FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
Ek- I Yeniden oluşturulmuş su Uygun seyreltme suyu örneği
Su içerisinde çöz ve 1 litreye seyrelt. MgSO4. 7H2O (mağnezyum sülfat heptahidrat): 4,93 g Su içerisinde çöz ve 1 litreye seyrelt. NaHCO3(sodyum hidrojen karbonat): 2,59 g Su içerisinde çöz ve 1 litreye seyrelt. KCI (potasyum klorür): 0,23 g Su içerisinde çöz ve 1 litreye seyrelt. Yeniden oluşturulmuş seyreltme suyu Dört stok çözeltisinden 25 ml alarak karıştır 1 litreye su ile tamamla. Çözünmüş oksijen konsantrasyoni hava-doygunluk değerine eşit oluncaya kadar havalandır. pH 7,8 ± 0,2 olmalıdır. Eğer gerekliyse pH’ ı NaOH (sodyum hidroksit) ve HCl (hidroklorik asit) kullanarak ayarla. Daha önce hazırlanmış olan seyreltme suyu 12 saattir bekliyorsa daha fazla havalandırılmamalıdır. Çözeltideki Ca ve Mg iyonlarının toplamı litrede 2,5 mmol. Ca:Mg iyonlarının oranı 4:1 ve Na:K iyonlarının oranı 10:1’dir. Bu çözeltinin toplam bazlığı litrede 0,8 mmol dür. Seyreltme suyunun hazırlanmasındaki herhangi bir sapma suyun bileşimini ve özelliklerini değiştirmemelidir. Ek-II
Toplama
Yukarıda listelenen balıklar beslemesi kolay ve tüm bir yıl boyunca geniş oranda bulunabilen balıklardır. Yavrulamaya, hastalık altında ve kontrollu parazit koşullarında balık çiftliklerinde ve laboratuvarlarda yetiştirilmeye eğilimlidirler, bu sebeple nesli bilinen test hayvanları sağlıklı olacaklardır. Bu balıklar dünyanın birçok bölgesinde bulunabilirler. Ek-III Konsantrasyon: ölüm yüzdesi örneği Log olasılık kağıdı kullanarak LC50’ nin elde edilmesi örneği
Bu akut hareketsizleştirme test yöntemi, OECD TG 202’ye (2004) eşdeğerdir.
Bu yöntem su pirelerinde (daphnia sp.) kimyasalların etkilerini değerlendirmek için akut toksisite testini tanımlar. Mümkün olduğunca mevcut yöntemlerden de faydalanılmıştır (1)(2)(3).
Bu yöntem kapsamında aşağıdaki tanımlar kullanılır: EC50: Belirlenen maruz kalma süresinde su pirelerinin % 50’sinin hareketsizleşeceği tahmini konsantrasyondur. Başka bir tanım kullanılırsa referans bilgisiyle birlikte raporlanmalıdır. Hareketsizleştirme: Test tüpünün hafifçe çalkalanmasından sonra 15 dakika içerisinde yüzemeyen hayvanlar, antenlerini hareket ettirebilseler bile, hareketsizleştirilmiş sayılır.
Testin başında 24 saatlikten küçük olan genç su pireleri bir konsantrasyon aralığında 48 saatlik bir sürede test maddesine maruz bırakılır. Hareketsizleştirme 24. ve 48. saatte kayıt edilir ve kontrol değerleriyle karşılaştırılır. Sonuçlar 48 saatlik EC50 değerini hesaplamak için analiz edilir (bkz. Bölüm 1.2 Tanımlar). 24 saatlik EC50 değerinin hesaplanması tercihe bağlıdır.
Test maddesinin suda çözünürlüğü ve buhar basıncı bilinmeli, raporlanmış geri kazanım yeterliliğiyle birlikte, maddenin test çözeltisi içindeki miktarın belirleneceği güvenilir bir analitik yöntem ve saptama sınırları mevcut olmalıdır. Yapısal formül, maddenin saflığı, suda veya ışıkta kararlılığı, Pow ve kolay biyobozunurluk testinin sonuçlarının bilinmesi faydalıdır (bkz. Yöntem C.4) Not: test yapılmasını zorlaştıran fizikokimyasal özellikleri olan maddeler için rehber (4)’de verilmiştir.
Referans maddesi test koşullarının güvenilir olup olmadığının kontrolü için EC50’nin ölçümünde test edilebilir. Uluslararası halka-testlerinde kullanılan toksik maddeler (1)(5) bu amaç için tavsiye edilir1. Referans maddesiyle yapılan testler yılda en az iki defa ve tercihen her ay yapılmalıdır.
Testin geçerli olması için aşağıdaki performans kriteleri uygulanmalıdır:
Not: İlk kriter için kontrol su pirelerinin % 10’undan fazlası hareketsizleşme veya diğer hastalık yada stres işareti, örneğin renksizleşme, su yüzeyinde tutulu kalma gibi olağandışı davranış göstermemelidir.
Test çözeltisiyle temas edecek test tüpleri ve diğer düzenek ekipmanları camdan veya kimyasal tepkimeye girmeyecek başka bir malzemeden yapılmış olmalıdır. Test tüpleri veya beherleri genelde cam olur ve her kullanımdan önce standart laboratuvar usullerine göre temizlenir. Test tüpleri buharlaşmadan dolayı su kaybını engellemek için gevşekçe kaplanmalı ve çözeltinin içine toz girmesi engellenmelidir. Uçucu maddeler tamamen doldurulmuş ve kısıtlayıcı veya çok düşük oksijen girişini engellemeye yetecek kadar büyük kapalı tüplerde test edilmelidir (bkz. Bölüm 1.6 ve Bölüm 1.8.3’ün ilk paragrafı). Ek olarak aşağıdaki ekipmandan bazıları yada tümü kullanılır: oksijen-metre (mikroelektrodlu veya düşük hacimli numunelerde çözünmüş oksijeni ölçmek için uygun diğer ekipman), pH-metre, sıcaklık kontrolü için yeterli araç, toplam organik karbon konsantrasyonunu (TOC) ölçen araç, kimyasal oksijen ihtiyacı (KOİ) ölçen araç, sertlik ölçen araç.
Daphnia pulex gibi diğer uygun su piresi türleri de kullanılabiliyor olsa da, Daphnia magna Straus bu test için tercih edilen türdür. Testin başında, hayvanlar 24 saatlikten daha küçük olmalı ve değişkenliği azaltmak için ilk kuşaktan olmamalıdır. Hayvanlar sağlıklı bir stoktan alınır (yüksek ölüm oranı, erkek veya kış yumurtalarının (ephippia) varlığı, ilk neslin üretiminde gecikme, renksizleşmiş hayvanlar gibi herhangi bir stres işareti göstermemelidir). Testlerde kullanılan bütün organizmalar aynı su piresi stokundan oluşturulan kültürlerden alınır. Stok hayvanları test hayvanları ile aynı kültür koşullarında (ışık, sıcaklık, ortam) korunur. Eğer test için kullanılan su piresi kültür ortamı rutin su piresi kültüründen farklı ise test öncesi ortama alıştırma süresi uygulanması iyi olur. Bunun için yavru su pireleri teste başlamadan 48 saat önce test sıcaklığındaki seyreltme suyunda korunur.
Eğer su pireleri kültür, uyum ve test süresince stres işareti göstermeden hayatta kalabiliyorlarsa doğal su (yüzey ya da yeraltı suyu), yeniden oluşturulmuş su veya kloru alınmış musluk suyu bekleme veya seyreltme suyu olarak kullanılabilir. Kimyasal özellikleri Ek-I’de listelenen kabul edilebilir seyreltme suyu ile uyumlu olan herhangi bir su test suyu olarak uygundur. Su test boyunca aynı kaliteyi korumalıdır. Yeniden oluşturulmuş su belirli miktarda deiyonize veya distile suya kabul edilen analitik derecede belirli miktarda reaktif katılarak yapılabilir. Yeniden oluşturulmuş su örnekleri (1)(6) ve Ek-II’de verilmektedir. Ek-II’de yer alan M4 ve M7 gibi şalet oluşturucuları içeren ortamların metal içeren test maddelerinden sakınılması gerekir. pH 6-9 aralığında olmalıdır. Daphnia magna için sertliğin 140-250 mg/l (CaCO3) aralığında olması tavsiye edilir, ancak diğer su piresi türleri için daha düşük sertlikte uygun olabilir. Seyreltme suyu çözünmüş oksijen konsantrasyonunun doygunluğa ulaşması amacıyla test için kullanılmadan önce havalandırılır. Eğer doğal kullanılıyorsa, kalite parametreleri yılda en az iki defa veya parametrelerin önemli boyutta değiştiğinden şüphelenildiği durumlarda ölçülmelidir (bkz. önceki paragraf ve Ek-I). Ağır metal (örneğin Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) ölçümleri de yapılmadır. Kloru giderilmiş musluk suyu kullanılırsa günlük klor analiz gerekebilir. Eğer seyreltme suyu yüzey ya da yer altı suyu ise iletkenlik ve toplam organik karbon (TOK) veya kimyasal oksijen ihtiyacı (KOİ) ölçülmelidir.
Seçilen konsantrasyonlardaki test çözeltileri genellikler stok çözeltinin seyreltilmesi ile hazırlanır. Stok çözelti tercihen test maddesinin seyreltme suyunda çözünmesiyle hazırlanır. Çözücülerin, emülgatörlerin veya dispersanların kullanılmasından mümkün oldukça kaçınılmalıdır. Bununla birlikte, bu bileşikler bazı durumlarda uygun konsantrasyondaki stok çözeltilerini hazırlamada gerekli olabilir. Uygun çözücüler, emülgatörler ve dispersanlar için rehber (4)’de verilmiştir. Test çözeltisindeki test maddesi seyreltme suyundaki çözünürlük limitlerini hiçbir zaman geçmemelidir. Test, pH ayarlanması yapmadan yürütülür. Eğer pH 6-9 aralığında kalmıyorsa, ikinci bir test yapılır ve bu testte stok çözeltinin pH’ı, test maddesi eklenmeden önceki seyreltme suyunun pH’ına eşit hale getirilir. pH, stok çözelti konsantrasyonunu önemli bir şekilde değiştirmeyecek, kimyasal bir tepkimeye veya test maddesinin buharlaşmasına yol açmayacak bir şekilde ayarlanmalıdır. HCl ve NaOH tercih edilir.
Test tüpleri, uygun miktarda seyreltme suyu ve test maddesi çözeltileri ile doldurulur. Tüpteki hava/su hacim oranı test ve kontrol grubunda eşit olmalıdır. Sonra, su pireleri test tüplerine yerleştirilir. Her test konsantrasyonu ve kontrol grubu başına tercihen beş hayvanlık dört grup halinde en az 20 hayvan kullanılır. Her hayvan içim en az 2 ml test çözeltisi gereklidir (yani test tüpü başına 5 su piresi için 10 ml hacim). Test için yarı-statik yenilenme sistemi veya test maddesi kararlı değilse akışlı sistem kullanılabilir. Uygulama serilerine ilaveten, seyreltme-su kontrol serisi için bir tane ve ayrıca, ilgili olduğu yerlerde, çözücü ajanı içeren kontrol serisi için de bir tane test yapılır.
Test maddesinin toksisitesi hakkında mevcut bilgi bulunmuyorsa, aralık-bulma testi yapılarak belirleyici test için konsantrasyon aralığı tespit edilir. Bu amaçla, test maddesinin çok çeşitli konsantrasyonlarına maruz bırakılırlar. Beş su piresi her test konsantrasyonunda en az 48 saat veya daha az maruz bırakılır; tekrar gerekli değildir. Aralık bulma testi için uygun veri daha az sürede elde edilebiliyorsa, maruz kalma süresi kısaltılabilir (örneğin 24 saat veya daha az). En az beş test konsantrasyonu kullanılır. Bu konsantrasyonlar, tercihen 2,2’yi aşmayan katlarda bir geometrik seri ile düzenlenir. Beşten daha az sayıdaki konsantrasyon kullanılırsa, gerekçe gösterilmelidir. En yüksek test konsantrasyon ile %100 hareketsizlik; en düşük konsantrasyon ile gözlemlenen etki bulunmaması tercih edilir.
Sıcaklık 18 oC ile 22 oC aralığında olmalı ve her bir test için ±1 oC aralığında sabit tutulmalıdır. 16 saat aydınlık, ardından 8 saat karanlık döngüsü tavsiye edilir. Özellikle test maddesinin ışıkta kararsız olduğu durumlarda, tam karanlık kabul edilir.
Test süresi 48 saattir.
Her test tüpünde, testin başlangıcından itibaren 24. ve 48. saatlerde hareket etmeyen su pireleri olup olmadığı kontrol edilir (Tanımlar için 1.2’ye bkz.). Hareketsizliğe ilaveten, bütün anormal davranışlar veya görünüşler rapora yazılır.
Testin başında ve sonunda kontrol grubunda (gruplarında) ve en yüksek test maddesi konsantrasyonunda Çözünmüş oksijen ve pH ölçülür. Kontrollerdeki çözünmüş oksijen konsantrasyonu geçerlilik ölçütlerini (Bölüm 1.6’ya bkz.) sağlamalıdır. pH herhangi bir testte 1,5 birimden daha fazla değişkenlik göstermemelidir. Sıcaklık, genelde kontrol tüplerinde veya ortam havasında ölçülür. Tercihen test süresi boyunca devamlı olarak ama en azından testin başlangıcı ve sonunda en az iki defa olmak üzere sıcaklık ölçülür ve kayıt tutulur. Test maddesinin konsantrasyonu, en azından en yüksek ve en düşük test konsantrasyonlarında, testin başlangıcı ve sonunda ölçülmelidir (4). Sonuçların ölçülmüş konsantrasyonlara dayandırılması tavsiye edilir. Bununla beraber, test maddesi konsantrasyonunun test süresi boyunca nominalin veya başlangıçta ölçülen konsantrasyonun ±%20 aralığında korunduğu yeterli bir şekilde kanıtlanabilirse, bu durumda sonuçlar nominal değere veya ölçülmüş ilk değere dayandırılabilir.
Bu yöntemde açıklanan prosedürler kullanılarak, test maddesinin 100mg/l’lik konsantrasyonunda veya test ortamındaki azami çözünürlük sınırında (hangi konsantrasyon daha düşükse) bir sınır testi yapılabilir. Bunun amacı, EC50’nin ölçülen konsantrasyondan daha büyük olduğunu göstermektedir. Sınır testinde, (tercihen beşer su piresi içeren dört gruba ayrılmış)20 su piresi kullanılır. Kontrol(ler)de de 20 su piresi kullanılmalıdır. Hareketsizlik oluşursa, tam bir çalışma yürütülmelidir. Gözlemlenen bütün anormal davranışlar raporlanmalıdır.
Veri, tablo şeklinde özetlenir; her uygulama ve kontrol grubu için kullanılan su piresi sayısı ve her gözlemdeki hareketsizlik sayısı bu tabloda gösterilir. 24. ve 48. saatlerde ölçülen hareketsizlik yüzdesinin, test konsantrasyonlarına karşı grafiği çizilir. Eğrilerin eğimlerini ve %95 güven aralığında EC50’yi (p=0,05)hesaplamak için uygun istatistik yöntemleri (ör. Probit analizi, vs.) kullanılarak veri analizi edilir (7)(8). EC50 hesaplarken kullanılan standart yöntemler elde edilen verilere uygulanamıyorsa EC50’ye yakın bir değer hesaplayabilmek için hareketsizliğe yol açmayan en yüksek konsantrasyon ve %100 hareketsizlikle sonuçlanan en düşük konsantrasyon kullanılır (bu iki konsantrasyonun geometrik ortalaması alınır).
Test raporu aşağıdakileri içerir: Test maddesi:
Test türleri:
Test koşulları:
Sonuçlar;
Ek- I KABUL EDİLEBİLİR SEYRELTME SUYUNUN BAZI KİMYASAL ÖZELLİKLERİ
Ek- II YENİDEN OLUŞTURULMUŞ TEST SUYU ÖRNEKLERİ ISO Test Suyu (1)
Elendt M7 ve M4 ortamı Elendt M4 ve M7 ortamına aklimatizasyon Bazı laboratuvarlar su pirelerini M4 ve M7 ortamında doğrudan transferinde sıkıntılar yaşamışlardır. Ancak aşamalı aklimatizasyon ile başarı sağlandığı gözlenmiştir, örn. kendi ortamından %30 Elendt ortamına, sonra %60 Elendt ve %100 Elendt ortamına. Aklimatizasyon için bir aylık bir süre gereklidir. Hazırlık Eser Elementler İlk önce uygun saflıktaki suda (örn. deiyonize, distile veya ters osmoza tabi tutulmuş) Münferit Eser Elementlerin Stok Çözeltileri (I) ayrılmalıdır. Farklı olan bu Stok (I) çözeltisinden tüm eser elementleri içeren (birleşik çözelti) ikinci bir stok çözelti olan Stok (II) hazırlanmalıdır. örn.;
M4 ve M7 ortamı M4 ve M7 ortamı Stok (II) çözeltisi, makro gıdalar ve vitaminler kullanılarak aşağıdaki gibi hazırlanır:
Birleşik Vitamin Stok’u küçük parçalar halinde donmuş olarak saklanır. Vitaminler kullanımdan kısa bir süre önce ortama eklenir. Not: Tuz çökeleklerinin oluşumunu engellemek için, stok çözelti parçalarını yaklaşık 500-800 ml deiyonize suya ekleyin ve daha sonra 1 litreye tamamlayın. Not: M4 ortamına ilişkin ilk yayın Elendt’de bulunabilir,B.p. (1990).Selenium deficiency in crustacea;an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus.Protoplasma,154,25-33 Yüklə 5,29 Mb. Dostları ilə paylaş:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
