FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- B.12 MUTAJENİTE – IN VIVO MEMELİ ERİTROSİTMİKROÇEKİRDEK TESTİ YÖNTEM
VERİLER
Hayvanlara ait veriler ayrı ayrı çizelge haline getirilmelidir. Deneysel birim hayvandır. Her bir hayvan için hücre sayısı işaretlenir, hücre başına düşen bozukluk sayısı, yapısal kromozom bozukluk(ları) ile hücre yüzdesi değerlendirilmelidir. Farklı tipteki yapısal kromozom bozuklukları sayılarıyla ve sıklıklarıyla kontrol ve muamele grupları için listelenmelidir. Boşluklar ayrıca kaydedilir ve raporlanır fakat genelde toplam bozukluk sıklığında yer almazlar. Eğer cinsiyetler arasında cevaplar olduğuna dair hiç kanıt yoksa, istatistiksel analiz için her iki cinsiyetten elde edilen veriler birleştirilebilir.
Pozitif sonuç tayin etmek için örneğin kromozom bozukluğu olan hücrelerin bağıl sayısındaki doza bağlı artış veya tek bir doz grubunda, tek bir örnek alma zamanındaki kromozom bozukluğu olan hücrelerin sayısındaki net artış gibi bazı ölçütler vardır. Sonuçlar ilk önce biyolojik açıdan değerlendirilmelidir. İstatistiksel yöntemler, test sonuçlarını değerlendirirken yardımcı olarak kullanılabilir (6). İstatistiksel anlamlılık pozitif bir cevap için tek belirleyici etken olmamalıdır. Şüpheli sonuçlar ilave testlerle, tercihen deney koşullarının düzeltilmesiyle, netleştirilmelidir. Poliploidideki artış test maddesinin sayısal kromozom bozukluklarını uyarma potansiyeli olduğuna işaret edebilir. Endoredublikasyondaki artış test maddesinin hücre döngüsünün ilerlemesini engelleme potansiyeli olduğuna işaret eder (7)(8). Yukarıdaki kriterlere uymayan bir test maddesinin, bu testte mutajenik olmadığı düşünülür. Her ne kadar pek çok deney açıkça pozitif ve negatif sonuçlar verecekse de, nadir durumlarda veri kümeleri test maddesinin etkinliği hakkında net bir karara varılmasına engel olacaktır. Sonuçlar uygulanan deneylerin sayısından bağımsız olarak belirsiz veya tartışmaya açık kalabilir. Canlı organizmada(in vivo) kromozom bozukluğu testlerinden elde edilen pozitif sonuçlar bir maddenin test edilen türün kemik iliğindeki kromozom bozukluğunu uyardığını gösterir. Negatif sonuçlar, test koşulları içinde, test maddesinin test edilen türün kemik iliğindeki kromozom bozukluğuna sebep olmadığını gösterir. Test maddesinin veya metabolitinin genel dolaşıma veya belirli biçimde hedef dokuya (örneğin, sistemik toksisite) ulaşma olasılığı tartışılmalıdır.
Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir: Çözücü/Taşıyıcı
Test hayvanları:
Test koşulları:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması Sonuçlar.
B.12 MUTAJENİTE – IN VIVO MEMELİ ERİTROSİTMİKROÇEKİRDEK TESTİ
Bu yöntem OECD TG 474, Memeli Eritrosit Mikroçekirdek Testi (1997)’ne eşdeğerdir.
Memeli in vivo mikroçekirdek testi, eritroblastların (bir alyuvar tipi) mitotik düzeneğinin veya kromozomların test maddesiyle uyarıldığında ortaya çıkacak hasarları hayvanların, genellikle de kemirgenlerin kemik iliği ve/veya çevresindeki kan hücrelerinden alınan örneklerin analiz edilerek tespit edilmesi için kullanılır. Mikroçekirdekler içeren yalıtkan kromozom parçalarının veya tam kromozomların oluşmasıyla sonuçlanan mikroçekirdek testinin amacı sitogenetik hasara neden olan maddeleri belirlemektir. Bir kemik iliği eritroblastı polikromatik eritrosit geliştirdiğinde, esas çekirdek çıkarılır, oluşan mikroçekirdek arkada, aksi takdirde çekirdeksiz sitoplazmada kalabilir. Mikroçekirdeklerin gözle görülmesi, bu hücrelerde esas çekirdek olmadığından kolaylaştırılmıştır. Muamele edilen hayvanlardaki mikroçekirdekli polikromatik eritrosit sıklığındaki artış uyarılmış kromozom hasarlarının göstergesidir. Bu testte kemirgenlerin kemik ilikleri kullanılır çünkü polikromatik eritrositler bu dokuda üretilirler. Periferal kandaki mikroçekirdekli olgunlaşmamış (polikromatik) eritrositlerin ölçümü, dalağın mikroçekirdekli eritrositleri uzaklaştırmadaki yetersizliğinin gösterildiği veya yapısal veya sayısal kromozom bozukluklarına neden olan ajanları tayin edecek duyarlılığa sahip türlerde aynı şekilde kabul edilir. Mikroçekirdekler bir dizi ölçütle ayrılabilir. Bu ölçütler mikroçekirdekler içindeki kinetokor veya sentromerik DNA’nın varlığının ve yokluğunun belirlenmesini içerir. Mikroçekirdekli olgunlaşmamış (polikromatik) eritrosit sıklığı sonlanma noktasıdır. Hayvanlar 4 veya daha fazla hafta boyunca sürekli olrak muamele edildiklerinde, belli sayıda olgun eritrosit arasından, mikroçekirdekler içeren periferal kanda olgunlaşmış (normokromatik) eritrosit sayısı da yöntemin son noktası olarak kullanılabilir Bu memeli in vivo mikroçekirdek testi özellikle canlı organizmada (in vivo) metabolizma, farmakokinetik ve DNA-onarım süreci faktörlerinin, her nekadar hepsi türler, dokular ve genetik sonlanma noktaları arasında farklılık gösterse de, üzerinde durulmasına olanak sağlayan mutajenik zararların değerlendirilmesiyle ilgilidir. Bir canlı organizmada (in vivo) yöntem, yapay ortamda (in vitro) sistemde tespit edilen mutajenik etkilerin daha ileri araştırmaları için de ayrıca yararlıdır. Eğer test maddesinin veya reaktif metabolitinin hedef dokuya ulaşmayacağına dair kanıt varsa bu testin kullanımı uygundeğildir. Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Sentromer (Kinetokor): Hücre bölünmesi sırasında iğ iplikçiklerin tutuntuğu kromozom bölgesidir, kardeş kromozomların, kardeş hücre kutuplarına doğru düzenli hareket etmesini sağlar. Mikroçekirdekler:, Asıl çekirdekten ayrı ve aynı zamanda asıl çekirdeğe eklenmiş olan küçük çekirdeklerdir, mitozun telofaz safhasında yalıtkan kromozom parçalarından veya tüm kromozomdan üretilirler. Normokromatik eritrosit: Olgunlaşmış eritrositin, ribozomu yoktur ve olgunlaşmamış, polikromatik eritrositten ribozom seçici boyalarla ayrılabilir. Polikromatik eritrosit: Olgunlaşmamış eritrosittir, gelişmenin ara safhasıdır, hala ribozomu olduğundan olgunlaşmış, normokromatik eritrositten ribozom seçici boyalarla ayrılabilir.
Hayvanlar test maddesine uygun bir yolla maruz kalırlar. Eğer kemik iliği kullanılmışsa hayvanlar muameleden sonraki uygun zamanlarda feda edilirler, kemik iliği alınır, örnekler hazırlanır ve boyanır (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Periferal kan kullanılmışsa, kan muameleden sonraki uygun zamanlarda toplanır, lam üzerine yayılmış örnekleri hazırlanır ve boyanır.(4)(8)(9)(10). Periferal kandaki çalışmalar için, son maruz kalma ve hücre toplanması arasında olabildiğince kısa bir süre geçmelidir. Örnekler mikroçekirdek varlığı için analiz edilirler.
Her ne kadar uygun herhangi bir memeli türü kullanılabilirse de, eğer kemik iliği kullanılmışsa, fareler veya sıçanlar tavsiye edilir. Periferal kan kullanıldığında fare tavsiye edilir. Ancak, herhangi bir uygun memeli türü, yani dalağın mikroçekirdekli eritrositleri çıkarmadığı bir tür veya yapısal veya sayısal kromozom bozukluklarına neden olan maddeleri tespit etmek için yeterli duyarlılığı gösteren bir tür, kullanılabilir. Yaygın olarak kullanılan genç, sağlıklı hayvanların laboratuvar suşlar kullanılmalıdır. Çalışmanın başında, hayvanlardaki ağırlık değişkenliği aralığı her iki cinsiyet için de, uygun ortalama değerin ±% 20’sini geçmemelidir.
Genel koşullar, Bölüm B Genel Giriş (B)’de belirtildiği şekilde uygulanır, nem % 50–60 arasında olmalıdır.
Sağlıklı genç erişkin hayvanlar rasgele kontrol ve muamele gruplarına ayrılırlar. Kafesler yerleştirilmelerinden kaynaklanacak olası etkileri en az indirecek şekilde yerleştirilirler. Hayvanlar eşsiz olarak kimliklendirilirler. Hayvanlar en az beş gün öncesinden laboratuar koşullarına alıştırılırlar.
Eğer uygunsa hücreler muamele edilmeden önce, katı test maddeleri uygun çözücüler veya taşıyıcılar içinde çözülmeli veya askıda kalmalı ve seyreltilmelidir. Sıvı test maddeleri muameleden önce test sistemine doğrudan eklenebilirler veya seyreltilebilirler. Kararlılığıyla ilgili veriler saklanmasının kabul edilebilirliğini göstermedikçe test maddesinin taze hazırlanmış olanları uygulanmalıdır.
Çözücü/taşıyıcı kullanılan doz seviyelerinde toksik etki meydana getirmemelidir ve test maddesiyle kimyasal reaksiyona gireceğinden şüphe duyulmamalıdır. Eğer çok iyi bilinen çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa içerikleri uyumlu olduklarını gösteren verilerle desteklenmelidir. Uygun olan her yerde önce sulu çözelti/taşıyıcı kullanılmasının düşünülmesi tavsiye edilir.
Eş zamanlı pozitif ve negatif (çözücü / taşıyıcı) kontroller, her bir cinsiyet için her bir deneyde de yer almalıdır. Test maddesiyle muamele haricinde, kontrol grubundaki hayvanlar muamele grubundaki hayvanlarla eşit şartlarda tutulmalıdır. Pozitif kontroller arka planda tespit edilebilir artışlar göstermesi beklenen maruz kalma seviyelerinde canlı organizma içinde (in vivo) mikroçekirdekler meydana getirmelidir. Pozitif kontrol dozları, etkilerin açıkça görülebileceği şekilde seçilmelidir, fakat işaretli lamların özdeşliği okuyucu tarafından hemen ortaya çıkarılmaz. Test maddesinin uygulandığından daha farklı şekilde uygulanan pozitif kontrol kabul edilebilirdir ve sadece tek seferde örnekleme yapılır. Mevcut olduğu durumlarda, kimyasal sınıfla ilişkili pozitif kontrol kimyasallarının kullanımı üzerinde durulmalıdır. Pozitif kontrol madde örnekleri :
Çözücüyle muamele edilmiş veya sadece taşıyıcı olan ve bunun dışında uygulama gruplarıyla aynı şekilde muamele edilen negatif kontroller, hayvanlar arasındaki kabul edilebilir çeşitlilik ve kromozomu bozuk hücrelerin sıklıkları geçmişe yönelik kontrol verilerinden elde edilemediği sürece, her örnek alma zamanı için dahil edilmelidir. Eğer negatif kontroller için tek örnek alımı uygulanırsa, en uygun zaman ilk örnek alma zamanıdır. Ek olarak, seçilen çözücü/taşıyıcı tarafından uyarılmış hiç bir zararlı veya mutajenik etki olmadığını gösteren tarihsel veya yayınlanmış kontrol verileri yoksa işlenmemiş kontroller dahi kullanılabilir. Eğer periferal kan kullanılmışsa, daha önceden muamele edilmiş örnek eş zamanlı negatif kontrol olarak da ayrıca kabul edilebilir fakat sonuç verileri geçmişe yönelik kontrol için beklenen aralıkta olduğunda sadece kısa periferal kan çalışmalarında (ör. 1–3 muamele) bu durum söz konusudur.
Her bir muamele ve kontrol grubu cinsiyet başına en az 5 analiz edilebilir hayvan içermelidir (11). Eğer çalışma sırasında aynı tür için aynı maruz kalma yolu uygulanarak yapılan çalışmalardan elde edilebilir veriler varsa, bu durum cinsiyetler arasında önemli farklılıkların bulunmadığını gösterir, o zaman tek bir cinsiyette test uygulanması yeterli olacaktır. İnsanlarda kimyasallara maruz kalma cinsiyete özgü olabildiğinden, örneğin bazı farmasötik etkenlerle, test uygun cinsiyetteki hayvanlarla uygulanmalıdır.
Tavsiye edilen standart bir muamele programı yoktur (ör. 24 saatlik aralıklarla 1, 2 veya daha fazla muamele). Uzatılmış doz rejimlerinden alınan örnekler, bu çalışma için pozitif etki gösterdiği sürece, veya negatif çalışmalar için toksisite gösterdiği veya sınır doz kullanıldığı sürece kabul edilebilirdir ve doz uygulamasına örnek alma zamanına kadar devam edilir. Test maddesi ayrıca büyük hacimli maddelerin uygulanmasını kolaylaştırmak için bölünmüş dozlar halinde de (örn. aynı günde verilmeleri arasındaki süre birkaç saati geçmeyen iki muamele şeklinde) uygulanabilir. Test iki şekilde uygulanabilir: (a) Hayvanlar test maddesiyle bir kere muamele edilirler. Kemik iliği örnekleri en az iki defa alınır, muameleden en az 24 saat sonra fakat 48 saati geçmeyen sürede, örnekler arası uygun aralıklarla örnek alınmasına başlanır. Örnek alınmasına uygulamadan sonra 24 saat geçmeden başlanması gerekçelendirilmelidir. Periferal kan örnekleri en az iki defa alınır, muameleden en az 36 saat sonra başlanır, ilk örneğin alınmasını takiben uygun aralıklarla fakat 72 saati geçmeyen sürede alınmalıdır. Örnek alma zamanında pozitif cevaba rastlanırsa, ilave örnek alınmasına gerek yoktur. (b) Eğer 2 veya daha fazla günlük uygulama yapılıyorsa (ör. 24 saat aralıklarla iki veya daha fazla muamele), örnekler kemik iliği için en sonuncu muameleyi takiben 18 ve 24. saatler arasında bir kere ve periferal kan için de en sonuncu muameleyi takiben 36 ve 48. saatler arasında alınmalıdır (12). Diğer örnek alma zamanları da ilgili yerlede ilave olarak kullanılabilir.
Eğer elde hiç uygun veri bulunmadığı için bir aralık bulma çalışması yürütülürse, temel çalışmada kullanılanla aynı laboratuvar, aynı ırk, cinsiyet ve muamele düzeyi kullanılarak yürütülmelidir (13). Eğer toksisite varsa, ilk örnek alma zamanı için üç doz kullanılır. Bu doz seviyeleri maksimumla çok az toksisitenin olduğu veya hiç toksisitenin olmadığı aralığın içinde olmalıdır. Daha sonraki örnek alma zamanında sadece en yüksek dozun kullanılması gerekir. En yüksek doz, toksik belirtilerinin oluşmaya başladığı doz olarak tanımlanır şöyle ki daha yüksek doz seviyelerinin, aynı doz uygulama düzeyine dayanarak, ölüme neden olması beklenir. Düşük seviyeli toksik olmayan dozlarda özel biyolojik aktiflik gösteren hormonlar ve mitojenler gibi maddeler doz belirleme ölçütlerinde istisna olabilir ve tek başına değerlendirilmelidir. Ayrıca en yüksek doz kemik iliğinde (örneğin, kemik iliği veya periferal kandaki toplam eritrositteki olgunlaşmamış eritrosit sayısı) bazı toksik belirtileri meydana getiren doz olarak da tanımlanabilir.
Eğer 2000 mg/kg vücut ağırlığı doz seviyeli bir sınır testi tek doz veya aynı günde iki muamele olarak uygulandığında gözlenebilen herhangi bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve eğer yapısal olarak benzer maddelerle ilgili genotoksisite beklenmiyorsa bu durumda üç doz kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. Uzun süreli çalışmalarda, 14 güne kadar olan muameleler için sınır doz 2000 mg/kg/vücut ağırlığı/gün; 14 günden daha uzun süreli muamelelerde 1000 mg/vücut ağırlığı/gün’dür. İnsanda beklenen maruz kalma, sınır testinde daha fazla doz kullanılması gerektiğine işaret edebilir.
Test maddesi genellikle gavaj yöntemi kullanılarak sonda ile besleme veya mideye uygun bir elastik boru sokulmasıyla veya karın içine enjeksiyonla uygulanır. Diğer işlem yolları gerekçelendirildiklerinde uygun olabilir. Sonda ile besleme veya enjeksiyonla tek seferde uygulanabilecek olan maksimum sıvı hacmi test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. Hacim 2 ml/100g vücut ağırlığını geçmemelidir. Bu değerden daha yüksek hacimler gerekçelendirilmelidir. Normalde daha yüksek konsantrasyonlarda daha kötü etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için konsantrasyonun tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla test hacmindeki değişkenlik en aza indirilir.
Kemik iliği hücreleri genellikle feda edilmelerden hemen sonra kalça kemiğinden veya kaval kemiğinden elde edilirler. Yaygın olarak hücreler femür veya kaval kemiğinden uzaklaştırılırlar, hazırlanırlar ve bilinen yöntemlerle boyanırlar. Periferal kan toplardamardan veya diğer uygun kan damarından elde edilir. Kan hücreleri hemen supravital boyama ile boyanırlar (8)(9)(10) veya lam üzerine örnekler yayılır, daha sonra boyanırlar. DNA’ya özgü boyanın [örn. akridin turuncusu (14) veya Hoechst 33258 plus pironin-Y (15)] kullanılması DNA’ya özgü olmayan boya kullanımıyla ilgili işlem hatalarının bazılarını ortadan kaldırabilir. Bu avantaj, geleneksel boyaların (ör. Giemsa) kullanılmasına engel olmaz. Laboratuarlarda mikroçekirdek hazırlanmasında uygun şekilde kullanıldığı gösterilen ilave sistemler [ör. çekirdekli hücreleri uzaklaştırmak için selüloz kolonlar (16)] kullanılabilir.
Olgunlaşmamış eritrosit sayısının toplam eritrosit (olgunlaşmamış + olgun) sayısına oranı her bir hayvan için, kemik iliğinde toplamda en az 200, periferal kanda ise 1000 eritrosit sayılarak belirlenir (17). Pozitif ve negatif kontroller de dahil tüm lamlar mikroskobik analizden önce ayrı ayrı işaretlenmelidir. Hayvan başına en az 2000 olgunlaşmamış eritrosit mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit oluş sıklığı için sayılırlar. İlave bilgi mikroçekirdekler için olgunlaşmış eritrosit sayılarak elde edilebilir. Lamlar analiz edilirken, olgunlaşmamış eritrositin toplam eritrosite oranı kontrol değerinin %20’sinden az olmamalıdır. Hayvanlar 4 hafta veya daha fazla bir süre sürekli olarak muamele edildiklerinde hayvan başına en az 2000 eritrosit de ayrıca mikroçekirdeklerin oluş sıklığı için sayılabilir. Uygun şekilde düzenlenmiş ve geçerli hale getirilmiş otomatik analiz sistemleri (görüntü analizi ve hücre süspansiyon akış sitometri) elle yapılan değerlendirmelere seçenek olarak kabul edilebilir.
|