FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

Ek- III
BCOP KORNEA TUTUCUSU
1. BCOP kornea tutucuları polipropilen gibi inert bir malzemeden üretilir. Tutucular bir ön odacık ve bir arka odacık olmak üzere iki kısımdan oluşur ve iki adet silindirik benzer iç odacığa sahiptir. Her odacık 5 ml hacme sahiptir ve opaklık ölçümlerinin kaydedildiği cam bir pencereyle sonlanır. İç odacıkların her birinin çapı 1,7 cm ve derinliği 2,2 cm’dir¹. Sızıntıyı önlemek için arka odacıkta bir o halka kullanılır. Kornealar endotel kısmı alta gelecek şekilde arka odacıkların o halkasına ve ön odacıklar da korneanın epitel tarafına yerleştirilir. Odacıklar iki paslanmaz cıvatayla odacığın dış kenarlarına sabitlenir. Her odacığın sonunda, korneaya daha rahat ulaşmak için çıkarılabilen cam pencere yer alır. Sızıntıyı önlemek için cam pencere ile odacıkla arasına da bir o halka yerleştirilir. Odacıkların üstündeki iki delik cihaz maddesinin ve test bileşiklerinin doldurulmasını ve boşaltılmasını sağlar. İşlem ve inkübasyon sorasında lastik tıpalarla kapalı tutulurlar.


OPAKLIK ÖLÇER

2. 
   Opaklık ölçer ışık geçişini ölçen bir cihazdır. Halojen lamba ışığı kontrol kısmından (pencere ve sıvı bulunmayan boş odacık) fotosele gönderilir ve korneanın bulunduğu odacığı içeren deney kısmından fotosele gönderilen ışıkla karşılaştırılır. Fotosellerden ışık iletimindeki fark karşılaştırılır ve sayısal opaklık değeri dijital ekranda gösterilir. Opaklık birimleri belirlenir.
   
3. 
   Opaklık ölçer Tahmin Modelinde tanımlanan değişik sınıflandırmalar için bariyerleri kapsayan (aşındırıcılık/ciddi tahriş edicilik belirleme bariyerine kadar) opaklık okumaları aralığı üzerinden doğrusal yanıt verebilecek şekilde olmalıdır. 75-80 opaklık birimine kadar doğrusal ve doğru okumalar için opaklık ölçerin bir dizi kalibratörlekalibrasyonunun yapılması gerekir. Kalibratörler (opak polyester tabakaları) kalibrasyon odacığına (kalibratörleri tutmak için tasarlanmış kornea odacığı) yerleştirilir ve opaklık ölçerle okunur. Kalibrasyon odacığı kalibratörleri ışık ve fotosele hemen hemen aynı mesafede tutarak korneaların opaklık ölçümü sırasında yerleştirilmelerine olanak tanıyacak şekilde tasarlanmıştır. Opaklık ölçer önce kalibrasyon odasına kalibratör yerleştirilmeksizin 0 opaklık biriminde kalibre edilir. Daha sonra kalibrasyon odacığına üç farklı kalibratör teker teker yerleştirilir ve opaklık değerleri ölçülür. 1, 2 ve 3 numaralı kalibratörlerinopaklık okumaları 75, 150 ve 225 opaklık birimi değerde ve her biri % ± 5 olmalıdır.
   

B. 48. OKÜLER AŞINDIRICILAR VE CİDDİ TAHRİŞ EDİCİLERİ TEŞHİS İÇİN İZOLE TAVUK GÖZÜ TEST YÖNTEMİ
GİRİŞ

1. 
   İzole tavuk gözü (ICE) test yöntemi Sığır korneası opaklığı ve geçirgenliği (BCOP) test yöntemi maddeleri ve karışımları bazı koşullarda ve belli sınırlamalarla “oküler aşındırıcı ve aşırı tahriş edici” olarak tanımlamak için kullanılabilen in vitrobir test yöntemidir (1) (2) (3). Bu test yöntemi açısından aşırı tahriş ediciler tavşanlara tatbik edildikten sonra en az 21 gün boyunca oküler lezyonlara yol açan tahriş edicilerdir. BCOP in vivotavşan gözü testine tam bir alternatif olmasa da belli bir uygulama alanında düzenleyici sınıflandırma ve adlandırma için aşamalı test stratejisinin parçası olarak önerilmektedir (4) (5). Test edilen maddeler ve karışımlar (6) tavşanlarda ayrıca test yapmaya gerek kalmadan oküler aşındırıcı veya aşırı tahriş edici olarak kategorize edilebilirler. Test sonucu negatif çıkan maddenin, OECD Test Yönergesi 405 (7) (Ek’in B. 5 kısmı) gereğince ardışık test stratejisi kullanılarak tavşanlar üzerinde test edilmesine gerek kalmamaktadır.
   

2. 
   Bu test yönteminin amacı test materyalinin oküler aşındırıcılık veya aşırı tahriş edicilik potansiyelinin çıkartılmış tavuk gözü üzerinde toksisite düzeyi ölçülmek suretiyle değerlendirecek usulleri belirlemektir. Kornea üzerinde toksik etkiler (i) nitel opaklık değerlendirmesi, (ii) göze floresin tatbik edilerek epitel üzerinde hasarın (floresintutunumu) nitel değerlendirmesi, (iii) kalınlık artışının (şişme) nicel ölçümü ve (iv) yüzey üzerinde makroskopik morfolojik hasarın nitel değerlendirmesi ile tespit edilir. Korneanın test materyaline maruz bırakılmasından sonra yapılan kornea opaklık, şişme ve hasar ölçümleri birleştirilerek, test materyalinin tahriş edicilik düzeyi sınıflandırılır.
   

3. 
   21 günden daha az sürede iyileşenlezyonlara yol açan oküler tahriş ediciler ve tahriş edici olmayan materyaller de ICE test yöntemi kullanılarak test edilmektedir. Ancak, bu kategorilerdeki maddeler için ICE test yönteminin kesinliği ve güvenilirliği tam olarak değerlendirilmemiştir.
   

4. 
   Tanımlar Ek-I’de yer almaktadır.
   

ÖNCELİKLİ HUSUSLAR VE SINIRLAR

5. 
   Bu test yöntemi Avrupa Alternatif Yöntemler Değerlendirme Merkezi, Japonya Alternatif Yöntemler Değerlendirme Merkezi ve Yaşam Kalitesi Toksikoloji ve Uygulamalı Farmakoloji Departmanı (TNO-Hollanda) katkılarıyla hazırlanan uluslararası değerlendirme çalışması (4)(5)(9) sonucunda Alternatif Yöntemlerin Değerlendirilmesi Konusunda Kurumlararası Koordinasyon Komitesi (ICCVAM) tarafından oluşturulan ICE test yöntemi protokolüne (8) dayanmaktadır. Protokol, yayımlanmış protokollerdeki bilgilere ve TNO tarafından halen kullanılan protokole dayanmaktadır (10) (11) (12) (13) (14).
   

6. 
   Bu test yönteminin belirlenmiş sınırları;alkollerde, yanlış pozitif oranlardan ve katı ve yüzey aktif maddelerde yanlış negatif oranlardan kaynaklıdır (bkz. paragraf 47) (4).Bu kimyasal ve fiziksel sınıflardaki maddeler veri tabanından çıkarıldığı zaman AB, EPA ve GHS sınıflandırma sistemleri üzerinden ICE doğruluğu ciddi ölçüde iyileşir(4). Bu deneyin amacı, sadece oküler aşındırıcıların/aşırı tahriş edicilerin tespiti dikkate alındığında, materyaller daha sonra tavşanlar üzerinde veya mevzuata göre kabul edilmiş bir diğer in vitro yöntemle, ardışık test stratejisi ve kanıt ağırlığı yaklaşımıyla test edileceği için yanlış negatif oranlar kritik düzeyde sayılmaz. Ayrıca, mevcut değerlendirme veri tabanı bazı kimyasal maddelerin ve karışımlar gibi bazı ürünlerin doğru şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamamaktadır. Bununla birlikte, araştırmacılar bu yöntemi kullanmayı oküler aşındırıcı veya aşırı tahriş edici tepkisi olarak pozitif sonuçlar beklenen hallerde her türden test materyali (karışımlar dâhil) için dikkate alabilirler. Yine de tahmin edilen değer, gerçek değerin çok üzerinde çıkabilme riski nedeniyle, alkoller için elde edilen pozitif sonuçlar daha dikkatle yorumlanmalıdır.
   

7. 
   Tavuk gözleri ile yapılacak tüm işlemler test yerinde geçerli olan hayvansal materyallerin işlemden geçirilmesine ilişkin kurallara ve işlemlere bağlı kalmalıdır. Hayvansal materyaller sınıfına dokular ve doku sıvıları da dâhildir. Genel laboratuvar önlemlerinin alınması tavsiye olunur (15).
   

8. 
   Tavşan oküler tahriş edicilik test yöntemiyle değerlendirilen bazı oküler etkileri ve belli düzeyde ağırlık durumunu dikkate alsa da sözkonusu test yönteminin sınırlılıklarından biri de konjonktiv ve iris lezyonları gözönünde bulundurmamasıdır. Ayrıca, kornea lezyonlarının düzelmesi ICE deneyinde başlı başına değerlendirilemese de tavşan gözü çalışmalarına dayanılarak korneadaki lezyonun ilk derinliğine dair değerlendirmenin tersinir veya tersinmez etkileri ayırt etmekte kullanılabileceği ileri sürülmektedir (16). Son olarak, ICE gözün maruz kalmasıyla ilgili sistemik toksisite potansiyelinin değerlendirilmesine olanak tanımamaktadır.
   

9. 
   ICE’nin aşırı olmayan tahriş ediciler ile tahriş edici olmayan maddelerin teşhisinde yararları ve sınırları hakkında tespit çalışmaları halen sürmektedir (ayrıca bkz. paragraf 48). ICE test yönteminin aşırı olmayan tahriş ediciler ile tahriş edici olmayan maddelerin teşhisi dahil olmak üzere gelecekteki olası kullanımlarının tam değerlendirmesi için kullanıcıların numuneleri ve/veya bulguları değerlendirme kuruluşlarına göndermeleri önerilmektedir.
   

10. 
    Bu deneyi ilk defa gerçekleştirecek laboratuarlarda Ek-II’de belirtilen test yeterlik referans kimyasallarının kullanılması gerekmektedir. Laboratuvarlar ICE deneyi verilerini mevzuata göre zararlılık sınıflandırmasını için sunmadan önce bu kimyasalları kullanarak ICE test yöntemini kullanabilme yeterliklerini ortaya koyabilirler.
    

TEST YÖNTEMİNİN İLKESİ

11. 
    ICE test yöntemi tavuk gözünü kısa vadeli olarak in vitromuhafaza eden organotipik bir modeldir. Bu test yönteminde test materyalinin yol açtığı hasar kornea şişmesinin, opaklığının ve floresintutunumunun ölçülmesi sonucunda belirlenir. Kornea şişmesi nicel değerlendirme gerektirirken diğer parametrelerde nitel değerlendirme sözkonusudur. Her ölçümden elde edilen değerler toplam Tahriş Edicilik Endeksinin hesaplanması için nicel bir puana çevrilecek veya test materyalinin in vitrooküler tahriş olma ve aşırı tahriş edicilik sınıflandırma kategorisini belirlemekte nitel değerlendirme verisi olarak kullanılacaktır. Her iki sonuç da sonradan test materyalinin in vivooküler tahriş olma ve aşırı tahriş edicilik sınıflandırma kategorisini belirlemekte kullanılabilir (bkz. Sonuç kriterleri).
    

Tavuk Gözlerinin Kaynağı ve Yaşı

12. 
    Mezbahalara gönderilen tavuklar insanlar tarafından tüketilmek veya diğer ticari amaçlarla öldürülmektedir. Deneyde yalnızca insan besin zincirinde yer almaya uygun sağlıklı hayvanların korneaları kullanılacaktır.
    

13. 
    Optimum tavuk yaşı konusunda kontrollü bir çalışma yürütülmemiş olsa da bugüne kadar test yönteminde kullanılan tavuk yaşı ve ağırlığına göre mezbahalarda işlenen piliçler (yaklaşık 7 haftalık 1,5-2,5 kg) kullanılmaktadır.
    

Gözlerin Toplanması ve Laboratuvara Taşınması

14. 
    Kafalar tavukların bayıltılmasından (genellikle elektrik şokuyla) ve boynun kesilmesinden hemen sonra gövdeden ayrılmalıdır. Laboratuvara yakın yerel bir tavuk kaynağı belirlenecek ve kafalar mezbahadan laboratuvara bozulmayı ve/veya bakteri kirlenmesini en aza indirecek hızda taşınacaktır. Kafaların toplanması ve gözlerin deneyde kullanılması arasındaki zaman aralığı en aza indirilmeli (genellikle iki saat içinde) ve deney sonuçlarına olası etkisi yönünden belirtilmelidir. Bu sonuçlar pozitif ve negatif kontrol tepkilerinin yanı sıra göz seçme kriterleriyle de belirlenmektedir. Deneyde kullanılan gözlerin tamamı belli bir günde toplanmış aynı grup gözlerden olacaktır.
    

15. 
    Gözler laboratuvarda çıkarılacağı için tüm haldeki kafaların mezbahadan laboratuvara ortam sıcaklığında, izotoniksalinle ıslatılmış havlularla nemlendirilen plastik kutularda taşınması gerekmektedir.
    

ICE Deneyinde Kullanılacak Gözler İçin Seçme Kriterleri

16. 
    Çıkartıldıklarında yüksek taban floresin renklenmesi (>0,5) veya kornea opaklığı puanı (>0,5) bulunan gözler kullanılmayacaktır.
    

17. 
    Her işlem grubunda ve eşzamanlı pozitif kontrolde en az üç göz bulunacaktır. Negatif kontrol grubu veya çözücü kontrolünde (salin dışında bir çözücü kullanılıyorsa) en az bir göz bulunacaktır.
    

İŞLEM
Gözlerin Hazırlanması

18. 
    Göz kapakları korneaya zarar verilmeksizin dikkatle kesilecektir. Kornea bütünlüğü kornea yüzeyine birkaç saniyeliğine % 2 (ağırlık/hacim) sodyum floresin damlatılmak ve daha sonra izotoniksalinle yıkanmak suretiyle hemen test edilir. Floresin işleminden geçen gözler yarık lamba mikroskobu ile incelenerek korneanın hasar görmüş (floresintutunumu ve korneaopaklık puanı < 0,5) olup olmadığı saptanır.
    

19. 
    Hasar yoksa gözler korneaya zarar verilmeksizin dikkatle kafatasından çıkarılır. Göz küresi cerrahi forsepsle niktitant zardan sıkıca tutularak göz çukurundan çekilir ve göz kasları kıvrımlı, kör uçlu makasla kesilir. Fazla basınç uygulayarak kornea hasarı (bası eseri) oluşturmamak gereklidir.
    

20. 
    Göz çukurundan çıkarılırken optik sinirin görünür bir parçası üzerinde bırakılmalıdır. Çukurdan çıkarıldıktan sonra göz emici ped üzerine yerleştirilmeli ve niktitantmembran ile diğer bağ dokuları kesilmelidir.
    

21. 
    Çıkartılmış göz kornea dikey gelecek şekilde paslanmaz çelik bir kıskaca yerleştirilecektir. Kıskaç daha sonra damlatma cihazının bir odacığına aktarılır (16). Kıskaç bütün korneaya izotoniksalin damlatılabilecek şekilde yerleştirilmelidir. Damlatma cihazı odacık sıcaklığı 32 ± 1,5 °C olarak tutulmalıdır. Ticari olarak edinilebilecek ya da imal edilebilecek damlatma cihazı ile göz kıskaçlarının çizimi Ek-III’te yer almaktadır. Cihaz,laboratuvarın özel ihtiyaçları karşılamak, örneğin daha farklı sayıda göz yerleştirebilmek için yeniden düzenlenebilir.
    

22. 
    Damlatma cihazına yerleştirildikten sonra gözler yarık lamba mikroskopla incelenerek kesme işlemi sırasında hasar görüp görmediklerine bakılacaktır. Bu sırada kornea kalınlığı da yarık lamba mikroskop üzerindeki derinlik ölçme cihazıyla kornea apeksinden ölçülecektir. (i) Floresin tutunum puanı > 0,5 olan, (ii) korneaopaklığı> 0,5 olan ya da (iii) diğer hasar özellikleri gösteren gözler değiştirilecektir. Bu kriterlerle dışarıda bırakılmayan gözlerden kornea kalınlığı gözlerin toplamının ortalama değerinden % 10’dan fazla sapma gösterenler de kullanılmayacaktır. Kullanıcılar yarık genişliği ayarlarının yarık lamba mikroskopta farklı kornea kalınlık ölçümlerine yol açabileceğini akılda tutmalıdır. Yarık genişliği 0,095 mm’ye ayarlanmalıdır.
    

23. 
    Gözler hepsi incelendikten ve onaylandıktan sonra dozaj öncesi test sitemine denkleştirmek için 45 ila 60 dakika boyunca inkübe edilir. Denkleştirme süresi sonunda, taban değer olarak kullanılmak üzere kornea kalınlığı ve opaklığı için sıfır referans değeri (zaman = 0) kaydedilir. Kesim sırasındaki floresin puanı, sonlanma noktası için taban ölçümü görevi görür.
    

Test Materyalinin Tatbiki

24. 
    Sıfır referans ölçümünün hemen ardından tutucudaki gözler damlatma cihazından çıkarılır, yatay konumda yerleştirilir ve test materyali korneaya tatbik edilir.
    

25. 
    Sıvı test materyalleri genellikle seyreltilmeden tatbik edilir ama gerekli görülen hallerde (örneğin çalışma tasarımı gereği) seyreltilebilir. Seyreltilmiş maddeler için tercih edilen çözücü fizyolojik salindir. Ancak kontrollü koşullarda alternatif çözücüler kullanılabilir. Bu durumda fizyolojik salin dışındaki çözücülerin uygunluğu ortaya konulmalıdır.
    

26. 
    Sıvı test materyalleri korneaya bütün yüzeyi eşit biçimde kaplayacak şekilde ve 0,03 ml standart hacimle tatbik edilir.
    

27. 
    Mümkünse katı maddeler havanla veya benzer bir gereçle öğütülmelidir. Toz korneaya bütün yüzeyi eşit biçimde kaplayacak şekilde tatbik edilir. Standart miktar 0,03 gramdır.
    

28. 
    Sıvı veya katı test materyali 10 saniye tatbik edildikten sonra göz oda sıcaklığında izotonik salinle (yaklaşık 20 ml) yıkanarak temizlenir. Ardından, tutucudaki göz damlatma cihazındaki dikey konumuna tekrar yerleştirilir.
    

Kontrol Maddeleri

29. 
    Her deneyde eşzamanlı negatif veya çözücü/taşıyıcı kontrolleri ve pozitif kontroller kullanılmalıdır.
    

30. 
    % 100 homojen sıvılar veya katı maddeler test edilirken fizyolojik salin ICE test yönteminde eşzamanlı negatif kontrol olarak kullanılarak test sistemindeki deneye özgü olmayan değişimler teşhis edilir ve deney koşullarının hatalı tahriş edici tepkisine yol açmaması güvence altına alınır.
    

31. 
    Seyreltilmiş sıvılar test edilirken eşzamanlı bir çözücü/taşıyıcı kontrol grubu kullanılarak ve test sistemindeki deneye özgü olmayan değişimler teşhis edilir ve deney koşullarının hatalı tahriş edici tepkisine yol açmaması güvence altına alınır. Paragraf 25’te belirtildiği üzere yalnızca test sistemi üzerinde olumsuz etkileri olmayan çözücüler/taşıyıcılar kullanılabilir.
    

32. 
    Uygun bir tepki oluştuğunu doğrulamak için her deneyde eşzamanlı pozitif kontrole bilinen bir oküler tahriş edici dahil edilir. ICE deneyi bu test yönteminde aşındırıcı veya aşırı tahriş edici maddeleri teşhis etmek için kullanıldığından pozitif kontrol bu test yönteminde aşırı tepkiye yol açan bir referans madde olmalıdır. Ancak pozitif kontrol tepkisinde zaman içinde değişimleri değerlendirebilmek için aşırı tepki çok ileri düzeyde olmamalıdır. Pozitif kontrol hakkında yeterli in vitroveriler elde edilerek pozitif kontrol için kabul edilebilir aralık istatistiksel olarak tanımlanmalıdır. Geçmişten gelen uygun ICE test yöntemi verileri belli bir pozitif kontrol için mevcut değilse bu bilgiyi elde etmek için çalışmalar yürütülmesi gerekebilir.
    

33. 
    Sıvı test materyalleri için pozitif kontrol örnekleri % 10 asetik asit veya % 5 benzalkonyumklorür’dür. Katı test materyalleri için pozitif kontrol örnekleri ise sodyum hidroksit veya imidazol’dür.
    

34. 
    Belirli kimyasal veya ürün sınıfından olup bilinmeyen kimyasalların oküler tahriş edicilik potansiyelini veya belli bir tahriş edici tepki aralığındaki oküler tahriş edicilerin göreceli tahriş edicilik potansiyelini değerlendirirken referans maddelerin kullanılması yararlı olacaktır.
    

Sonlanma noktası ölçümleri

35. 
    Kornealar işlem öncesinde ve işlem sonrası yıkamadan 30, 75, 120, 180 ve 240 dakika (± 5 dakika) sonra değerlendirilirler. Bu zaman noktaları dört saatlik işlem süresince uygun sayıda ölçüm yapılmasını ve gerekli gözlemleri bütün gözlerde gerçekleştirecek süreyi sağlar.
    

36. 
    Yapılacak sonlanma noktası değerlendirmeleri korneaopaklığı, şişme, floresintutunumu ve morfolojik etkilerdir (örneğin epitelin çökmesi veya gevşemesi). Floresin tutunumu dışında bütün sonlanma noktası ölçümleri yukarıda belirtilen zaman noktalarında yapılır. Floresin tutunumunun değerlendirmesi ise yalnızca işlem öncesinde ve test materyalinin tatbik edilmesinden 30 dakika sonra yapılır.
    

37. 
    Korneaopaklığı, floresintutunumu ve morfolojik etkileri belgelemek için fotoğraflar çekilmesi ve yapılmışsa histopatoloji sonuçlarının elde edilmesi önerilir.
    

38. 
    Dört saat içindeki son incelemenin ardından olası histopatolojik inceleme için gözlerin uygun bir fiksasyon (örneğin nötr tamponlu formalin) içinde muhafaza edilmesi önerilir.
    

39. 
    Kornea şişmesi, yarık lamba mikroskop üzerindeki optik pakimetre ile yapılan kornea kalınlığı ölçümüyle belirlenir ve aşağıdaki formülle hesaplanan yüzde şeklinde ifade edilir:
    

40. 
    Gözlerin tamamındaki kornea şişmesi tüm gözlem zamanlarında ölçülerek ortalama yüzde hesaplanır. Her test materyaline herhangi bir zaman noktasında gözlemlenen en yüksek ortalama kornea şişme puanından yola çıkılarak toplam kategori puanı verilir.
    

41. 
    Kornea opaklığı, korneanın en yoğun opaklık puanı olan bölgesi üzerinden hesaplanır. Gözlerin tamamındaki kornea opaklığı tüm gözlem zamanlarında ölçülerek ortalama korneaopaklığı değeri hesaplanır. Her test materyaline herhangi bir zaman noktasında gözlemlenen en yüksek ortalama korneaopaklığı puanından yola çıkılarak toplam kategori puanı verilir (Tablo 1).
    

Tablo 1.Kornea opaklığı puanları

Puan	Gözlem
0	Opaklık yok
0,5	Çok silik opaklık
1	Dağınık bölgelerde, irisin ayrıntıları açıkça görülüyor
2	Kolayca fark edilen mat bölge, irisin ayrıntıları biraz belirsizleşmiş
3	Aşırı korneaopaklığı, irisin ayrıntıları seçilemiyor, pupilanın boyu zor fark ediliyor
4	Tam korneaopaklığı, iris görünmüyor

42. 
    Gözlerin tamamının ortalama floresin tutunum değeri yalnızca 30 dakika gözlem zamanı üzerinden hesaplanır ve her test maddesine toplam kategori puanı verilmesinde kullanılır. (Tablo2)
    

Tablo 2.Floresin tutunum puanları

Puan	Gözlem
0	Floresintutunumu yok
0,5	Tek hücrede çok az renk değişikliği var
1	Tek hücredeki renk değişikliği korneanın işlem gören kısmına yayılmış
2	Odak veya karışık yoğun tek hücre renk değişikliği var.
3	Korneanın geniş kısımlarında birleşen floresintutunumu var

43. 
    Morfolojk etkiler kornea epitel hücrelerinin “çökmesi”, epitelin “gevşemesi”, kornea yüzeyinin “pürüzlenmesi” ve test materyalinin korneaya “yapışmasıdır”. Bulgular çeşitli ağırlık derecelerinde olabilir ve aynı zamanda da görülebilirler. Morfolojik etki bulgularının sınıflandırılması araştırmacının yorumuna bağlıdır.
    

VERİLER VE RAPORLAMA
Verilerin Değerlendirilmesi

44. 
    Kornea opaklığı, şişme ve floresintutunumu ayrı ayrı değerlendirilerek her sonlanma noktası hesaplaması için ICE sınıfı elde edilir. Elde edilen ICE sınıfları birleştirilerek her test materyali için Tahriş Edicilik Sınıflandırması ortaya konulur.
    

Karar Kriterleri

45. 
    Her sonlanma noktası değerlendirmesi yapıldıktan sonra önceden belirlenmiş aralığa göre ICE sınıflarına dağıtma yapılabilir. Dört ICE sınıfında kornea kalınlığı (Tablo 3), opaklık (Tablo 4) ve floresin tutunumu(Tablo 5) için aşağıdaki ölçekler kullanılır:
    

Tablo 3

ICE kornea kalınlığı sınıflandırma kriterleri

Korneadaki Ortalama Şişme (%) (*)	ICE Sınıfı
0 ila 5	I
> 5 ila 12	II
>12ilal8(işlemden >75 dakika sonra)	II
>12 ila l8(işlemden <75 dakika sonra)	III
> 18 ila 26	III
> 26 ila 32 (işlemden > 75 dakika sonra)	III
> 26 ila 32 (işlemden < 75 dakika sonra)	IV
> 32	IV

(*) Korneadaki şişme puanları sadece kalınlık No I derinlik ölçüm cihazlı, yarık genişliği 0,095 mm’ye eşit 9^1/2düzeyinde ayarlanmış Haag-Streit BP900 yarık lamba mikroskobu ile ölçülmüşse geçerli sayılır. Kullanıcılar yarık genişliği ayarlarının yarık lamba mikroskopta farklı kornea kalınlık ölçümlerine yol açabileceğini göz önünde bulundurmalıdırlar.

Tablo 4 .ICEopaklık sınıflandırma kriterleri

Ortalama Maksimum Opaklık Puanı (*)	ICE Sınıfı
0,0-0,5	I
0,6-1,5	II
1,6-2,5	III
2,6-4,0	IV

(*) Bkz. Tablo 1
Tablo 5. Ortalama floresintutunumu ICE sınıflandırması

İşlemden 30 dakika sonra Ortalama Floresin Tutunum Puanı (*)	ICE Sınıfı
0,0-0,5	I
0,6-1,5	II
1,6-2,5	III
2,6-3,0	IV

(*) Bkz. Tablo 2.

46. 
    Test materyalinin toplam in vitro tahriş edicilik sınıflandırması korneadaki şişme, korneadaki opaklık ve flöresin tutunumuna ilişkin belirlenen sınıfların kombinasyonuna tekabül eden tahriş edicilik sınıfı alınarak ve Tablo 6’daki şema uygulanarak değerlendirilir.
    

Tablo 6. Toplam in vitro tahriş edicilik sınıflandırması

Sınıflandırma	Üç sonlanma noktası değerlendirmesinin kombinasyonu
Aşındırıcı/Aşırı tahriş edici	3 x IV 2 x IV, 1 x III
	2 x IV, 1 x II (*)
	2 x IV, 1 x I (*)
	Korneaopaklığı> 30 dakikada 3 (en az 2 gözde) Kornea opaklığı = herhangi bir zaman noktasında 4 (en az 2 gözde) Aşırı epitel gevşemesi (en az 1 gözde)

(*) Kornbinasyon olasılığı düşüktür.

47. 
    Paragraf 1’de belirtildiği üzere, test materyali oküler aşındırıcı veya aşırı tahriş edici olarak tanımlanmazsa sınıflandırma ve etiketleme için ek testler yapılması gerekir. ICE test yöntemi EPA (1), AB (2) veya GHS (3) sınıflandırma sistemlerine göre sınıflandırılmış toplamda % 83 (120/144) ila % 87 (134/154) kesinliğe sahip olup, in vivotavşan gözü test yöntemi verileriyle karşılaştırıldığında hatalı pozitif oran % 6 (7/122) ila % 8 (9/116) ve hatalı negatif oran % 41 (13/32) ila % 50 (15/30) düzeyindedir. Belirli kimyasal (alkoller, yüzey aktif maddeler) veya fiziksel (katı maddeler) kategorilerden maddeler veritabanından çıkarıldığında AB, EPA ve GHS sınıflandırma sistemlerine göre ICE kesinliği % 91 (75/82) ila % 92 (69/75), hatalı pozitif oranlar % 5 (4/73) ila % 6 (4/70) ve hatalı negatif oranlar % 29 (2/7) ila % 33 (3/9) düzeyinde gerçekleşmektedir (4).
    
48. 
    Test materyalinin oküler aşındırıcı veya aşırı tahriş edici olarak sınıflanmaması durumunda dahi ICE verileri in vivotavşan gözü testinden veya doğrulanmış bir in vitro testten elde edilen verilerle birlikte ICE test yönteminin aşırı olmayan tahriş ediciler ile tahriş edici olmayan maddelerin teşhisinde kullanışlılığı ve sınırlarının daha iyi değerlendirilmesine yardımcı olabilir.
    

Çalışma Kabul Kriterleri

49. 
    Eşzamanlı negatif veya taşıyıcı/çözücü kontrolleri ile eşzamanlı pozitif kontroller tahriş edici olmayan madde ve aşırı tahriş edici/aşındırıcı sınıflarında Tahriş Edicilik Sınıflandırmasına tekabül ediyorsa kabul edilebilir sayılır.
    

Test Raporu

50. 
    Test raporu çalışmanın yürütülmesine göre aşağıdaki bilgileri içermelidir:
    

Test ve Kontrol Maddeleri

Kimyasal Kuramlar Servisi (ChemicalAbstracts Service - CAS) tarafından kullanılan ad ve biliniyorsa, ardından diğer isimler,

Biliniyorsa CAS Numarası,

Biliniyorsa maddenin veya karışımın (ağırlık yüzdesi olarak) aralığı ve bileşimi,

Çalışmanın yürütülmesiyle ilgili olarak fiziksel durum, uçuculuk, pH, sabitlik, kimyasal grubu, su çözünürlüğü gibi fiziksel ve kimyasal özellikler,

Uygulanıyorsa, test/kontrol maddeleri üzerinde test öncesinde yapılan ısıtma, öğütme gibi işlemler,

Biliniyorsa sabitlik.
Sponsor ve Test Yeri İle İlgili Bilgiler

Sponsorun, test yerinin ve çalışma yöneticisinin adları ve adresleri,

Gözlerin alındığı kaynak (toplandıkları tesis),

Gözlerin depolanma ve taşınma koşulları (toplanma günü ve saati, teste başlamadan önce geçen süre, taşıma araçları ve sıcaklığı, kullanılan antibiyotikler gibi),

Biliniyorsa gözleri toplanan hayvanların özellikleri (donör hayvanın yaşı, cinsiyeti, ağırlığı gibi).

Test Yöntemi ve Protokolün Kullanılma Gerekçeleri

Test Yöntemi Bütünlüğü

Test yönteminin bütünlüğünü (kesinliğini ve güvenilirliğini) süreç boyunca korumaya yönelik işlemler (yeterlik maddelerinin periyodik testleri, geçmiş negatif ve pozitif kontrol verilerinin kullanılması gibi).

Testin Kabul Edilebilirlik Kriterleri

Uygulanabiliyorsa geçmiş verilere dayanan eşzamanlı referans kontrol aralıkları.

Test Koşulları

Kullanılan test sisteminin tanımlanması,

Kullanılan yarık lamba mikroskop modeli,

Kullanılan yarık lamba mikroskobun ayar bilgileri,

Kullanılan tavuk gözlerinin vasıfları ve diğer bilgiler,

Kullanılan test prosedürüne ilişkin bilgiler,

Kullanılan test materyali konsantrasyonu,

Test prosedüründe herhangi bir değişiklik yapılmışsa tanımlanması,

Modelin geçmiş verilerine (negatif ve pozitif kontroller, yeterlik maddeleri, referans maddeler gibi) atıflar,

Kullanılan değerlendirme kriterlerinin tanımlanması.

Sonuçlar

Gözlemlenen diğer etkilerin tanımlanması,

Mevcutsa gözlerin fotoğrafları.
Sonuçların Tartışılması

Sonuç
KAYNAKLAR
(1) U.S. EPA (1996). LabelReview Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2) Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directive 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006. OJ L 353, 31.12.2008, p. 1.

(3) United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Available at:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report –InVitroOcularToxicityTest Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center forthe Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No: 07-4517. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5) ESAC (2007). Statement on theconclusion of the ICCVAM retrospectivestudy on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eyeirritants. Available:[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(6) Regulation (EC) No 1907/2006 of theEuropean Parliament and of theCouncil of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ L 396, 30.12.2006, p. 1.

(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Available:

[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report –In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center fot he Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No: 07-4517. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9) ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10) Prinsen, M.K. andKoëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.Fd. Chem. Toxicol.31:69-76.

(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chickenenucleatedeye test (CEET). Available:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(12) Balls, M.,Botham, P.A., Bruner, L.H. andSpielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.Toxicol. In Vitro9:871-929.

(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosionpotential of test materials. FoodChem. Toxicol. 34:291-296.

(14) Chamberlain, M.,Gad, S.C., Gautheron, P. And Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation.FoodChem. Toxicol.35:23-37.

(15) Siegel, J.D.,Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., andthe Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16) Maurer, J.K.,Parker, R.D. andJester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: keyfindings and recommendations for the development of alternativeassays.Reg. Tox. Pharmacol.36:106-117.

(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants.Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(19) ICCVAM (2006). Background reviewdocument, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

Ek-I
TANIMLAR
Doğruluk: Test yöntemi sonuçları ile kabul edilen referans değerler arasındaki uyuşma düzeyi.Test yöntemi performansını ölçmek için kullanılır ve 'bağıntılılık' kavramının bir yönüdür. Bu terim sık sık 'uyum' kavramıyla karşılanarak test yönteminden kaynaklanan doğru sonuçlar anlamında kullanılır.
Referans madde: Test maddesi ile karşılaştırmada standart olarak kullanılan madde. Referans maddenin şu özellikleri taşıması gerekir: (i) Sürekli ve güvenilir kaynaklar, (ii) Test konusu maddeler sınıfıyla yapısal ve işlevsel benzerlik, (iii) Bilinen fiziksel/kimyasal özellikler, (iv) Bilinen etkiler hakkında destekleyici veriler ve (v) İstenen tepki aralıksında bilinen kuvvet.
Kornea: Göz küresinin önünde yer alan ve iris ile pupillayı kaplayarak içeriye ışık ileten saydam kısım.
Korneaopaklığı: Test materyali tatbik edildikten sonra korneada ölçülen opaklık düzeyi. Artankorneaopaklığı korneanın hasar gördüğünü gösterir. Opaklık, Draize tavşan gözü testinde olduğu gibi öznel olarak veya opaklık ölçer gibi bir cihazla nesnel olarak değerlendirilebilir.
Kornea şişmesi: ICE testinin kornea test materyaline maruz bırakıldıktan sonra şişme derecesini belirleyen nesnel bir ölçümdür. Taban (dozaj öncesi) kornea kalınlığı ölçümleri ile test materyaline maruz kalma sonrasında düzenli aralıklarla kaydedilen kalınlıklar üzerinden hesaplanır ve yüzde olarak ifade edilir. Kornea şişmesinin derecesi kornea hasarını gösterir.
EPA Kategorisi 1: 21 günden daha fazla süren aşındırıcı (göz dokusunda kalıcı hasar) veya kornea etki ya da tahriş olma (1).
AB Kategorisi R41: Test materyalinin gözün dış yüzeyine tatbikinden sonra ortaya çıkan ve uygulamadan sonra 21 gün içinde tam olarak düzelmeyen doku hasarı veya ciddi görme bozukluğu(2).
Yanlış negatif oran: Test yöntemi tarafından yanlış olarak negatif teşhis edilen bütünpozitif maddelerin oranı. Test yöntemi performansının göstergelerinden birisidir.
Yanlış pozitif oran:Test yöntemi tarafından yanlış olarak pozitif teşhis edilen bütünnegatif maddelerin oranı. Test yöntemi performansının göstergelerinden birisidir.
Floresin tutunumu: ICE testinde korneanın test materyaline maruz kalmasının ardından epitel hücrelerinde biriken floresin sodyum miktarına ilişkin öznel bir ölçümdür. Floresintutunumu derecesi kornea epitelindeki hasarı gösterir

.

GHS (Kimyasalların Sınıflandırılması ve Etiketlenmesinde Küresel Uyumlaştırma Sistemi): Kimyasalları (maddeler ve karışımlar) standart tip ve fiziksel, sağlık ve çevresel zararlılık düzeylerine göre sınıflandıran, zararlılık işaretleri, uyarı kelimeleri, zararlılık ifadeleri, önlem ifadeleri ve güvenlik bilgi formları gibi iletişim araçlarla insanlar (çalışanlar, taşımacılar, tüketiciler, acil yardım personeli gibi) ve çevre üzerinde olumsuz etkileri hakkında bilginin iletimini sağlayan sistem(3).

GHS Kategorisi1:Test materyalinin gözün dış yüzeyine tatbikinden sonra ortaya çıkan ve uygulamadan sonra 21 gün içinde tam olarak düzelmeyen doku hasarı veya ciddi görme bozukluğu(3).
Tehlike: Bir maddenin veya bu maddeye maruz kalma durumunun maruz kalan sistem veya (alt) popülasyon üzerinde olumsuz etkide bulunma potansiyeli.
In VitroTahriş Edicilik Puanı (IVIS): BCOP deneyinde her uygulama grubunun ortalama opaklık ve ortalama geçirgenlik değerlerinin her grup için tek bir in vitropuan olarak birleştirildiği ampirik formül. IVIS = ortalama opaklık değeri + (15 *ortalama geçirgenlik değeri).
Negatif kontrol: Test sisteminin bütün bileşenlerini içeren işlemsiz tekrar. Bu numune test materyali tatbik edilmiş numunelerle ve diğer kontrol numuneleri ile işlenerek çözücünün test sistemiyle etkileşim içinde olup olmadığı saptanır.
Tahriş edici olmayan madde: EPA Kategorisi I, II veya III; AB Kategorisi R41 ve R36; veya GHS Kategorisi 1, 2A, veya 2B oküler tahriş ediciler kapsamında olmayan maddeler.
Oküler aşındırıcı: (a) Göz dokusunda kalıcı hasara yol açan maddeler, (b) GHS Kategorisi 1, EPA Kategorisi I veya AB Kategorisi R41 oküler tahriş ediciler kapsamında yer alan maddeler (1) (2) (3).
Oküler tahriş edici: (a) Gözün dış yüzeyine tatbik edilmesinin ardından göz üzerinde tersinir değişime yol açan maddeler, (b) EPA Kategorisi II veya III, AB Kategorisi R36 ya da GHS Kategorisi 2A veya 2B oküler tahriş ediciler kapsamında yer alan maddeler (1) (2) (3).
Oküler aşırı tahriş edici: (a) Gözün dış yüzeyine tatbik edilmesinin ardından 21 gün içinde düzelmeyen doku hasarına yada ciddi görme kaybına yol açan maddeler, (b) GHS Kategorisi 1, EPA Kategorisi I ya da AB Kategorisi R41 oküler tahriş ediciler kapsamında yer alan maddeler (1) (2) (3).
Opaklık ölçer: 'Korneaopaklığını" korneadan geçen ışığı değerlendirerek ölçen cihaz. Tipik cihazın iki kısmı bulunmakta olup her biri kendi ışık kaynağına ve fotoseline sahiptir. Kısımlardan biri işlemden geçirilmiş kornea için kullanılırken diğeri cihazın kalibrasyonu ve sıfırlaması için kullanılır. Halojen lamba ışığı kontrol kısmından (pencere ve sıvı bulunmayan boş odacık) fotosele gönderilir ve korneanın bulunduğu odacığı içeren deney kısmından fotosele gönderilen ışıkla karşılaştırılır. Fotosellerden ışık iletimindeki fark karşılaştırılır ve sayısal opaklık değeri dijital ekranda gösterilir.
Pozitif kontrol: Test sisteminin bütün bileşenlerini içeren ve pozitif tepki doğuracağı bilinen bir maddeyle işlem yapılan tekrar. Pozitif kontrol tepkisindeki değişkenliğin süreç boyunca değerlendirilebilmesi için aşırı tepkinin boyutu çok ileri düzeyde olmamalıdır.
Güvenilirlik: Farklı zamanlarda aynı laboratuvarda ve farklı laboratuvarlarda aynı protokol kullanıldığında test yöntemindeki ölçümlerin yeniden üretilebilirlik düzeyi. Laboratuvar içinde ve laboratuvarlar arasında yeniden üretilebilirlik ile laboratuvar içinde tekrar edilebilirlik hesaplanarak değerlendirilir.
Yarık lamba mikroskop: Binoküler mikroskopla büyüterek stereoskopik, dik görüntü elde edilen ve gözün doğrudan incelendiği bir alettir.ICE test yönteminde bu alet tavuk gözünün iç yapılarını gözlemlemek ve ekli derinlik ölçücü cihazla kornea kalınlığını nesnel olarak ölçmek amacıyla kullanılır.
Çözücü/taşıyıcı kontrolü: Test sistemindeki test materyali tatbik edilmiş çözücü veya taşıyıcı dahil bütün bileşenleri ve diğer kontrol numunelerini içeren aynı çözücü veya taşıyıcıda çözünen test materyali tatbik edilmiş numuneler için taban tepki tespit etmeyi amaçlayan işlenmemiş numune. Bu numune eşzamanlınegatif kontrolle test edildiği zaman ayrıca çözücü veya taşıyıcının test sistemiyle etkileşime girip girmediğini de gösterir.
Aşamalı test: Test materyali hakkındaki mevcut bütün bilgilerin belirlenen sırayla gözden geçirildiği aşamalı bir test stratejisidir. Her bir sırada, sonraki sıraya geçmeden önce kanıt ağırlığı yaklaşımıyla tehlike sınıflandırması sonucuna ulaşılabilecek yeterli bilgi bulunup bulunmadığı kararlaştırılır. Test materyalinin tahriş edicilik potansiyeli mevcut bilgilere göre belirlenebiliyorsa ek testlere gerek duyulmaz. Test maddesinin tahriş edicilik potansiyeli mevcut bilgilere göre belirlenemiyorsa kesin sınıflandırma olanaklı hale gelinceye kadar ardışık hayvan testleri yapılır.
Doğrulanmış test yöntemi: Belirli bir amaca ilişkin bağıntılılık (doğrulukla birlikte) ve güvenilirlik değerlendirmesi için doğrulama çalışmalarının tamamlanmış olduğu testyöntemi. Doğrulanmış test yönteminin belirli amaç yönünden doğruluk ve güvenilirlik değerlendirmesinde yeterli performans gösteremeyebileceğini belirtmek gerekir.
Kanıt ağırlığı: Maddenin tehlike potansiyeline ilişkin sonuca ulaşmak ve bu sonucu desteklemek için çeşitli verilerin yeterli ve yetersiz yönlerinin değerlendirilmesi süreci.
Ek-II
ICE test yöntemi için yeterlik maddeleri
Bu test yöntemine ilişkin rutin kullanım öncesinde laboratuvarlar Tablo 1’de önerilen oküler aşındırıcılık sınıflandırmasını doğru yapabilmek konusunda teknik yeterliliklerini ortaya koyabilirler. Sözkonusu maddeler lokal göz tahriş olma/korozyonuna dair in vivotavşan gözü testinden elde edilen tepkiler aralığını yansıtacak şekilde belirlenmiştir (TG 405) (örneğin 1, 2A, 2B veya BM GHS’ye göre sınıflandırılmamış ve etiketlenmemiş (3) (7)). Ancak, bu deneylerin doğrulanmış yararları gözönünde bulundurulduğunda (yalnızca oküler aşındırıcıların/aşırı tahriş edicilerin teşhisi yönünden), sınıflandırma yönünden (aşındırıcı/aşırı tahriş edici veya aşındırıcı/aşırı tahriş edici olmayan maddeler) yeterliği gösterebilecek sadece iki test sonucu mevcuttur. Diğer seçme kriterleri maddelerin ticari yolla edinilebilir olması, yüksek kalitede in vivoreferans verilerin mevcut olması ve Test Talimatnamesinin oluşturulduğu iki in vitroyönteme ilişkin yüksek kaliteli veriler bulunmasıdır. Bu nedenle yeterlik maddelerinin ICCVAM tarafından in vitrooküler toksisite testi yöntemlerinin doğrulanması için önerilen 122 referans madde listesinden seçilmesi gerekmektedir (bkz. Ek H: ICCVAM Önerilen Referans Maddeler Listesi) (5). Referans veriler Sığır korneası opaklığı ve geçirgenliği (BCOP) ve ICE test yöntemleri için ICCVAM Arka Plan Gözden Geçirme Belgelerinde mevcuttur (18) (19).

Tablo 1. ICE deneylerinde teknik yeterlik için önerilen maddeler

Madde	CAS No	Kimyasal grupları (^1)	Fiziksel Hali	In Vivo Sınıflandırması (^2)	In Vitro Sınıflandırması (^3)
Benzalkonyumklorid (% 5)	8001-54-5	Onyum bileşiği	Sıvı	Kategori 1	Aşındırıcı/Aşırı tahriş edici
Klorheksidin	55-56-1	Amin, Amidin	Katı	Kategori 1	Aşındırıcı/Aşırı tahriş edici
Dibenzoil-L-tartarik asit	2743-38-6	Karboksilik asit, Ester	Katı	Kategori 1	Aşındırıcı/Aşırı tahriş edici
İmidazol	288-32-4	Heterosiklik	Katı	Kategori 1	Aşındırıcı/Aşırı tahriş edici
Trikloroasetik asit (% 30)	76-03-9	Karboksilik Asit	Sıvı	Kategori 1	Aşındırıcı/Aşırı tahriş edici
2,6-Diklorobenz-oil klorid	4659-45-4	Asil halid	Sıvı	Kategori 2A	Aşındırıcı/aşırı tahriş edici değil
Etil-2-metilaseto-asetat	609-14-3	Keton, Ester	Sıvı	Kategori 2B	Aşındırıcı/aşırı tahriş edici değil
Amonyum nitrat	6484-52-2	İnorganik tuz	Katı	Kategori 2A	Aşındırıcı/aşırı tahriş edici değil
Gliserol	56-81-5	Alkol	Sıvı	Etiketlenmemiş	Aşındırıcı/aşırı tahriş edici değil
n-Heksan	110-54-3	Hidrokarbon (asiklik)	Sıvı	Etiketlenmemiş	Aşındırıcı/aşırı tahriş edici değil

(¹)Test materyallerine ilişkin kimyasal sınıflar National Library of MedicineMedicalSubjectHeadings (MeSH) sınıflama sistemine (http://www.nlm.nih.gov/mesh) göre oluşturulmuş standart sınıflandırma şeması uyarınca belirlenmiştir.

(2)In vivo tavşan gözü testi (OECD TG 405) sonuçlarına göre ve BM GHS (3)(7) kullanılarak oluşturulmuştur.

(3)BCOP ve ICE sonuçlarına göre oluşturulmuştur.

Ek-III
ICE damlatma cihazı ile göz kıskaçlarının çizimleri

(Damlatma cihazı ile göz kıskaçlarının ek nitelikleri için bkz. Burtonv.d. (17))

KISIM KESİTİ
GÖZ TUTUCU