FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

- triazole türevleri (örneğin tebukonazol, triadimefon, tradimenol, triapentenol).

Bu yöntem durağan fazla yada elüsyon çözeltisi ile direkt olarak tepkime veren maddeler için uygulanabilir değildir. Bu yöntem ayrıca inorganik bileşenlerle özgün olarak etkileşen maddeler için uygulanabilir değildir. Yöntem yüzey aktif maddeler, inorganik bileşikler ve orta yada kuvvetli organik asitler yada bazlar için çalışmayabilir. 1.5 ten 5.0’e değişen log Koc değerleri belirlenebilir. İyonlaşabilen bileşikler tamponlanmış bir hareketli fazda ölçülmelidir ancak test maddesinin yada tampon bileşenlerinin çökmemesine dikkat edilmelidir.

6. 
   Kalite kriterleri
   

1. 
   Doğruluk
   

Normal olarak test maddesinin adsorpsiyon katsayısı seri denge yönteminden elde edilen değerden +/- 0.5 log birimi aralığında hesaplanabilir (bkz Ek Tablo 1). Daha yüksek doğruluk referans maddeleri test maddesiyle yapısal olarak ilişkiliyse elde edilebilir.

2. 
   Tekrarlanabilirlik
   

Belirlemeler en azından 2 örnek üzerinde paralel olarak yapılmalıdır. Tek tek ölçümlerden elde edilen log Koc değerleri 0.25 log birimi aralığında olmalıdır.

3. 
   Tekrar üretilebilirlik
   

Bu güne kadarki tecrübeler yöntemin uygulanabilirliğini destekleyicidir. Topraktaki Koc değerlerinin mevcut olduğu 48 maddeyi içeren (çoğunluğu pestisit) bir HPLC yönteminin analizi sonucu korelasyon katsayısı R = 0.95 (10) (11) olarak bulunmuştur. Yer alan 11 labaratuvarla laboratuvarlar arası bir karşılaştırma testi, yöntemi ve sonuçları iyileştirmEk-Ve onaylamak için yürütülmüştür (12). Sonuçlar Ekte Tablo 2’de verilmiştir.

7. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Adsorpsiyon katsayısının ön belirlenmesi
   

Oktanol/su dağılım katsayısı Pow (= Kow) ve belli bir oranda da sudaki çözünürülük özellikle iyonlaşamayan bileşikler için adsorpsiyonun göstergesi olarak kullanılabilir ve dolayısıyla ön aralık bulmada kullanılabilir. Çeşitli grup kimyasallara için korelasyonlar yayınlanmıştır. (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).

1. 
   Düzenek
   

Pulslar halinde çalışmayan (düzgün çalışan) pompa takılı ve uygun bir alıcı aygıtına sahip bir sıvı kromatografi sistemi gereklidir. Enjeksiyon halkası içeren bir enjeksiyon valfinin kullanımı önerilir. Siyanopropil bağlı ticari silika bazlı reçineler (örnek Hypersil and Zorbax CN) kullanılmalıdır. Eneksiyon sistemi ve analitk kolon arasına bir koruyucu kolon yerleştirilebilir. Değişik üreticilerin kolonlarının ayırma etkinliği değişebilir. Yol gösterici olarak aşağıdaki kapasite faktörlerine ulaşılmalıdır.

log Koc = 3.0 için log k'> 0.0 yada log Koc = 2.0 için log k' > - 0.4 metanol/water 55/45 hareketli faz.

2. 
   Hareketli fazlar
   

Çeşitli hareketli fazlar test edilmiştir ve aşağıdakiler önerilir.

– metanol/su (55/45% v/v)

– metanol/0.01M sitrat-tamponu pH 6.0 (55/45% v/v)

Geri elüsyon çözücüsünü hazırlarken HPLC saflığında metanol ve damıtık su yada sitrat tamponu kullanılır. Karışımın kullanım öncesi gazı alınır. İzokratik (tek çözücü derişim akışı veren) bir elüsyon tercih edilmelidir. Eğer metanol/su karışımı uygun değilse diğer organik çözücü/su karşımları örenğin etanol/su yada asetonitril/su denenebilir. İyonlaşabilen bileşikler için pH’ı kararlı kılmak için tamponun kullanımı önerilir. Tuz çökmemesi ve kolon kötüleşmemesine dikkat edilir. Bunlar bazı organik faz/tampon karışımlarında oluşabilir. İyon çiftleştirici reaktifler kullanılmamalıdır çünkü bunlar sabit faza tutunma davranışlarını engeller. Sabit fazdaki bu tür değişimler tersinmezdir. Bu yüzden deneyleri ayrı kolonlarda gerçekleştirmek zorunluluğu doğar.

3. 
   Çözünenler
   

Test ve referans maddeleri hareketli fazda çözünmelidir.

8. 
   Testin performansı
   

1. 
   Test koşulları
   

Test süresince sıcaklıklar ölçülmelidir. Sıcaklık kontrollu bir kolon bölümünün kullanımı, kalibrasyon ve hesaplama deneylerinde ve test maddelerinin ölçümlerinde sabit koşulları sağlamak için önerilir.

2. 
   Ölü zaman t_o’ ın belirlenmesi
   

Ölü zamanın belirlenmesi için iki farklı yöntem kullanılabilir.(ayrıca bkz bölüm 1.2)

1. 
   Ölü zamanın t_o homolog seriler aracılığı ile belirlenmesi
   

Bu yöntemin güvenilir ve standardlaşmış veriler verdiği kanıtlanmıştır. Detaylar için

A-8 Test Yöntemi: Dağılım Katsayısı (n-oktanol/su) HPLC yöntemi

2. 
   Ölü zamanın t_o kolonda tutunmayan inert maddeler ile tayini
   

Bu teknik formamit, üre yada sodyum nitrat çözeltilerinin enjeksiyonuna dayanır. Ölçümler en azından iki kere yapılmalıdır.

3. 
   Alıkonulma zamanlarının belirlenmesi tR
   

Referans maddeler bölüm 1.3 ‘de açıklandığı şekilde seçilmelidir. Bunlar karışım standardı halinde alıkonulma zamanlarını belirlemek için enjekte edilebilir. Ancak bunun için tek koşul bir standardın alıkonulma zamanının diğerinden etkilenmemesidir. Kalibrasyon düzenli zaman aralıklarında yapılmalıdır ve kolon performansının beklenmedik değişimlerini bertaraf etmek için en azından günde iki kere tekrar edilmelidir. En iyisi, alıkonma zamanlarının kaymadığını doğrulamak için kalibrasyon enjeksiyonları test maddesi enjeksiyonlarından önce ve sonra yapılmalıdır. Test maddeleri kolonun aşırı yüklenmesinin önüne geçmek için mümkün olduğu kadar az miktarda ama ayrı olarak enjekte edilir ve alıkonulma zamanları belirlenir. Ölçümün güvenirliğini artırmak için en azında iki ölçüm yapılmalıdır. Tekil ölçümlerden türetilen log Koc değerleri 0,25 log birimi aralığına düşmelidir.

4. 
   Değerledirme
   

kapasite faktörü k’ eşitlik 4’e göre seçilen referans maddelerinin ölü zamanı ve alıkonulma zamanlarından hesaplanır (bkz bölüm 1.2).

Referans maddelerin log k’ değerleri kesikli denge deneylerinden elde edilen log Koc değerlerine karşı grafiğe geçirilir. Bu grafiği kullanarak bir test maddesinin log k' değerinden log Koc değeri hesaplanır. Eğer gerçek sonuçlar log Koc değerinin kalibrasyon aralığının dışında olduğunu gösterirse test daha uygun bir referans madde kullanılarak tekrarlanmalıdır.

2. 
   VERİLER VE RAPORLAMA
   

Test raporu şağıdaki bilgileri içermelidir.

• 
  testin ve referans maddeleri ve saflıklarının tanımı ve eğer gerekli ise pKa değerleri
  
• 
  ekipmanın açıklması ve çalışma koşulları analitik kolonun tür ve boyutları, ölçüm yolları, hareketli faz (bileşenleri, oranı ve pH), ölçümler esnasındaki sıcaklık aralığı
  
• 
  ölü zaman ve belirlenmesi için kullanılan yöntem
  
• 
  test maddesinin büyüklükleri ve kolona verilen referans maddeler
  
• 
  kalibrasyon için kullanılan maddelerin alıkonulma zamanları
  
• 
  uygun regresyon doğrusunun ayrıntıları (log k' vs log Koc) ve regresyon doğrusunun grafiği
  
• 
  ortalama alıkonulma zamanı ve test maddesi için hesaplanan log Koc değeri
  
• 
  kromatogramlar
  

3. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, chapt. 4, McGraw-Hill, New York.
   
2. 
   J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.
   
3. 
   G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, 1050-1059.
   
4. 
   C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, 227-231.
   
5. 
   Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 297-312.
   
6. 
   C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, 831-832.
   
7. 
   S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, 833-846.
   
8. 
   W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere , 35(1/2), 121-128.
   
9. 
   M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), 2493-2504.
   
10. 
    W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), 2341-2352.
    
11. 
    B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, 285-304.
    
12. 
    W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.
    

Ek-I
Tablo 1
Toprak ve lağım çamurları için Koc değerlerinin karşılaştırılması ve HPLC izleme yöntemi ile hesaplanan değerleri



KAYNAKLAR

1 W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 - 128.

2 W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), 107 – 119.

Tablo 2
HPLC-yönteminin geçerliliğini test etmEk-Ve iyileştirmek için teste katılan laboratuarların (11 laboratuvar katılımlı)

sonuçlarının kendi arasında karşılaştırılması

KAYNAKLAR

1 W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 - 128.

Tablo 3
HPLC izleme yöntemi için

toprak adsorpsiyon verilerine göre önerilen referans maddeler

KAYNAKLAR

/a/ W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC.

UBA R & D Report No. 106 01 044 (1994).

/b/ B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285-304.

/c/ Data provided by industry.

C.20 DAPHNIA MAGNA ÜREME TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

Bu üreme toksisitesi test yöntemi, OECD TG 211 (1998) yöntemi ile eşdeğerdir.

1. 
   Giriş
   

Testin ana amacı, kimyasalların Daphnia magna üremesinin verimliliği üzerindeki etkisini değerlendirmektir.

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Ebeveyn hayvanlar: testin başlangıcında bulunan ve üreme verimliliği çalışmasının amacı olan dişi Daphnia’ dır.
Yavrular (döl): test sürecinde ebeveyn hayvanlar tarafından üretilen genç Daphnia lar.
Olumsuz Etki Gözlemlenen En Düşük Konsantrasyon (LOEC): üreme ve ebeveyn hayvanların ölümleri (p<0,05’ de) üzerinde kontrol grupları ile karşılaştırıldığında belirtilen maruz kalma periyodu içinde istatistiksel olarak önemli bir etkisi olduğu gözlenen test edilen en düşük madde derişimdir. Fakat LOEC’ den yüksek tüm test derişimleri LOEC’ te gözlenen zararlı etkilere eşit veya daha fazla olmalıdır. Bu iki koşul sağlanmadığında, LOEC’ in (ve dolayısıyla NOEC) nasıl seçildiği ile ilgili tam bir açıklama verilmelidir.
Olumsuz Etki Gözlemlenmeyen Konsantrasyon (NOEC): kontrol grubu ile karşılaştırıldığında belirtilen maruz kalma süresi içinde, istatistiksel olarak belirgin bir etkinin (p<0,05) var olmadığı LOEC’ in hemen altındaki test derişimidir.
EC_x: Daphnia magna’ nın belirtilen maruz kalma süresi içerisinde üremesinde yüzde x azalmaya sebep olan su içinde çözünmüş test maddesi derişimidir.
İçsel (kendine özgü) artış oranı: üreme verimini ve yaşlanmaya özgü ölümü (20)(21)(22) birleştiren popülasyon büyümesinin bir ölçütüdür.
Gözlem sınırı:gözlemlenebilen fakat miktarı belirlenemeyen en düşük derişimdir.
Tayin sınırı: miktar olarak ölçülebilen en düşük derişimdir.
Ölüm oranı: bir hayvan hareketsizken ölü olarak kaydedilir, örneğin yüzemezken, veya test kabının hafifce çalkalanmasından sonra 15 saniye içinde ilave bir hareket gözlenmediği durumlarda (Farklı bir tanım kullanılıyorsa, referansı ile birlikte rapor edilmelidir).

3. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Testin başlangıcında 24 saatten daha az yaşlı olan genç dişi Daphnia (ebeveyn hayvanlar) suya eklenerek belirtilen derişim aralığında test maddesine maruz bırakılır. Test süresi 21 gündür. Test sonunda ebeveyn hayvan başına yaşayan üretilmiş yavruların toplam sayısı değerlendirilir. Bu yetişkinler vasıtasıyla üretilen ve test esnasında ölen gençlerin hesaplamalardan çıkarılması anlamına gelir. Ebeveyn hayvanların üreme verimi diğer şekillerde ifade edilir (örneğin yavrunun gözlendiği ilk günden itibaren günde ebeveyn hayvan başına üretilen yaşayan yavru sayısı olarak) fakat ek olarak bunlar test sonunda yaşayan ebeveyn başına üretilen geçlerin toplam sayısı olarak rapor edilmelidir. Test maddesine maruz kalan hayvanların üreme verimi olumsuz etkinin gözlemlendiği en düşük konsantrasyon (LOEC) ve bundan dolayı olumsuz etkinin gözlemlenmediği konsantrasyonu (NOEC) belirlemek için kontrol veya kontrollerle karşılaştırılmalıdır. Ayrıca ve mümkün oldukça üreme veriminde % x azalmaya sebep olan derişimin hesaplanması için veriler regresyon modeli kullanılarak analiz edilir. (örneğin EC₅₀, EC₂₀ veya EC₁₀).

Ebeveyn hayvanların hayatta kalması ve birinci kuluçka üretim zamanı da rapor edilmelidir. Maddelerin büyüme (örneğin uzunluk) gibi parametreler üzerindeki diğer etkileri ve olası kendine özgü artış oranı da incelenebilir.

4. 
   Test maddesi ile ilgili bilgi
   

Daphnia magna ile yürütülen Akut Toksisite testinin sonuçları (bakınız Yöntem C.2, Bölüm I) mevcut olmalıdır. Bu sonuçlar üreme testlerinde uygun test derişimi aralıklarının seçimi için faydalı olabilir. Test maddesinin suda çözünürlüğü ve buhar basıncı bilinmeli ve test çözeltisi içindeki test maddesinin miktar tayini için geri kazanım verimliliği ve tayin sınırı ile rapor edilmiş anlamlı bir analitik yönteminin mevcut olması gerekir.

Yapısal formül, maddenin saflığı, ışıktaki kararlılığı, test koşulları altında kararlılığı, pK_a, P_ow ve kolay biyolojik bozunabilirlik için yapılmış test (Bakınız yöntem C.4) sonuçları gibi test maddesi hakkında bilgiler test koşullarının oluşturulmasında faydalı olabilir.

5. 
   Testin geçerliliği
   

Testin geçerli olabilmesi için kontrol ve kontrollerde aşağıdaki yapılabilirlilik ölçütlerinin sağlanması gerekir:

• 
  ebeveyn hayvanların ölümü (mortalitesi) (dişi Daphnia) test sonunda % 20’yi geçemez;
  
• 
  hayatta kalan ebeveyn hayvan başına üretilmiş hayatta olan yavruların ortalama sayısı test sonunda ≥60 dır.
  

6. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Düzenek
   

Test maddesi ile temas halinde olacak test kapları ve diğer cihazlar tamamen cam veya kimyasal olarak reaksiyona girmeyen malzemeden yapılmış olmalıdır. Test kapları normal olarak cam beherler olacaktır.

Ek olarak, aşağıdaki gereçlerin bazıları veya tamamı gereklidir;

• 
  oksijen metre (düşük hacimli örneklerde çözünmüş oksijen miktarını ölçmek için mikroelektrot ile ve diğer uygun donanıma sahip);
  
• 
  sıcaklık kontrolu için yeterli cihazlar;
  
• 
  pH metre;
  
• 
  su sertliğinin belirlenmesi için donanım;
  
• 
  suyun toplam organik karbon (TOC) miktarının belirlenmesi için donanım veya kimyasal oksijen ihtiyacının (COD) belirlenmesi için donanım;
  
• 
  ışıklandırma yönetiminin kontrolu ve ışık şiddetinin ölçümü için yeterli cihazlar;
  

2. 
   Test Organizması
   

Testte kullanılacak tür Daphnia magna Straus’ dur. Geçerlilik ölçütleri sağlayan diğer Daphnia türlerinin kullanımı da uygundur (Daphnia türleri için geçerlilik ölçütleri kontrollerdeki üreme verimi ile ilgilidir). Eğer diğer Daphnia türleri kullanılıyorsa bunlar açıkça tanımlanmalı ve kullanımın haklı gerekçeleri açıkça belirtilmelidir.

Tercihen, klon genetik kopyası (genotyping) ile tanımlanmalıdır. Araştırma (1) Klon A’nın (Fransada IRCHA kaynaklı) (3) üreme performansını yöntemde açıklanan koşullar altında kültürlendiğinde hayatta kalan her ebeveyn başına ≥60 yavru kalite ölçütünü sürekli olarak sağladığını göstermektedir. Fakat, Daphnia kültürlerinin testin geçerlilik ölçütlerini sağladığı gösterilen diğer klonlarda kabul edilebilirdir.
Test başlangıcında, hayvanlar 24 saatten daha az yaşlı olmalı ve ilk yavru soyundan olmamalıdır. Sağlıklı stoklardan türetilmiş olmalıdır (örneğin yüksek ölüm oranı, erkeklerin baskınlığı ve ephippia, ilk yavrunun üretilmesinde gecikme, renksiz hayvanlar, vs. gibi stres işaretleri göstermeyen). Stok hayvanları test kullanılacak koşullara benzer kültür koşullarında korunmalıdır (ışık, sıcaklık, ortam, birim hacim başına besleme ve hayvan). Eğer testte kullanılacak Daphnia kültür ortamı rutin olarak kullanılan Daphnia kültüründen farklı ise, normal olarak 3 haftalık bir test öncesi alıştırma periyodu dahil etmek ebeveyn hayvanların strese girmesini engellemek için iyi bir alıştırma olacaktır.

3. 
   Test Ortamı
   

Tamamıyla tanımlanmış bir ortamın testte kullanılması gerekmektedir. Karakterize etmenin zor olduğu katkıların (örneğin deniz yosunu, toprak ekstraktı vs.) kullanımını engelleyebilir, ve böylece laboratuarlar arası standardlaştırma imkanlarını da artırabilir.

Elendt M4 (4) ve M7 ortamı (Bakınız Ek l) bu amaç için uygun bulunmuştur. Bununla birlikte, diğer ortamlar (örneğin (5)(6)) Daphnia kültürlerin testinin geçerlilik ölçütlerini yerine getirme performansını sağlayanlar da uygundur.
Tanımlanmamış katkılar içeren ortam kullanılırsa, bu katkılar açıkça belirlenmeli ve bileşim hakkındaki test raporunda gerekli bilgiler, özellikle karbon içeriğini dikkate alarak sağlanmalıdır. Organik katkının stok’unun Toplam Organik Karbon (TOC) ve/veya Kimyasal Oksijen İhtiyacı (COD) belirlenmesi gereklidir ve sonuç olarak test ortamı içindeki TOC/COD’ a yapılan katkının hesabı yapılır. Ortam (örneğin deniz yosunu (Algae) eklemeden öce) içindeki TOC düzeyleri 2 mg/l altında olması zorunluluğu vardır.
Metal içeren test maddelerini test ederken, test ortamının test maddesinin toksisitesini artırabilecek özelliklerinin (örneğin sertlik, şelatlaşma kapasitesi) farkına varmak önemlidir. Bu sebeple tamamen tanımlanmış ortam arzu edilir. Fakat, şu anda, uygun uzun vadeli Daphnia magna kültürü olarak bilinen ortamlar sadece Elendt M4 ve M7 dir. Her iki ortamda şelatlaştırıcı ajan EDTA içerir. EDTA içermeyen M4 ve M7 ortamlarında üreme testi gerçekleştirildiğinde, çalışma (2) kadmiyumun “görünür toksisitesinin” genel olarak daha az olduğunu göstermektedir. Bu yüzden M4 ve M7 metal içeren test maddeleri için zorunlu değildir, ve bilinen şelatlaştırıcı ajanlar içeren diğer ortamların kullanımından da kaçınmak gerekir. Metal içeren maddeler için EDTA içermeyen, yosun ekstraktı (8) eklenmiş ASTM tarafından belirtilen yeniden oluşturulmuş sert tatlı su (7) gibi alternatif ortamların kullanılması tavsiye edilebilir. ASTM tarafından belirtilen yeniden oluşturulmuş sert tatlı suyun bu bileşimi ve yosun ekstraktı, eklenen yosun ekstraktı içindeki organik karbon içeriği yüzünden hala yumuşak şelatlaştırma etkisi göstermesine rağmen, uzun vadeli kültür ve Daphnia magna testi (2) için uygundur.
Testin başlangıcında ve test esnasında, çözünmüş oksijen derişimi 3 mg/l’nin üzerinde olmalıdır. pH 6-9 aralığında olmalı ve normal olarak herhangi bir testte 1,5 birimden fazla değişmemelidir. 140 mg/l üzerindeki sertlik (CaCO₃ olarak) zorunludur. Bu seviye ve üzerindeki testler geçerlilik ölçütleriyle (9)(10) uyum içinde üreme performansı gösterir.

4. 
   Test çözeltileri
   

Çoğunlukla stok çözeltilerin seyreltilmesiyle seçilen derişimlerdeki çözeltiler hazırlanır. Stok çözeltiler tercihen test maddesi ortamı içerisinde çözülerek hazırlanır.

Organik çözücülerin ve dağıtıcıların kullanımı uygun derişimde stok çözelti hazırlamak için bazı durumlarda gerekli olabilir, fakat bu tip maddelerin kullanımından kaçınmak için her türlü caba gösterilmelidir. Uygun çözcülere örnek olarak aseton, etanol, dimetilformamid ve trietilenglikol gösterilebilir. Uygun dağıtıcılara örnek olarak Cremophor RH4, metilselüloz %0,01 ve HCO-40 gösterilebilir. Hiçbir durumda, çözelti içindeki test maddesi test ortamı içerisindeki çözünürlük sınırını aşmamalıdır.

Çözücüler Su içinde doğru olarak dozlanabilen stok çözeltilerinin hazırlanmasında kullanılır. En son test ortamı içerisindeki gerekli çözücü derişiminde (örneğin ≤0,1 ml/l), yukarıda listelenen çözücüler toksik olmayacak ve maddenin suda çözünürlüğünü artırmayacaktır.

Dağıtıcılar doğru dozlama ve dağılıma yardımcı olabilirler. En son test ortamı içerisindeki gerekli çözücü derişiminde (örneğin ≤0,1 ml/l), yukarıda listelenen dağıtıcılar toksik olmayacak ve maddenin suda çözünürlüğünü artırmayacaktır.

7. 
   Testin dizaynı
   

İşlemler test kaplarına dağıtılmalı ve test kabının takip eden tüm işlemleri rastlantısal olacak şekilde yapılmalıdır. Bunu yaparken ortaya çıkan başarısızlıklar derişim etkisi olarak yorumlanabilen yanılgıyla sonuçlanabilir. Özellikle, deneysel birimler işlem veya derişim sırasına göre yürütülüyorsa, o zaman bazen işlemci yorgunluğu veya diğer hatalar gibi zamanla ilgili etkiler, yüksek derişimlerde daha büyük etkilere neden olabilir. Ayrıca, eğer test sonuçları testin ilk ve çevresel koşullarından etkilenme eğilimindeyse, mesela laboratuvardaki pozisyonu gibi, testin durdurulması göz önünde bulundurulmalıdır.

8. 
   İşlem
   

1. 
   Maruz kalma koşulları
   

1. 
   Süre
   

Test süresi 21 gündür.

2. 
   Yükleme
   

Ebeveyn hayvanlar her test kabında bir tane olacak şekilde, her test kabı içinde 50-100 ml ortam ile tek tek korunmalıdır.

Kimyasal analiz için kullanılan tekrarların toplanmasına izin verilebilir olsa da, test maddesi derişimini belirlemek için kullanılan analitik işlemin gerekliliklerini karşılamak, için bazen daha büyük hacimler gerekebilir. 100 ml’den daha büyük hacimler kullanılıyorsa, Daphnia’ ya verilen yiyecek payı, yeterli besinin varlığından emin olmak ve kalite ölçütlerine uygunluk için artırılması gerekebilir. Akış yollu testler için, teknik sebeplerden dolayı alternatif dizaynlar dikkate alınabilir (örneğin daha geniş hacimdeki 10 hayvanlık dört grup), fakat test dizaynındaki en küçük değişiklik rapor edilmelidir.

3. 
   Hayvan sayıları
   

Yarı statik testler için, her test derişiminde ve kontrol serilerinde en az 10 hayvan bireysel olarak bulunmalıdır.

Akış yollu testler için, her test derişiminde 10’lu gruplar halinde dörde bölünmüş 40 hayvanın uygun olduğu gösterilmektedir (1). Daha düşük sayılardaki bir test organizması için derişim başına eşit sayıda hayvan (örneğin her biri için 4 tekrar ile beş daphnid) ile iki veya daha fazla tekrarlar halinde en az 20 hayvan kullanılması zorunludur. Testlerde hayvanların gruplar halinde tutulmasına dikkat edilmelidir, eğer ebeveyn hayvanlar ölürse, test sonunda ebeveyn hayvan başına üretilen yaşayan yavru toplam sayısı olarak üreme veriminin ifade edilmesi mümkün olmayacaktır. Böyle durumlarda üreme verimi, “test başında varolan ebeveyn sayısı başına üretilmiş yaşayan yavruların toplam sayısı” olarak ifade edilebilir.

4. 
   Besleme
   

Yarı statik testler için besleme tercihen günlük olarak yapılmalı, değilse haftada en az üç kere (örneğin ortam değişikliklerine uygun olarak) yapılmalıdır. Bu durumdan sapmalar (örneğin akış yollu testlerde) rapor edilmelidir.

Test esnasında ebeveyn hayvanların diyeti, tercihen aşağıdakilerden biri veya birkaçının yaşayan deniz yosunu hücreleri olmalıdır: Chlorella sp, Selenastrum capricornutum (şimdi Pseudokirchneriella subcapitat (11)) ve Scenedesmus subspicatus. İhtiyacı karşılayacak diyet her ebeveyn hayvana sağlanan organik karbon (C) miktarı esasına göre olmalıdır. Bir araştırma Daphnia magna için 0,1 ve 0,2 mg C/Daphnia/gün arasındaki günlük yiyecek istihkakının test ölçütlerini sağlamak için gerekli olan yavru sayısına ulaşmak için yeterli olduğunu göstermektedir. Test periyodu boyunca yiyecek miktarları hem istikrarlı bir oranda sağlanabilir hem de daha sonra arzu edildiğinde başlangıçta veya test esnasında ebeveyn hayvanların büyümesi dikkate alındığında artırılacak şekilde daha düşük oranlarda da sağlanabilir. Bu durumda, günlük verilen yiyecek istihkakı, gerekli olan 0,1 – 0,2 mg C/Daphnia/gün aralığında kalmaya devam etmelidir.
Gerekli olan günlük yem seviyesinde (örneğin karbon içeriği ölçümünün zaman alıcı olmasından dolayı kolaylık sağlamak için) besleme yapmak için deniz yosunu hücresi sayısı veya ışık ölçümü gibi ikame ölçümler kullanılacaksa, her laboratuar denizyosunu kültüründeki karbon miktarının ikame ölçümü ile ilgili kendi sayısal bağıntıları gösteren çizelgesini (nomograph) hazırlamalıdır (Bakınız EK-II nomograf (sayısal bağıntıları gösteren çizelge) hazırlanması için). Nomograflar en az yıllık olarak ve deniz yosunu kültür koşulları değiştikçe kontrol edilmelidir. Işık absorbansının karbon miktarı için hücre sayısına göre daha iyi bir vasi ölçüm olduğu bulunmuştur (13).
Test kaplarına transfer edilen deniz yosunu kültür ortamı hacmini en az indirmek için Daphnia derişik deniz yosunu süspansiyonu ile beslenmelidir. Deniz yosunu derişimine, santrifüjü takiben saf su içinde, iyonu giderilmiş su içinde veya Daphnia kültür ortamında yeniden yapılan süspansiyon ile ulaşılır.

5. 
   Işık
   

15-20 µE.m^-2.s^-1 değerini geçmeyen ışık şiddetinde 16 saatlik ışık.

6. 
   Sıcaklık
   

Test ortamının sıcaklığı 18-22 °C aralığında olmalıdır. Fakat mümkünse hiçbir testte sıcaklık belirtilen sınırlarda 2 °C’ tan daha fazla değişmez (örneğin 18-20, 19-21 veya 20-22 °C). Sıcaklığın izlenmesi amacıyla, ek test kaplarının kullanılması uygun olabilir.

7. 
   Havalandırma
   

Test esnasında test kapları havalandırılmamalıdır.

2. 
   Test derişimi
   

Normal olarak, 3,2’yi geçmeyen ayırma faktörü ile geometrik seriler halinde düzenlenmiş en az beş test derişimi olmalıdır ve her test derişimi için uygun sayıda tekrarlar kullanılmalıdır (Bakınız bölüm 1.8.1.3). Eğer beş derşimden daha az derişim kullanılırsa haklı gerekçeler belirtilmelidir. Maddeler test ortamında çözünürlük sınırlarının üzerinde test edilmemelidir.

Derişim aralığını ayarlarken aşağıdaki hususlara dikkat edilmelidir:

1. 
   Eğer amaç LOEC/NOEC’i elde etmek ise, en düşük test konsantrasyonu yeterince düşük olmalıdır, şöyleki, o konsantrasyondaki doğurganlık kontrolden belirgin olarak daha azdır. Eğer bu böyle değil ise test azaltılmış en düşük konsantrasyonla tekrarlanmalıdır.
   
2. 
   Eğer amaç LOEC/NOEC’i elde etmek ise, en yüksek test konsantrasyonu yeterince yüksek olmalıdır, şöyleki, o konsantrasyondaki doğurganlık kontrolden belirgin olarak daha azdır. Eğer bu böyle değil ise test artırılmış en yüksek konsantrasyonla tekrarlanmalıdır.
   
3. 
   Üreme üzerindeki etkiler için EC_x değeri hesaplanırken, uygun güvenirlik seviyesi ile EC_x değerlerini tanımlamak için yeterli derişimlerin kullanılması tavsiye edilir. Üreme üzerindeki etkiler için EC₅₀ değeri hesaplanırken, en yüksek test derişiminin EC50 değerinden büyük olması tavsiye edilir. Aksi takdirde, EC50’ yi hesaplamak mümkün olmasına rağmen, EC50 için güvenirlik aralığı çok geniş olacaktır ve uygun modelin yeterliliğinin tatmin edici şekilde değerlendirilmesi mümkün olamayacaktır.
   
4. 
   Test derişim aralığı, tercihen yetişkinlerin hayatta kalması üzerinde belirgin bir etkisi olan herhangi bir derişimi içermemelidir. Çünkü bu test derişiminin doğasını üreme testinden, daha kompleks istatistiksel analizler gerektiren birleştirilmiş üreme ve ölüm oranı testine dönüştürecektir.
   

Test maddesinin toksisitesi ile ilgili daha önceki bilgiler (örneğin akut testinden ve/veya aralık bulma çalışmalarından) uygun test derişimlerinin seçilmesinde yardımcı olabilir.

Test çözeltilerinin hazırlanmasında yardımcı olarak bir çözücü veya dağıtıcı (dipersant) kullanıldığında (Bakınız bölüm 1.6.4), test kabındaki son derişim 0,1 ml/l’ den daha fazla olmamalı ve tüm test kaplarında aynı olmalıdır.

3. 
   Kontroller
   

Bir test ortamı kontrol serisi ve hatta, eğer anlamlı ise, çözücü ve dağıtıcı içeren bir kontrol serisi, test serisine ek olarak yürütülebilir. Bu yapıldığında çözücü ve dağıtıcı derişimi test maddesini içeren test kaplarınınkiyle aynı olmalıdır. Uygun sayıda denek kullanılarak tekrar yapılmalıdır. (Bakınız bölüm 1.8.1.3).

Genel olarak, iyi yürüyen bir sistemde, kontrol(ler) içindeki ebeveyn hayvan başına üretilen yaşayan yavru ortalama sayısı civarındaki değişme katsayısı ≤%25 olmalı ve bireysel olarak ele alınan hayvanların kullanıldığı test dizaynı için bu rapor edilmelidir.

4. 
   Test ortamının yenilenmesi
   

Test ortamının yenilenme sıklığı, test maddesinin kararlılığına bağlıdır, fakat yenileme haftada en az üç kere yapılmalıdır. Eğer, ilk kararlılık testlerinden (Bakınız bölüm 1.4) maksimum yenileme periyodu boyunca (örneğin 3gün) test maddesi derişimi kararlı değilse (örneğin tanımlanan %80 – 120 aralığının dışında kalması veya ölçülen ilk derişimin %80’ nin altına düşmesi) daha sık ortam yenilemesi veya akış yollu test kullanılması düşünülmelidir.

Yarı statik testlerde ortam yenilendiği zaman, test kaplarının ikinci bir serisi hazırlanır ve ebeveyn hayvanlar uygun çaptaki cam bir pipet yardımıyla bunlara transfer edilir. Daphnia ile transfer edilen ortam hacmi minimuma indirilmelidir.

5. 
   Gözlemler
   

Test sırasında yapılan gözlemlerin sonuçları veri kağıtlarına kaydedilmelidir (Bakınız Ek-III Ek-III ve IV’ teki örnekler). Eğer başka ölçümler gerekliyse (Bakınız 1.3 ve 1.8.8) ek gözlemlere ihtiyaç duyulabilir.

6. 
   Yavrular
   

Her ebeveyn hayvandan üretilen yavrular, yetişkinler için verilen besinleri tüketmelerini engellemek için tercihen ilk yavruların görülmesinden itibaren ayrılmalı ve günlük olarak sayılmalıdır. Bu yöntemin amacı ile ilgili olarak sadece yaşayan yavruların sayılmasına gerEk-Vardır, fakat başarısızlıkla sonuçlanmış yumurtaların veya ölü yavruların varlığında bunlarda kaydedilmelidir.

7. 
   Ölüm oranı
   

Ebeveyn hayvanlara ait olan ölüm oranı yavruların sayıldığı zamanla aynı zamanda tercihen günlük olarak kaydedilmelidir.

8. 
   Diğer değişkenler
   

Bu yöntem prensip olarak üreme üzerindeki etkileri değerlendirmek için dizayn edilmiş olsa da, miktarları istatistiksel analize imkan verecek biçimde yeterince belirlenmiş diğer etkiler için de kullanılabilir. Büyüme ölçümleri şiddetle arzu edilir, çünkü yanlız üreme ölçümünden daha kullanışlı olabilen öldürücü yan etkiler hakkında da bilgi sağlayan bir ölçümdür; test sonunda ebeveyn hayvanların uzunluklarının ölçümü (örneğin anal omurgayı hariç tutarak vücut uzunluğu) zorunludur. ölçülebilen ve hesaplanabilen diğer parametreler, ilk yavrunun üretimi için geçen zamanı (ve müteakip yavrular), hayvan başına düşen yavruların sayısı ve boyutu, iptal edilen yavruların sayısı, erkeklerin veya ephippia varlığı ve içsel nüfus artış hızı.

9. 
   Analitik tayinlerin ve ölçümlerin sıklığı
   

Oksijen derişimi, sıcaklık, sertlik ve pH değerleri, taze ve eski ortamda, kontrol veya kontroller içinde ve en yüksek test derişimi içinde, en az haftada bir ölçülmelidir.

Test süresince, düzenli aralıklarla test maddesinin derişimi tayin edilmelidir.
Yarı statik testlerde, test maddesi derişimi, tanımlanmış derişimin (örneğin %80 – 120 aralığı içinde – Bakınız 1.4 ve 1.8.4 ) ± % 20’ si içinde kalması beklenir. Taze olarak hazırlandığında ve testin ilk haftası içinde (örneğin taze olarak hazırlandığında ve yenileme esnasında aynı çözeltiden alınan örnekler analiz yapılmalıdır) üzerinde bir vesile ile yenileme işleminin gerçekleştiği bir zamanda en yüksEk-Ve en düşük test derişimlerinin analiz edilmesi zorunludur. Daha sonra bu tayinler en az haftalık aralıklarla tekrar edilmelidir.
Tanımlanan derişimin ±%20’ si içinde kalması beklenmeyen test maddesi derişimlerinin testleri için, taze olarak hazırlandığında ve yenileme zamanlarında bütün test derişimlerinin analizi gereklidir. Her ne kadar bu testler için, test maddesinin ölçülen ilk derişimi tanımlanmış derişimin ±%20’ si içinde bulunmadığında fakat ilk derişimin tekrarlanabilir ve kararlı olduğunu göstermek için yeterli delil sağlanabildiğinde, kimyasal tayinler 2 ve 3 hafta içinde en yüksEk-Ve en düşük test derişim tayinlerine indirgenebilir. Tüm durumlarda, test maddesi derişim tayininin yenileme öncesinde, sadece her test derişiminde bir tekrar kabında gerçekleştirilmesine gerEk-Vardır.
Eğer bir akış yollu test kullanılıyorsa, yarı statik testler için açıklanan benzer örnekleme yönetiminin kullanımı uygundur (fakat eski çözeltilerin ölçümü bu durumda kabul edilemez). Fakat test derişimlerinin kararlı olarak kaldığında emin olmak için, ilk hafta içinde örnekleme zamanı sayıların artırılması tavsiye edilebilir. Bu tiplerdeki testler içinde, seyrelticinin ve test maddesinin akış hızı günlük olarak kontrol edilmelidir.
Test boyunca, test edilen madde derişiminin tanımlanan veya ölçülen ilk derişimin %±20’ si içinde tatmin edici derecede korunduğunu gösteren deliller varsa, o zaman sonuçlar tanımlanan ve ölçülen ilk değerler üzerine dayandırılabilir. Eğer tanımlanan ve ölçülen ilk derişimden sapma %±20’ den daha büyükse, sonuçlar zaman ağırlıklı ortalama şeklinde ifade edilmelidir (Bakınız Ek-V).

2.