FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- TABLO I: CİLT REAKSİYONLARININ DERECELENDİRİLMESİ
- B.5 AKUT TOKSİSİTE: GÖZDE AŞINMA/TAHRİŞ YÖNTEM
KAYNAKLAR (1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. (2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. InVitro, 2, 19-26. (3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. (4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, “Skin Irritant”, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. (5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin irritation. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. (5a) Test Yöntemi B.40 Cilt Aşınması. (6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 - 24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.html). (7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). (8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Hayvans Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm) (9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Available from OECD Secretariat upon request]. TABLO I: CİLT REAKSİYONLARININ DERECELENDİRİLMESİ Deride kızarma ve kabuk oluşumu Kızarıklık yok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . …….. 0 Çok hafif kızarıklık (silik) . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . .. . ......... 1 Belirgin kızarıklık . . . . . . . . . . . . . .. . .… . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 2 Orta şiddetten- ciddi kızarıklık . . . . . … . . . . . .. .. . . . .. . . . . . .. .. ........... 3 Ciddi kızarıklıktan (biftek kırmızılığı) kızarıklığın derecelendirilmesini önleyen kabuk oluşumuna. . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . …………. ……... 4 Maksimum olasılık: 4
Ödem yok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . .. . . . .. . . . . . . . . . ..0 Çok hafif ödem (silik). . . . . . . . . .. . . . . .. . . . .. . . . . .. . . . . .. . . .. . . .. . . . .. . 1 Hafif ödem (alanın kenarları açık şekilde kaldırılarak iyice tanımlanır)... ….. 2 Orta şiddette ödem (yaklaşık 1 mm’ye çıkar). . . . . . . … . .. . .. . .. .. . . . . .. .. 3 Ciddi ödem (1 mm’den daha fazla ve maruz kalan alanının üzerine çıkar…... 4 Maksimum olasılık: 4 Şüpheli cevapları netleştirmek için histopatolojik inceleme yürütülebilir. Ek-I Deride Tahriş ve Aşınma için Sıralı Test Uygulama Stratejisi GENEL GÖRÜŞLER Gerek güvenilir bilim ve gerekse hayvan refahı açısından, hayvanların gereksiz kullanımından kaçınmak ve hayvanlarda ciddi tepkiler meydana getiren testleri azaltmak önemlidir. Bir maddenin potansiyel olarak cildi aşındırmasına/tahriş etmesine ilişkin tüm bilgiler, in vivo testler üzerinde düşünülmeden önce değerlendirilmelidir. Bir maddenin dermal aşınma veya tahriş oluşturma potansiyelini sınıflandırmak için, önceden elde edilmiş yeterli bilgi olabilir ve test hayvanları üzerinde deney yapılmasına gerek kalmayabilir. Bu yüzden, delilin ispat kuvveti analizi ve sıralı test uygulama stratejisinin kullanılması in vivo testlere olan ihtiyacı, özellikle de madde ciddi reaksiyonlar meydana getirebilecek nitelikteyse, en aza indirecektir. Maddenin cildi tahriş etme/aşındırma potansiyeli olup olmadığı hakkında karar vermek için mevcut bilgiler değerlendirilirken, in vivo dermal çalışmalar haricinde, ilave çalışmalar yürütülüp yürütülmeyeceğini belirlemek için delilin ispat kuvveti analizi kullanılması tavsiye edilir. İlave çalışmaların gerekli olduğu durumlarda, ilgili verilerin oluşturulması için sıralı test uygulama stratejisinin de kullanılması tavsiye edilir. Daha önce teste tabi tutulmamış kimyasalların dermal aşınma/tahriş potansiyelinin değerlendirmesinde kullanılacak verilerin geliştirilmesi için sıralı test uygulama stratejisi kullanılmalıdır. Bu ekte tarif edilen test uygulama stratejisi OECD çalıştayında geliştirilmiştir (1) ve daha sonra onaylanarak Kimyasal Maddelerin İnsan Sağlığı ve Çevreye Etkileri için Uyumlu Hale Getirilmiş Bütünleştirilmiş Tehlike Sınıflandırma Sistemi içinde genişletilmiştir, Kasım 1998’de 28 inci Kimyasallar Komitesi ortak toplantısı ve Kimyasallar Üzerinde Çalışma Grubu Toplantısında kabul edilmiştir(2). Her ne kadar bu sıralı test uygulama stratejisi, test yöntemi B4’ün bütününü oluşturmuyorsa da ciltteki tahriş/aşınma karakteristiği belirlenmesi için tavsiye edilen yaklaşımı ifade eder. Bu yaklaşım, ciltte tahriş/aşınma için uygulanan in vivo testleri için hem en iyi pratik hem de etik bir değerlendirmedir. Test uygulama yöntemi, in vivo testlerin yürütülmesi için bir rehnberlik sağlar ve böyle bir teste başlamadan önce vurgulanması gereken faktörleri özetler. Strateji, test maddesinin cildi tahriş etme/aşındırma özelliklerinin mevcut verilerle değerlendirilmesi için bir yaklaşım ve ilave çalışmaya ihtiyaç duyulan veya hiçbir ilave çalışmaya gerek duyulmayan maddelerle ilgili verilerin oluşturulması için de kademeli bir yaklaşım sunar. Ayrıca özel koşullar altında geçerli ve kabul edilmiş in vitro veya ex vivo cilt aşınma/tahriş testlerinin uygulanmasını tavsiye eder. TEST UYGULAMA STRATEJİSİNİN TANIMI VE DEĞERLENDİRMESİ Testleri sıralı test uygulama stratejisinin (Şekil) bir kısmı olarak yürütmeye başlamadan önce, in vivo cilt testlerine ihtiyaç olup olmadığının belirlenmesi için mevcut tüm bilgiler değerlendirilmelidir. Her ne kadar anlamlı bilgi, tek bir parametrenin (pH uç değerleri) değerlendirilmesiyle elde edilebilse de mevcut bilgilerin tamamı göz önünde bulundurulmalıdır. Şüpheli maddenin veya benzerinin etkileriyle ilgili tüm veriler, delillin ispat kuvvet analizi ile karar verilerek ve bu karar için bir gerekçe sunularak değerlendirilmelidir. Maddeye dair elde mevcut olan insan ve hayvan verilerine öncelikli olarak önem verilmelidir. Bunu da in vitro ve ex vivo testlerden elde edilen veriler izlemelidir. Aşındırıcı maddelere ait in vivo çalışmalardan mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. Test uygulama stratejisinde göz önünde bulundurulması gereken faktörler aşağıdaki gibidir: (1. Basamak) İnsan ve hayvana ait var olan verilerin değerlendirilmesi. İnsanla ilgili mevcut veriler ör. Klinik veya mesleksel çalışmalar ve vaka raporları ve/veya tek veya tekrarlı dermal maruz kalma toksisite çalışmalarından elde edilen hayvan test verileri, göz önünde bulundurulmalıdır, çünkü bu şekilde cilt üzerindeki etkilerle doğrudan ilgili bilgi sağlanır. Aşındırıcılığı ve tahriş özelliği bilinen maddelerle bu özelliklerinin olmadığına dair çok net delillerin bulunduğu maddeler için in vivo çalışmalar yapılmasına gerek yoktur. (2.Basamak) Yapı aktivite ilişkisinin analizi (Structure Activity Relationships, SAR). Yapısal olarak birbirleriyle ilişkili maddelere uygulanan testlerin sonuçları, eğer elde mevcutsa, göz önüne alınmalıdır. Yapısal olarak ilişkili maddelerle veya karışımlarla ilgili olarak ciltteki aşındırıcı/tahriş edici potansiyellerine dair elde yeterli insan ve/veya hayvan verileri mevcutsa, değerlendirilmekte olan maddenin aynı tepkileri meydana getireceği tahmin edilebilir. Böyle durumlarda, maddenin teste tabi tutulmasına gerek yoktur. Yapısal olarak benzer maddelerle veya böyle maddelerin karışımlarından elde edilen negatif veriler, sıralı test uygulama stratejisi altındaki bir maddenin tahriş edici ve aşındırıcı olmadığına karar vermek için yeterli değildir. Maddenin dermal aşındırma ve tahriş potansiyelini belirlemek için geçerli ve kabul edilmiş SAR yaklaşımları kullanılmalıdır. (3.Basamak) Fizikokimyasal özellikler ve kimyasal reaktivite. pH uç değerleri ≤2.0 ve ≥11.5 şeklindeki maddeler kuvvetli bölgesel etkiler gösterebilirler. pH uç değeri bir maddenin ciltte aşındırıcı olup olmadığını belirlemek için temel alınıyorsa, o zaman maddenin asit/baz rezervi de (veya tampon kapasitesi) ayrıca dikkate alınmalıdır (3)(4). Tampon kapasitesine göre maddenin cilt üzerinde aşındırıcı etkisi olmayabileceği düşünülüyorsa, bunu teyit etmek için ilave testler-tercihen geçerli ve kabul edilmiş in vitro veya ex vivo- yürütülmelidir. (bakınız 5 ve 6ncı basamaklar). (4. Basamak) Dermal toksisite. Bir kimyasalın deri yoluyla çok toksik olduğu ispatlanmışsa, in vivo dermal tahriş/aşınma çalışması, normal olarak uygulanan test maddesinin miktarı çok toksik dozu geçeceğinden ve hayvanların ciddi anlamda acı çekmesi veya ölümleriyle sonuçlanacağından, pratik olmayabilir. İlaveten, albino tavşanların kullanıldığı dermal toksisite çalışmaları önceden 2000 mg/kg vücut ağırlığı sınır dozunda veya daha yüksek dozlarda yürütüldüğünde ve hiçbir dermal tahriş veya aşınma görülmediğinde dermal tahriş ve aşınmayla ilgili ilave test yapılmasına gerek olmayabilir. Daha önceden yapılmış olan çalışmalarda akut dermal toksisite değerlendirilirken akla pek çok düşünce gelebilir. Örneğin, dermal yaralarla ilgili olarak rapor edilen bilgiler tam olmayabilir. Testlerin uygulanması ve gözlemler tavşan dışındaki bir türde uygulanabilir ve türlerin hassasiyet tepkileri farklılık gösterebilir. Ayrıca hayvanlara uygulanan test maddesinin biçimi (örneğin test maddesinin dermal toksisite çalışması sırasında seyreltilmesi(5)) ciltte tahriş/aşınma değerlendirilmesi yapmak için uygun olmayabilir. Yine de, iyi tasarlanan ve yürütülen dermal toksisite çalışmalarının tavşanlarla uygulandığı durumlarda, maddenin aşındırıcı veya tahriş edici olmadığına dair negatif bulguların yeterli kanıt olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. (5. veya 6. Basamaklar) in vitro veya ex vivo testlerin sonuçları. Aşındırıcılık ve tahriş edicilik gibi özel etkilerin değerlendirilmesi için tasarlanan geçerli in vivo veya ex vivo testlerde aşındırıcı veya ciddi tahriş edici özelliği gösteren maddelerin (6)(7) hayvanlarda denemesine gerek yoktur. Böyle maddelerin, benzer ciddi etkileri in vivo olarak da göstereceği önceden tahmin edilebilir. (7. ve 8. Basamaklar) Tavşanlardaki in vivo test. In vivo test uygulamasına yönelebilmek için delilin ispatı kuvveti analizi yapılmalıdır. Teste bir hayvan kullanılarak, başlangıç testi ile başlanmalıdır. Bu testin sonuçları maddenin cilt üzerinde aşındırıcı olduğunu gösterirse, ilave testlere gerek yoktur. Başlangıç testinde aşındırıcı bir etki gözlenmemişse dört saatlik bir maruz kalma süresi boyunca ilave iki hayvan daha kullanılarak tahriş edici veya negatif tepki tespit edilmelidir. Başlangıç testinde tahriş edici etki gözlenirse, doğrulama testi sıralı test şeklinde veya aynı anda ilave iki hayvanı daha maruz bırakarak yürütebilir. KAYNAKLAR (1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22. 24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). (2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). (3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdail D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720. (4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp 19-26. (5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritancy, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411-436. (6) Testing Method B.40. (7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosion. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483.524.
Bu yöntem OECD TG 405(2002)’ye eşdeğerdir.
Güncellenen bu yöntemin hazırlanmasında, hayvan refahıyla ilgili kaygılar nedeniyle ve deney hayvanı kullanılarak yapılan gereksiz testlerden kaçınmak için test maddesiyle ilgili tüm mevcut bilgilerin değerlendirilmesine ilişkin olarak mümkün olan gelişmeler özellikle dikkate alınmıştır. Bu yöntemde, maddenin aşınma/tahriş özelliğine ilişkin olarak tanımlanan in vivo (canlı organizma içi ortamı) testi uygulanmadan önce, ilgili mevcut verilerle ilgili olarak delilin ispat kuvveti analizi yapılması tavsiye edilir(1). Verilerin yeterli olmadığı durumlarda, veriler bir dizi sıralı test uygulanarak geliştirilebilir (2)(3). Test stratejisi geçerli ve kabul edilmiş in vitro testlerin uygulanmasını içerir ve bu yöntemde EK-I olarak yer alır. İlaveten, gözde aşınma olup olmadığını anlamak için, in vivo göz testi üzerinde düşünülmeden önce in vivo dermal tahriş/aşınma testinin uygulanması tavsiye edilir. Gerek güvenilir bilim ve gerekse hayvan refahı açısından maddenin gözde aşınma/tahriş potansiyeliyle ilgili elde mevcut tüm veriler delilin ispat kuvveti analiziyle değerlendirilinceye kadar, in vivo testlere başlanmamalıdır. Böyle veriler insanda ve/veya laboratuvar hayvanlarında yapılan mevcut çalışmalardan elde edilen kanıtları içerecektir. Bir veya daha fazla yapısal olarak ilişkili maddenin veya böyle maddelerin karışımlarının aşınma/tahriş yaptığına dair kanıtlar, maddenin kuvvetli asit veya baz olduğuna dair verilerle(4)(5), ciltte aşınma ve tahriş için yapılan, geçerli ve kabul edilmiş in vitro veya ex vivo test sonuçlarıdır (6)(6a). Bu çalışmalar, delilin ispat kuvveti analizine önceden bağlı ya da onun bir sonucu olarak yürütülmüş olabilir. Belli maddeler için böyle bir analiz, maddenin oküler (göz küresi) aşınma/tahriş potansiyeliyle ilgili in vivo çalışmalara ihtiyaç olduğunu işaret edebilir. Bu gibi durumların hepsinde in vivo göz testi yapılmasının üzerinde düşünülmeden önce, tercihen ilk önce maddenin dermal etkileriyle ilgili in vivo bir çalışma yürütülmelidir ve test yöntemi B.4’e göre değerlendirilmelidir (7). Delilin ispat kuvveti analizinin ve sıralı test uygulama stratejisinin uygulanması önceden diğer çalışmalardan elde edilen yeterli kanıtın olduğu maddelerin gözde aşınma/tahriş etkisiyle ilgili in vivo testlerin yapılmasına duyulan ihtiyacı azaltacaktır. Gözde aşınma veya tahriş potansiyelinin belirlenmesi in vivo dermal aşınma/tahriş çalışması uygulandıktan sonra bile sıralı test uygulama stratejisi kullanılarak belirlenemiyorsa, in vivo göz aşınma/tahriş testi yapılabilir. Aşınma/tahriş için uygulanan geçerli ve kabul edilmiş in vitro veya ex vivo testlerin performansını içeren, tercih edilen sıralı bir test yapma stratejisi, bu yöntemde EK-I olarak yer almaktadır. Strateji geliştirilmiş ve OECD çalıştayı katılımcıları tarafından tavsiye edilmiştir(8), tavsiye edilen test yapma stratejisi olarak Kimyasal Maddelerin Sınıflandırılması için Küresel Uyumlaştırılmış Sistem (Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances, GHS) içinde uyarlanmıştır (9). Bu test stratejisinin in vivo teste başlamadan önce izlenmesi tavsiye edilir. Yeni maddeler için, maddenin aşınma/tahriş etkisiyle ilgili verilerin bilimsel anlamda güvenilirliği için adım adım test uygulama yaklaşımı tavsiye edilir. Dermal aşınma/tahriş verilerinin yetersiz olduğu, mevcut maddeler için, verilerdeki boşlukların doldurulması için bu strateji kullanılabilir. Farklı test stratejilerinin ve prosedürlerinin kullanımı veya adım adım test uygulama yaklaşımını kullanma kararı gerekçelendirilmelidir.
Göz tahrişi: test maddesinin gözün ön yüzeyine uygulanmasını takiben, gözde meydana gelen, 21 günlük uygulama için tamamen geri dönüşümlü olan değişiklikler Göz aşınması: test maddesinin gözün ön yüzeyine uygulanmasını takiben, 21 günlük uygulama için tamamen geri dönüşümlü olmayan, gözde meydana gelen doku hasarı veya görmede ciddi fiziksel bozukluk.
Test edilen madde, deney hayvanının gözlerinden birine tek doz olarak uygulanır. Test maddesinin uygulanmadığı alanlar kontrol olarak düşünülür. Gözde tahriş/aşınma derecesi konjoktiva, kornea ve iristeki lezyonlar belli aralıklarla sayılarak değerlendirilir. Etkilerin tümüyle değerlendirilmesini sağlamak amacıyla gözdeki diğer etkiler ve sistemik olumsuz etkiler ayrıca tanımlanır. Çalışmanın süresi, gözlemlenen etkilerin tersinir olup olmadıklarının değerlendirilmesi için yeterli olmalıdır. Testin herhangi bir aşamasında sürekli olarak ciddi acı ve/veya ağrı belirtileri gösteren hayvanlar insani olarak öldürülmeli ve madde tayin edilmelidir. Can çekişen ve ciddi acı çeken hayvanların insani bir şekilde öldürülmelerine karar verme kriterleri kaynak (10)’da yer almaktadır.
Albino tavşan tercih edilen laboratuvar hayvanıdır ve sağlıklı, genç, yetişkin tavşanlar kullanılır. Diğer türlerin kullanımında bir gerekçe sağlanmalıdır.
Test başlamadan önce 24 saat içinde geçici olarak seçilen her bir deney hayvanının iki gözü de incelenmelidir. Göz tahrişi, oküler bozukluklar veya önceden var olan korneal hasar görülen hayvanlar kullanılmamalıdır.
Hayvanlar ayrı ayrı barındırılmalıdır. Oda sıcaklığı tavşanlar için 20°C (± 3°C) olmalıdır. Ayrıca, bağıl nem oranı en az %30 olmalı ve tercihen %70’i geçmemelidir, odanın temizlenmesi sırası dışında, amaç % 50–60 olmalıdır. Yapay ışık sistemi kullanılmalı, 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık şeklinde olmalıdır. Beslenme için sınırsız içme suyu tüketimiyle beraber geleneksel laboratuvar yiyecekleri kullanılabilir.
Test maddesi alt göz kapağı yavaşça göz bebeğinden uzaklaştırılarak itildikten sonra her bir hayvanın bir gözünün konjunktival kesesine yerleştirilmelidir. Kapaklar daha sonra bir saniyeliğine bir araya getirilir ve madde kaybı önlenmiş olur. İşlem yapılmayan diğer göz kontrol olarak kullanılır.
Test hayvanlarının gözleri, katı maddeler ve ani aşındırıcı veya tahriş edici etkilerin görüldüğü durumlar haricinde test maddesinin uygulanmasını takiben en az 24 saat yıkanmamalıdır (bakınız bölüm 1.4.2.3.2). Uygun görülürse, 24. saatte yıkanabilir. Bilimsel bir gerekçe olmadıkça, yıkamanın etkisinin görülmesi için uydu hayvan grubunun kullanılması tavsiye edilmez. Eğer bir uydu gruba ihtiyaç duyulursa, iki tavşan kullanılmalıdır. Yıkama zamanı, yıkama çözeltisinin sıcaklığı ve bileşenleri, uygulama süresi, hacmi ve hızı gibi yıkama koşulları dikkatlice belgelenir.
Sıvıların test edilmesi için 0,1 ml’lik bir doz kullanılır. Maddenin gözün içine doğrudan uygulanması için pompalı spreyler kullanılmamalıdır. Sıvı sprey göze 0,1 ml damlatmadan önce çıkarılmalı ve bir haznede toplanmalıdır.
Katılar, macunlar ve parçalı maddeler test edilirken, kullanılan miktar 0.1 ml veya 100 mg’ı geçmeyecek şekilde olmalıdır. Test maddesi ince toz haline gelinceye kadar ezilmelidir. Örnek ölçme kabına hafifçe vurularak nazikçe sıkıştırıldıktan sonra katı maddenin hacmi ölçülmelidir. Eğer katı test maddesi test hayvanının gözünden, uygulamadan bir saat sonraki gözlem zamanında fizyolojik mekanizmalarla uzaklaştırılmamışsa, göz tuzlu su veya distile suyla silinebilir.
Bütün pompalı spreylerin ve aerosollerin göze damlatılmadan önce biriktirilmesi tavsiye edilir. Tek istisna, basınçlı aerosol kutularındaki maddeler içindir, çünkü buharlaşma nedeniyle madde toplanamaz. Böyle durumlarda göz açık tutulmalı ve test maddesi göze yaklaşık 1 saniye içinde gözün önünden 10 cm uzaklıktan doğrudan damlatılır. Bu uzaklık sprey basıncına ve içeriğine bağlı olarak değişir. Gözün sprey basıncıyla zarar görmemesine dikkat edilmelidir. Uygun durumlarda spreyin gücünden dolayı gözde ‘mekanik’ hasar potansiyelinin değerlendirilmesine ihtiyaç olabilir. Aerosol dozunu tahmin etmek için aşağıdaki gibi bir benzetme yapılır: madde tavşan gözü büyüklüğündeki ve kâğıdın doğrudan önünde bulunan açıklıktan tartma kâğıdına sprey gibi sıkılır. Kâğıdın ağırlığındaki artış göze spreylenen miktarı tahmin etmek için kullanılır. Uçucu maddeler için doz, test maddesi uzaklaştırılmadan önce uzaklaştırıldıktan sonra toplayıcı hazne tartılarak tahmin edilebilir.
Sıralı test uygulama stratejisinde açıkça belirtildiği gibi (bakınız Ek-I), başlangıç olarak bir hayvanın kullanıldığı in vivo testin uygulanması kesinlikle tavsiye edilir. Bu testin, tanımlanan prosedür uygulanarak elde edilen sonuçları, maddenin gözde aşındırıcı veya ciddi tahriş edici olduğunu gösteriyorsa, oküler tahriş için ilave bir test uygulanmasına gerek yoktur.
Lokal anestezikler duruma bağlı olarak kullanılabilir. Delilin ispat kuvveti analizi maddenin acı verme potansiyeli olduğuna işaret eder veya başlangıç testi ağrı veren bir tepkimenin olacağını gösterirse, test maddesi damlatılmadan önce lokal anestezik kullanılmalıdır. Test maddesine karşı gelişen tepkimeler arasındaki farklılığın onun kullanımına bağlı olmadığını ispatlamak için lokal anesteziğin tipi, konsantrasyonu ve dozu dikkatlice seçilmelidir. Kontrol göze de benzer şekilde anestezi yapılmalıdır.
Eğer başlangıç testinde aşındırıcı etki gözlenmezse, tahriş edici veya negatif cevap ilave iki hayvan daha kullanılarak teyit edilmelidir. Eğer başlangıç testinde ciddi bir tahriş edici etki gözlenirse, teyit testinde olası güçlü (tersinmez) bir etkiyi işaret ediyorsa, teyit testinin aynı anda iki ilave hayvanın maruz bırakılarak uygulanmasındansa sıralı şekilde bir zamanda bir hayvana uygulanması tavsiye edilir. Eğer ikinci hayvan aşındırıcı veya ciddi tahriş edici etki gösterirse, teste devam edilmez. Zayıf veya orta dereceli tahriş edici cevapları teyit etmek için ilave hayvana ihtiyaç duyulabilir.
Gözlem süresinin uzunluğu, gözlenen etkilerin şiddetinin ve tamamen geri dönüşümlü olup olmadığının anlaşılması için yeterli olmalıdır. Hayvanların ciddi acı ve ağrı belirtileri göstermeye devem etmesi halinde deneye son verilmelidir (9). Etkilerin tersinirliğinin belirlenmesi için, hayvanlar normalde test maddesi uygulandıktan sonra 21 gün boyunca gözlenmelidir. Eğer 21 günden önce tersinirlik görülürse, deneye o anda son verilmelidir.
Gözler test maddesi uygulandıktan sonra 1., 24., 48. ve 72. saatlerde incelenmelidir. Hayvanlar gerekli bilgi edinildikten sonra teste devam ettirilmemelidir. Ciddi acı ve ağrı çeken hayvanlar vakit kaybetmeden insani koşullarda öldürülmeli, madde buna göre değerlendirilmelidir. Aşağıdaki göz lezyonlarını gösteren hayvanlar insani şekilde öldürülmelidir: - korneal perforasyon (kornea delinmesi) veya stafiloma gibi anlamlı kornea ülseri; -gözün ön odacığında kanlanma; -48 saat kalıcı, 4. derece korneal opaklık; -72 saat kalıcı, ışık refleksi yokluğu (2nci derece iridial (irisle ilgili) cevap) konjunktival membran ülseri, konjunktivada veya 3ncü göz kapağında nekroz veya deri dökülmesi. Bu durum böyle lezyonların genelde tersinir olmamasına bağlıdır. Oküler lezyonların görülmediği hayvanlar damlatmadan sonra 3 günden erken olmamak kaydıyla deneyden alınabilir. Hafiften orta şiddete doğru lezyonları olan hayvanlar lezyonlar netleşinceye kadar veya testin sonuçlandırıldığı 21 gün boyunca gözlenmelidirler. Doku bozukluklarının durumu ve geri dönüşümlü olup olmadığının belirlenmesi için 7, 14 ve 21nci günlerde gözlem yapılmalıdır. Oküler tepkimelerin dereceleri (konjunktiva, kornea ve iris) her incelemede kaydedilmelidir. (Tablo I). Gözdeki diğer herhangi bir lezyon (ör. pannus, lekelenme) veya sistemik olumsuz etkiler de ayrıca rapor edilmelidir. Tepkimelerin incelenmesi binoküler (dürbün için) büyüteç, el slit-lambası (ince dar el lambası), biyomikroskop veya diğer uygun aletin kullanımıyla kolaylaştırılabilir. 24. saatlerdeki gözlemler kaydedildikten sonra, gözler floresein yardımıyla tekrar incelenebilir. Gözdeki cevapların derecelendirilmesi ister istemez özneldir. Gözdeki derecelendirmelerin düzenlenmesini teşvik etmek ve gözlemlerin yorumlanmasını da içine alan test uygulama laboratuvarlarına yardımcı olmak için, gözlemleri yapan personelin kullanılan skorlama sistemi konusunda yeterli eğitimden geçmesi gerekir.
|
