele edilen besinin tümüyle tüketilmediği durumlarda, grup başına tüketilen test maddesi dozu belirlenmelidir. LD50 arı başına düşen μg cinsinden test maddesi olarak ifade edilir.
-
Test raporu
Test raporu aşağıdakileri içermelidir.
-
Test maddesi
-
Fiziksel doğası ve ilgili fizikokimyasal özellikler (örneğin sudaki kararlılık, buhar basıncı)
-
Yapısal formül, saflık gibi özellikleri içeren kimyasal tanımlama verileri (pestisitler için aktif maddelerin tanımı ve derişimi)
-
Test türleri
-
Bilimsel isim, ırk, yaklaşık yaş (hafta), toplama yöntemi, toplama tarihi
-
Sağlık, herhangi bir yetişkin hastalığı, herhangi bir ön işlem gibi test arılarının toplanması için kullanılan koloniler hakkında bilgi
-
Test şartları
-
Deney odasının sıcaklık ve bağıl nemi
-
Tür, büyüklük ve kovan maddesi gibi barınma koşulları
-
Test ve stok çözeltilerinin hazırlanma yöntemi ( kullanıldığında, çözücü ve konsantrasyonu)
-
Test tasarımı, kullanılan konsantrasyonlar ve sayısı, kontrol sayısı, her bir test konsantrasyonu ve kontrol için tekrar kovanlarının sayısı ve her kovandaki arı sayısı
-
Test tarihi
-
Sonuçlar
-
Eğer yapıldıysa ön aralık bulma testinin sonuçları
-
Ham veriler: her gözlem zamanında ve dozda ölüm
-
Testin sonunda doz-cevap eğrilerinin grafiği
-
Her bir test maddesi ve toksik standart için önerilen gözlem zamanında %95 güven aralığında LD50 değerleri
-
LD50 ‘nin bulunmasında kullanılan istatistiksel işlem
-
Kontroldeki ölüm oranı
-
Arıların beklenemeyen davranışı, muamele edilen ve edilmeyen gruplardaki besin tüketim hızı gibi besindeki gözlenen ya da ölçülen diğer biyolojik etkiler
-
Test işlemlerinden herhangi bir sapma ve diğer ilgili bilgiler
-
KAYNAKLAR
-
EPPO/Council of Europe (1993). Decision -Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products - Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151–165. March 1993.
-
Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981 -1992. Journal of Apicultural Research, 22, 119-125.
-
Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
-
Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
-
Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ.Entomol.,18, 265-267.
C.17 BAL ARILARI-AKUT TEMAS TOKSİSİTE TESTİ
-
YÖNTEM
Bu akut toksisite testi OECD TG 214 (1998) ile eşdeğerdir.
-
Giriş
Bu toksisite testi yetişkin işçi arılara bitki koruma ürünleri ve diğer kimyasalların akut temas toksisitesini değerlendirmek için tasarlanan bir laboratuvar yöntemidir.
Maddelerin toksik karakterinin belirlenmesinde ve değerlendirilmesinde, örneğin arıların belirli bir kimyasala maruz kalması dolayısıyla bal arılarının akut temas toksisitesinin belirlenmesi gerekebilir. Akut temas toksisite testi pestisitler ve diğer kimyasalların arılara karşı olan ve doğal yapısından kaynaklanan toksisitelerini belirlemek için yürütülür. Bu testin sonuçları ilave değerlendirmeler için ihtiyaçları belirlemek için kullanılmalıdır. Özel olarak, bu yöntem pestisitlerin arılara olan zararlarını tespit için kullanılan ve yarı-alan ve alan toksisite deneylerine dayanan programlarda kullanılabilir (1). Pestisitler aktif maddeler olarak ya da formüle edilmiş ürünler olarak test edilebilir.
Test prosedürünün kesinliğini test etmek için ve arıların duyarlılığını doğrulamak için bir toksik standardt kullanılmalıdır.
-
Tanımlar ve birimler
Akut temas toksisitesi: Test maddesinin tek bir dozunun bölgesel olarak verilmesini takiben maksimum 96 saatlik periyotta oluşan olumsuz etkilerdir.
Doz: Test maddesinin uygulanan miktarıdır. Doz test hayvanı başına (μg/arı) düşen test maddesinin kütlesi (μg) olarak ifade edilir.
LD50 (Ortanca ölümcül doz) = Temasla uygulandığında hayvanların %50’sinin ölümüne neden olan ve istatistiksel olarak türetilen maddeye ait tek dozdur. LD50 değeri arı başına düşen μg cinsinden test maddesi olarak ifade edilir. Pestisitler için, test maddesi ya aktif bir madde olabilir ya da aktif maddelerden bir yada birkaçını içeren formüle edilmiş bir ürün olabilir.
Ölüm: Hayvan tamamen hareketsiz ise ölü olarak kayıt edilir.
-
Test yönteminin ilkesi
Yetişkin işçi arılar (apis mellifera) uygun bir dağıtıcı içinde dağıtılmış farklı dozlarda test maddesine göğüs boşluğundan doğrudan uygulama (damla) ile maruz bırakılır. Test süresi 48 saattir. Eğer ölüm hızı 24 saat ve 48 saatlik sürelerde artıyor ancak kontrol ölümleri kabul edilebilir seviyede kalıyorsa, yani ≤ %10, testin süresini maksimum 96 saate çıkarmak uygun olur. Ölüm günlük olarak kaydedilir ve kontrol değerleri ile karşılaştırılır. 24 saat ve 48 saatlik LD50 değerlerini test uzatıldığı takdirde 72 saatlik ve 96 saatlik LD50 değerlerini hesaplamak için sonuçlar analiz edilir.
-
Testin geçerliliği
Testin geçerli olması için aşağıdaki şartlar uygulanır:
-
Toplam kontrollerin sayısının ortalama ölüm oranı testin sonunda %10’u geçmemelidir.
-
Toksik standardın LD50 değeri belirlenen aralıkta olması
-
Test yönteminin tanımlanması
-
Arıların toplanması
Aynı ırktan gelen, aynı yaşta, aynı besleme durumunda vs. genç işçi arılar kullanılmalıdır. Arılar yeterince beslenmiş, sağlıklı, bilinen fizyolojik durumda ve bilinen geçmişe sahip hastalıklı olmayan kraliçe kolonisinden elde edilmelidir.Arılar sabah alıp kullanılabilir ya da akşam toplanıp bir sonraki günkü test için saklanabilir. Yavru arı içermeyen peteklerden toplanan arılar uygundur. İlkbaharın başında ya da sonbaharın sonunda arılar değişik bir fizyolojide olduğu için bu dönemde arı toplanmasından kaçınılmalıdır. Eğer testler ilkbaharın başında ya da sonbaharın sonunda gerçekleştirilecekse, arılar inkübatöre alınır 1 hafta süreyle arı ekmeği ve sukroz çözeltisi ile beslenir (taraktan toplanana polen). Antibiyotik, anti-varroa ürünleri gibi kimyasal maddelerle muamele edilen arılar son muameleden dört hafta geçene dek toksisite testleri için kullanılmamalıdır.
-
Barınma ve besleme koşulları
Temizlemesi kolay ve iyi havalandırılmış kovanlar kullanılır. Paslanmaz çelik, tel ağ, plastik ve kullan-at türü ağaç gibi herhangi bir uygun malzeme kafeslerde kullanılabilir. Kovan başına 10 arılık gruplar tercih edilir. Test kovanlarının büyüklüğü arıların sayısı için uygun ve yeterince alan içerecek şekilde olmalıdır.
Arılar 25 ±2 ˚C sıcaklıkta ve karanlıkta deney odalarında saklanmalıdır. Normal olarak %50–70 olan bağıl nem test süresince kaydedilmelidir. Muamele ve gözlemleri içeren elleçleme prosedürleri gün ışığında yapılabilir. 500g/L (50% w/v)son derişime sahip sukroz çözeltisi besin olarak kullanılmalıdır. Verilen dozlardan sonra, besin ad-libitum olarak sağlanmalıdır. Besleme sistemi her bir kafeste besin alımını kaydedecek şekilde olmalıdır. Cam tüp (yaklaşık 50 mm uzunluğunda ve ağız kısmı 10 mm genişliğinde ve alt kısmı 2 mm çapına kadar daralan bir cam tüp) kullanılabilir.
-
Arıların hazırlanması
Toplanan arılar deney odasına alınmadan önce test maddesinin uygulaması için karbondioksit ve azot ile anesteziye tabi tutulabilir. Kullanılan anestezik ve maruz kalma zamanı en aza indirilmelidir. Test başlamadan önce ölmek üzere olan arılar alınmalı ve sağlıklı olanları ile değiştirilmelidir.
-
Dozun hazırlanması
Uygulanacak test maddesi bir taşıyıcı içinde çözelti olarak uygulanır, yani, organik çözücü veya ıslatıcı ajanlı ıslak çözelti olacak şekilde uygulanmalıdır. Organik çözücü olarak aseton tercih edilir ancak arılara olan toksisitesi düşük olan başka organik çözücülerde (örneğin, dimetilformamit, dimetilsülfoksit) kullanılabilir. Suda dağıtılarak formüle edilen ürünler için yüksek polarlıkta ve organik taşıyıcı çözücülerde çözünmeyen maddeler için, eğer ticari bir ıslatıcı ajanın (Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween) zayıf bir çözeltisi içinde ise çözelti olarak uygulanması daha kolay olabilir.
Uygun kontrol çözeltileri hazırlanmalı yani test maddesini çözmek için çözücü veya dağıtıcı kullanıldığı zaman iki ayrı kontrol grubu kullanılmalıdır: Birisi suyla muamele edilen, diğeri çözücü/taşıyıcı ile muamele edilendir.
-
İşlem
-
Test ve kontrol grupları
Test edilen doz sayısı ve tekrarlar LD50‘nin %95’lik güven aralığında belirlenmesindeki istatistiksel ölçütleri sağlamalıdır. Normal olarak test için geometrik seri halinde LD50 aralığını kapsayan ve aralarında 2.2 faktörünü geçmeyen çarpanlar halinde değişen 5 doz gereklidir. Ancak toksisite eğrisine (doz oranına karşı-ölüm) göre seyreltme oranı ve konsantrasyonların sayısı belirlenmelidir ve sonuçların analizinde seçilen istatistiki yöntem dikkate alınmalıdır. Bir aralık bulma testi uygun dozdaki derişimlerin bulunmasını sağlar.
10 arıdan oluşan en az 3 tekrar her bir konsantrasyon ile doz ayarlanmalıdır. 10 arıdan oluşan en az 3 kontrol grubu test grubuna paralel olarak yürütülmelidir. Eğer organik bir çözücü ya da ıslatıcı kullanıldıysa her bir 10 arı için çözücü ve ıslatıcılarla kontrol grupları dâhil edilmelidir.
-
Toksik standart
Test serileri bir toksik standardı içermelidir. Beklenen LD50 değerini kapsayacak en az 3 doz seçilmelidir. Her test dozunda her biri 10 arı içeren en az 3 tekrar kovanı kullanılmalıdır. Tercih edilen toksik standart rapor edilen 24 saatlik ağız yolu ile LD50 değeri 0.10–0.30 μg/arı olandimetoattır. Ancak beklenilen doz yanıtını doğrulayacak verinin bulunduğu diğer toksik standardlarda kullanılabilir (örneğin, parathion).
-
Maruz kalma
-
Dozların uygulanması
Anestezi edilmiş arılar birer birer bölgesel olarak uygulama ile muamele edilir. Arılar farklı test dozları ve konsantrasyonlara rasgele dağıtılır. Test maddesinin uygun bir çözeltisi içeren bir çözeltinin 1 μl hacmi mikro uygulayıcı ile her arının göğüs boşluğunun sırt kısmına uygulanır. Eğer doğrulandıysa başka hacimlerde kullanılabilir. Uygulamadan sonra arılar test kovanlarına alınır ve sükroz çözeltisi verilir.
-
Süre
Testin süresi tercihen 48 saattir. Eğer ölüm artış oranı 24 saat ile 48 saat arasında %10 ‘dan fazla ise, ilk test süresi, kontrolün ölüm oranı, %10’ u geçmeyecek şekilde maksimum 96 saate çıkarılmalıdır.
-
Gözlemler
Ölüm testin başlangıcından 4 saat sonra ve daha sonra 24 saat ve 48 saatte kaydedilir (dozu verdikten sonra). Eğer daha uzun bir gözlem süresi gerekiyorsa kontrolün ölüm oranı %10’ u geçmeyecek şekilde maksimum 96 saate kadar 24 saatlik aralıklarla daha ileriki tespitler yapılmalıdır.
Test süresi içinde gözlenen bütün beklenmeyen davranış etkileri kaydedilmelidir.
-
Sınır testi
Bazı durumlarda (test maddesinin düşük toksisiteye sahip olduğu beklenen maddelerde), LD50 ‘nin bu değerden daha büyük olduğunu göstermek için, 100 μg/ arı kullanarak bir limit testi uygulanmalıdır. Test dozu için 3 tekrar test grubu; bağıl kontroller, tüketilen besin miktarının değerlendirilmesini, toksik standartı, içeren aynı prosedür kullanılmalıdır. Eğer ölüm gerçekleşirse tam bir çalışma yürütülmelidir. Eğer alt ölümcül etkiler gözlenirse (bakınız 1.6.4) bunlar kaydedilmelidir.
-
VERİLER VE RAPORLAMA
-
Veriler
Veriler, her bir muamele grubu, kontrol ve toksik standart gruplar, kullanılan arı sayısı, her gözlem zamanında izlenilen ölüm, ters davranış gösteren arı sayısını gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Ölüm verileri uygun istatistiksel yöntemlerle analiz edilir. (istatistiksel ihmal birimi analizi, binom olasılığı, ortalama)(3)(4). Doz-cevap eğrisi önerilen her bir gözlem zamanında (24 s, 48 s ve gerekliyse 72 s ve 96 s) çizilir ve %95 güven aralığında ortalama ölüm dozları (LD50) ve eğrinin eğimi hesaplanır. Abbott düzeltmesi kullanılarak ölüm kontrolü üzerinde düzeltmeler yapılabilir.(4)(5).. LD50 arı başına düşen μg cinsinden test maddesi olarak ifade edilir.
-
Test raporu
Test raporu aşağıdakileri içermelidir.
-
Test maddesi
-
Fiziksel doğası ve ilgili fizikokimyasal özellikler( örneğin, sudaki kararlılık, buhar basıncı)
-
Yapısal formül, saflık gibi özellikleri içeren kimyasal tanımlama verileri(pestisitler için aktif maddelerin tanımı ve derişimi)
-
Test türleri
-
Bilimsel isim, ırk, yaklaşık yaş(hafta), toplama yöntemi, toplama tarihi
-
Test arılarının toplanması için kullanılan koloniler hakkında sağlık, herhangi bir yetişkin hastalığı, herhangi bir ön işlem hakkında bilgi.
-
Test şartları
-
Deney odasının sıcaklık ve bağıl nemi
-
Tür, büyüklük ve kovan maddesi gibi barınma koşulları
-
Test ve stok çözeltilerinin hazırlanma yöntemi( kullanıldığında, çözücü ve konsantrasyonu)
-
Test tasarımı, kullanılan konsantrasyonlar ve sayısı, kontrol sayısı, her bir test konsantrasyonu ve kontrol için tekrar kovanlarının sayısı ve her kovandaki arı sayısı
-
Test tarihi.
-
Sonuçlar
-
Eğer yapıldıysa ön aralık bulma testinin sonuçları
-
Ham veriler: her gözlem zamanında ve dozda ölüm oranı
-
Testin sonunda doz-cevap eğrilerinin grafiği
-
Her bir test maddesi ve toksik standart için önerilen gözlem zamanında %95 güven aralığında LD50 değerleri
-
LD50 ‘nin bulunmasında kullanılan istatistiksel işlem
-
Kontroldeki ölüm oranı
-
Arıların beklenemeyen davranışı, muamele edilen ve edilmeyen gruplardaki besin tüketim hızı gibi besindeki gözlenen ya da ölçülen diğer biyolojik etkiler
-
Burada anılan test işlemlerinden herhangi bir sapma ve diğer ilgili bilgiler.
-
KAYNAKLAR
-
EPPO/Council of Europe (1993). Decision -Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products - Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151–165. March 1993.
-
Gough, H. J. McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981 -1992. Journal of Apicultural Research, 22, 119–125.
-
Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
-
Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed. Cambridge, London and New-York.
-
Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.18, 265–267.
C.18 KESİKLİ DENGE MODELİ KULLANARAK ADSORPSİYON/DESORPSİYON
-
YÖNTEM
Bu test, kesikli denge yöntemi (2000) kullanarak toprak adsorpsiyonu (yüzeye tutunma) / desorpsiyonu (yüzeyden geri sökülme) belirlemesi için OECD TG 106 yönteminin benzeridir.
-
Giriş
Bu test ulusal seviyede var olan yönergeleri (5)(6)(7)(8)(9)(10)(11) ve bir adsorpsiyon testinin(1)(2)(3)(4) geliştirilmesi için toprak seçimi çalıştayının ve halka testinin sonuçlarını göz önüne alır. Adsorpsiyon/desorpsiyon çalışmaları kimyasalların hareketliliği ve onların topraktaki sudaki, havadaki ve biyokürenin başka bölümlerindeki dağılımı üzerine gerekli bilgiler oluşturmak için yararlıdır (12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21). Bilgiler, bozunma için kimyasalın varlığını (22)(23), organizmalar tarafından dönüşüm ve alınması (24), toprak tarafından süzülümünü (16)(18)(19)(21)(25)(26)(27)(28), topraktan buharlaşabilirliğini (21)(29)(30), yüzey sularından kaynak sularına akışını (18)(31)(32) tahmin etmek ya da hesaplamak için kullanılabilir. Adsorpsiyon verileri karşılaştırma ve modelleme amacıyla da kullanılabilir. (19)(33)(34)(35).
Kimyasalın toprak ve sulu fazlar arasında dağılımı; maddenin kimyasal doğası (12) (36) (37) (38) (39) (40), toprağın tanımlayıcı özellikleri (4)(12)(13)(14)(41)(42) (43)(44)(45)(46)(47)(48)(49), yağış miktarı, sıcaklık, güneş ışığı rüzgâr gibi iklimsel şartlar gibi pek çok farklı değişkenden etkilenen çok karmaşık bir süreçtir. Bu yüzden kimyasalın toprakta adsorpsiyonu pek çok kavram ve mekanizmadan etkilendiği için mevcut yöntemdeki gibi küçük çapta basitleştirilmiş bir laboratuvar modeli ile bütünüyle açıklanamaz. Ancak her ne kadar bu test bütün çevresel etken değişkenlerini bütünüyle içermese bile, kimyasalın adsorpsiyonu hakkında değerli bilgiler sağlar.
Ayrıca bakınız Genel Giriş.
-
Kapsam
Bu yöntem bir maddenin topraktaki adsorpsiyon/desorpsiyon davranışını hesaplamayı amaçlar. Amaç pek çok değişik deneysel şartta dağılımı tahmin etmek için bir tutunma değeri elde etmektir, bu amaçla kimyasal için değişik topraklarda denge adsorpsiyon katsayıları, toprağın özelliklerinin (organik karbon içeriği, kil içeriği, toprak ve pH) doğal olarak bulunan topraklarla maddenin etkileşimini mümkün olduğu kadar geniş ölçüde kapsayabilmek için çok değişik topraklar kullanılır. Bu yöntemde adsorpsiyon, kimyasalının toprak yüzeylerine olan bağlanmasını tanımlar ve farklı adsorpsiyonları (fiziksel adsorpsiyon, kimyasal adsorpsiyon), yüzeyde katalitik bozunma, yığın adsorpsiyonu ya da kimyasal tepkime gibi süreçleri belirtmez. Toprak tarafından meydana getirilen asılı (kolloidal) parçacıklar üzerine(çap<0.2 mm) gerçekleşecek olan adsorpsiyon dikkate alınmaz.
Adsorpsiyonda en önemli olduğu düşünülen toprak değişkenleri şunlardır:
Organik karbon içeriği (3)(4)(12)(13)(14)(41)(43)(44)(45)(46)(47)(48); kil içeriği ve toprak dokusu (3)(4)(41)(42)(43)(44)(45)(46) (47)(48) ve iyonlaşabilen bileşikler için pH (3)(4)(42).
Maddenin adsorpsiyon/desorpsiyonunda önemli olabilecek olan diğer toprak değişkenleri etkin katyon değiştirme kapasitesi, amorf demir ve aluminyum oksit içerikleri (özellikle volkanik ve tropik topraklar için(4)) ve özgül yüzey alanıdır, (49).
Bu test farklı bir maddenin organik karbon içeriğine, kil içeriğine, toprak dokusuna ve pH değerine sahip farklı topraklara adsorpsiyonunu hesaplamak için tasarlanmıştır.
Bu test 3 aşamadan oluşur:
1.Aşama:
- toprak/çözelti oranı
- test maddesinin dengede adsorplanan miktarı ve adsorpsiyon için denge süresi
- adsorpsiyon maddesinin test kaplarının yüzeylerine olan adsorpsiyonu ve test maddesinin test süresindeki kararlılığını;
belirlemek için yapılan öncül çalışmadan oluşur.
2.Aşama:
İzleme testi: Adsorpsiyon, beş farklı toprakta tek bir konsantrasyonda adsorpsiyon kinetiği ve Kd ve Koc dağılım katsayılarının belirlenmesi ile çalışılır.
3.Aşama
Freundlich adsorptin izotermlerinin belirlenmesi: Derişimin toprak üzerine adsorpsiyon miktarına olan etkisini belirlemek için Freundlich adsorpsiyon izotermlerinin belirlenmesi ve desorpsiyonunda/desorpsiyon kinetiği ve Freundlich desorpsiyon izotermi ile belirlenmesinden oluşur. (EK I)
-
Tanımlar ve birimler
Sembol
|
Tanım
|
birim
|
Ati
|
ti anındaki adsorpsiyon yüzdesi
|
%
|
Aeq
|
Adsorpsiyon dengesindeki adsorpsiyon yüzdesi
|
%
|
msads(ti)
|
ti anında toprağa adsorplanan maddenin kütlesi
|
µg
|
ms ads(Δti)
|
Δti zaman aralığında toprağa adsorplanan test maddesi miktarı
|
µg
|
msads(eq)
|
Adsorpsiyon dengesinde toprağa adsorplanan test maddesi miktarı
|
µg
|
m0
|
Adsorpsiyon testinde tüpte bulunan başlangıçtaki madde kütlesi
|
µg
|
mm ads(ti)
|
(vaA)kadar alikuotta ti anında ölçülen madde miktarı
|
µg
|
maqads(eq)
|
Adsorpsiyon dengesinde çözeltide bulunan madde miktarı
|
µg
|
msoil
|
Kuru toprak miktarı olarak ifade edilen toprak kütlesi
|
g
|
Cst
|
Maddenin stok çözeltisinin kütle derişimi
|
µg cm -3
|
C0
|
Toprakla temasta olan çözeltinin başlangıçtaki kütle derişimi
|
µg cm -3
|
Caq ads (t i)
|
Sulu fazda ti anında maddenin kütle derişimi
|
µg cm -3
|
Csads(eq)
|
Adsorpsiyon dengesinde toparağa adsorplanan maddenin miktarı
|
µg g-1
|
Caqads(eq)
|
Adsorpsiyon dengesinde maddenin sulu fazdaki kütlece derişimi
|
µg cm -3
|
V0
|
Test boyunca toprakla etkileşen sulu fazın başlangıç hacmi
|
cm3
|
vaA
|
Test maddesinin ölçüldüğü hacim
|
cm3
|
Kd
|
Adsorpsiyon için dağılım katsayısı
|
cm3 g-1
|
Koc
|
Organik karbona göre normalize edilmiş adsorpsiyon katsayısı
|
cm3 g-1
|
Kom
|
Organik maddeye göre normalize edilmiş adsorpsiyon katsayısı
|
cm3 g-1
|
KFads
|
Freundlich adsorpsiyon katsayısı
|
µg1-1/n (cm3)1/n g-1
|
1/n
|
Freundlich üsteli
|
|
Dti
|
Ti anındaki desorpsiyon yüzdesi
|
%
|
Δti
|
Δti zamanına karşılık gelen desorpsiyon yüzdesi
|
%
|
Kdes
|
Görünen adsorpsiyon katsayısı
|
cm3 g-1
|
K Fdes
|
Freundlich adsorpsiyon katsayısı
|
µg1-1/n (cm3)1/n g-1
|
maqdes(t i)
|
ti anında topraktan desorbe olan maddenin kütlesi
|
µg
|
maqdes(Δti )
|
Δti aralığında topraktan desorbe olan maddenin kütlesi
|
µg
|
mmdes(eq)
|
Desorpsiyon dengesinde desorbe olan maddenin toplam kütlesi
|
µg
|
maqdes(eq)
|
Desorpsiyon dengesinde sulu fazdaki maddenin toplam kütlesi
|
mg
|
msdes(Δti )
|
Δti zaman sonra toprağın üzerinda adsorbe olan madde kütlesi
|
mg
|
maq A
|
Yetersiz hacim değişimi nedeniyle adsorpsiyon dengesinde kalan madde kütlesi
|
µg
|
Csdes(eq)
|
Desorpsiyon dengesinde toprak üzerinde tutunan maddenin toplam kütlesi
|
µg g-1
|
Caq des(eq)
|
Desorpsiyon dengesinde sulu fazdaki maddenin toplam kütlesi
|
µg cm -3
|
VT
|
Seri yöntemle yürütülen adsorpsiyon kinetiği deneyi sırasında toprakla temas halinde olan toplam sulu faz hacmi
|
cm3
|
VR
|
Adsorpsiyon dengesine ulaştıktan sonra test tüpünden ayrılan ve 0.01 M CaCl2 ile yerdeğiştiren süpernatantın hacmi
|
cm3
|
vaD
|
Seri yöntemle yürütülen desorpsiyon kinetiği deneyi sırasında analitik amaçla (i) zamanında alınan alikuot örnek hacmi
|
cm3
|
Vri
|
Tüp (i) ‘den desorpsiyon kinetiği deneyinde ölçüm için alınan test çözeltisinin hacmi
|
cm3
|
VrF
|
Tüpten desorpsiyon kinetiği deneyinde test maddesinin ölçümü için alınan test çözeltisinin hacmi
|
cm3
|
MB
|
Kütle denkliği
|
%
|
mE
|
İki aşamada test kaplarının duvarlarından ve topraktan ekstrakte edilen toplam madde kütlesi
|
µg
|
Vrec
|
Adsorpsiyon dengesinden sonra geri kazanılan süpernatantın hacmi
|
cm3
|
Pow
|
Oktanol/su dağılım katsayısı
|
|
pKa
|
Ayrışma sabiti
|
|
Sw
|
Sudaki çözünürlük
|
g l-1
|
Dostları ilə paylaş: |