FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- KAYNAKLAR Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1
- Balık örnekleme Örnek zaman şablonu Su örneği sayısı
- İlave örnekleme Alım evresi
- C.14 YAVRU BALIK BÜYÜME TESTİ YÖNTEM
- Etki gözlemlenmeyen konsantrasyon (NOEC)
- Depo ortalamasına özgül büyüme hızı
|
(1) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231 Farklı ülkelerde çeşitli nehir ağzında ve denizde yaşayan türleri kullanılmıştır. Örneğin: Benek…………………………………………………………...Leiostomus xanthurus Aptal golyanbalığı……………………………………….........Cyprinodon variegatus Gümüş sırt…………………………………………………………….Menidia beryllina Tatlısu levreği……………………………..........................Cymatogaster aggregata İngiliz dil balığı………………………………………………………Parophrys vetulus Geyik balığı ………………………………………………………Leptocottus armatus Üçlü tatlısu balığı……………………………………… …….Gasterosteus aculeatus Deniz levreği………………………………………………………. Dicentracus labrax Tatlısusardalyası……………………………………………………Alburnus alburnus
Alım ve atılım evrelerinin sürelerinin tahmini
Testi gerçekleştirmeden önce, k2’nin kestirimi ve dolayısıyla yatışkın hale ulaşmak için gereken zamanın bir kısım yüzdesi k2 ve n-oktanol/su dağılım katsayısı (Pow) yada k2 ve sudaki çözünürlük arasındaki ilişkiden elde edilebilir. k2’nin yaklaşık değeri (gün-1) örnek olarak aşağıdaki ampirik ilişkiden elde edilebilir. (Eşitlik 1)  Diğer ilişkiler için referans 2’ye bakınız. Eğer dağılım katsayısı (Pow) bilinmiyorsa, maddenin sudaki çözünürlüğü hakkındaki bilgi (3) kullanılarak bir kestirim yapılabilir. (Eşitlik 2) burada s= çözünürlük (mol/L) : (n=36) Bu ilişkiler yalnızca Pow değerleri 2 ve 6.5 arasında değişen kimyasallara uygulanabilir (4) Yatışkın halin belli bir yüzdesine ulaşmak için geçen süre alım ve atılımı tanımlayan genel kinetik denklemle(birinci derece kinetik) k2 kestirimini uygulanarak elde edilebilir.  veya Cw sabitse: 
eşitlik (3) yatışkın hale ulaşıldığında (t>∞) eşitlik 3 (5) ya da (6)’ya dönüşebilir:
yada
Sonra k1/k2 .Cw yatışkın halde balıktaki derişimi bulmak için uygun bir yaklaşımdır(Cf,s). Eşitlik 3 aşağıdaki gibi yeniden yazılabilir.  
yada eşitlik (4) Eşitlik 4 uygulanarak yatışkın halin belli bir yüzdesine ulaşmak için geçen süre k2 eşitlik 1 veya 2’den tahmin edilebilir. Rehber olarak, istatistiksel olarak kabul edilebilir veriler (BCFk) üretmek için istatistiksel en uygun alım zamanı test maddesinin balıktaki konsantrasyonunun logaritmasının zamana karşı değişim eğrisinin yarı noktaya ulaştığı yada, 1.6/k2, yada yatışkın halin %80’nine ulaştığı ancak 3.0/k2 yada yatışkın halin %95’ni geçmediği zamandır.(7) Yatışkın halin %80’nine varmak için geçmesi gereken zaman (eşitlik 4)  
ya da eşitlik (5) benzer şekilde yatışkın halin %95’ine varmak için geçmesi gereken zaman. 
eşitlik (6) Örneğin, log Pow= 4 olantest maddesi için alım evresinin zamanı (üst) (eşitlik 1, 5, 6 kullanarak) log10 k2 = -0.414.(4) +1.47 k2= 0.652 gün-1 yada
veya üst (80%) = 1.6 / 0.652 …2.45 gün( 59 saat) üst (95%) = 3.0 / 0.652 …4.60 gün (110 saat) benzer şekilde s= 10-5 mol/l(log(s)=-5.0) olan test maddesi için zaman (üst) (eşitlik 1, 2, 5, 6 kullanarak)  k2 = 0.246 gün-1 üst (80%) = 1.6 / 0.246 …6.5 gün( 156 saat) üst (95%) = 3.0 / 0.246 …12.2 gün (293 saat) alternatif olarak  eşitliği etkin yatışkın hal zamanını bulmak için kullanılabilir.(4)
Vücut yükünü azaltmak yada başlangıç derişiminin belirli bir yüzdesine ulaşmak için geçen süre alım ve atılımı tanımlayan genel kinetik denklemle(birinci derece kinetik) elde edilebilir.(1)(8) Atılım evresi için Cw sıfır kabul edilir. Eşitlik aşağıdakine dönüşebilir:
ya da
 
veya
benzer şekilde %95 atılıma varmak için geçen süre
ile hesaplanır. Eğer %80 alım ilk periyotta kullanılıyorsa (1,6/k2) ve %95 kayıp atılım evresinde gözleniyorsa (3.0/k2), atılım evresi alım evresindeki zamanın iki katıdır.
Ek-IV logpow =4 olan maddelerin biyolojik konsantrasyon testleri için örnekleme şablonunun teorik örneği
Parantez içindeki sayılar eğer ilave balık örneklemesi yapılacaksa gerekli olan sayılardır. Not: log Pow 4.0için k2’nin ön belirlemesi 0.652 gün-1’dir. Deneyin toplam süresi 3xüst örneğin 3x4.6 gün =14 güne ayarlanmıştır. “Üst”ün anlamı için Ek -III’e bakınız. Ek-V MODEL AYIRIMI Pek çok biyolojik konsantrasyon verisi yarı logaritmik kâğıda çizildiğinde atılım evresi için balıktaki konsantrasyonları noktalara yaklaşan doğrusal grafikten anlaşıldığı üzere iki bölmeli/ iki değişkenli model ile oldukça kabul edilebilir varsayılır. (bu noktalar daha karmaşık modeller kullanıldığında doğrusal bir grafik ile ifade edilemez, bakınız Spacie and Hamelink, Ref 1, EK-III) ATILIM HIZ SABİTİ k2 ‘Yİ BELİRLEMEK İÇİN GRAFİKSEL YÖNTEM Her bir balık örneğinde bulunan test maddesi konsantrasyonu örnekleme zamanına karşı yarı logaritmik kağıtta grafiğe geçirilir. Bu doğrunun eğimi k2 ‘dir. Bu grafikten sapmalar birinci derece kinetikten daha karmaşık atılım eğilimine işaret eder. Grafiksel yöntem birinci derece kinetikten sapan atılım modellerini ayırt etmede kullanılır.
Cf değeri derişimin logaritması zamana karşı grafiğe geçirildiğinde düzgün değişen tutunma eğrisinin orta noktasından okunur.(aritmetik ölçekte) ALIM HIZ SABİTİ ve ATILIM (KAYIP) HIZ SABİTİNİN HESAPLANMASINDAKİ BİLGİSAYAR YÖNTEMİ Biyolojik konsantrasyon faktörü ve k1 ve k2 hız sabitlerini elde etmek için tercih edilen yol bilgisayar ile doğrusal olmayan değişken hesabıdır. Bu programlar k1 ve k2 değerlerini dizisel zaman-konsantrasyon verilerine ve Eşitlik 2 
Eşitlik 3  Modeline göre bulur. Burada tc= alım evresi sonundaki zamandır. Bu yaklaşım k1 ve k2’nin standart sapmalarını hesaplamaya da olanak sağlar. k2 pek çok durumda oldukça yüksek kesinlikle atılım eğrisinden hesaplanabilir ve k1 ve k2 aynı anda hesaplandıklarında aralarında güçlü bir bağlılaşım olduğundan önce sadece atılım verilerinden k2’nin hesaplanması sonra da doğrusal olmayan regresyon analizi ile alım verilerinden k1’nin hesaplanması önerilir. C.14 YAVRU BALIK BÜYÜME TESTİ
Bu büyüme toksisite testi OECD TG 215 (2000) yöntemi ile eşdeğerdir.
Bu test yavru balıkların büyümesine, kimyasallara uzun süre maruz kalmalarının etkilerini belirlemek için tasarlanmıştır. Bu test iç akış koşullarında yavru gökkuşağı alabalığının (Oncorynchus mykiss) büyümesine kimyasalların etkisini belirlemek için geliştirilen ve halka-testi (1) (2) yöntemine dayanmaktadır. Diğer iyi belgelenmiş türlerde kullanılabilir. Örneğin, zebra balığı (Danio rerio)1 (3)(4) ve pirinç balığı türlerinin (medaka, Oryzias latipes) (5)(6)(7) büyümesi ile ilgili tecrübeler vardır. Ayrıca bkz Genel giriş bölüm C.
Olumsuz etki gözlemlenen en düşük konsantrasyon (LOEC): Test maddesinin kontrolle karşılaştırıldığında kayda değer bir etki gösterdiği (p<0.05) en düşük test derişimidir. Ancak LOEC’nin üzerindeki bütün test derişimleri LOEC’de gözlemlenene eşit yada daha fazla zararlı etkiye sahip olmalıdır. Etki gözlemlenmeyen konsantrasyon (NOEC): Test maddesinin LOEC değerinin hemen altındaki derişimdir. ECx: Kontrol ile kıyaslandığında balıkların büyüme hızında %x değişime yol açan test maddesinin derişimidir. Yükleme hızı: Suyun hacmi başına düşen ıslak balık ağırlığıdır. Depolama yoğunluğu: Suyun hacmi başına düşen balık sayısı. Tek bir balığın büyüme hızı: Tek bir balığın başlangıç ağırlığına dayanan büyüme hızını tanımlar. Depo ortalamasına özgül büyüme hızı: Belli bir derişimde depo popülasyonundaki ortalama büyüme hızını tanımlar. Yalancı-özgül büyüme hızı: Depo popülasyonundaki ortalama ilk ağırlıklarına kıyasla bir balığın büyüme hızını tanımlar.
Üstel büyüme evresindeki yavru balık tartıldıktan sonra test bölmelerine yerleştirilir ve ölümcül derişimin altındaki derişim aralıklarında suda çözünmüş test maddelerine, tercihen iç-akış modunda eğer mümkün değilse, uygun yarı-durağan koşullarda maruz bırakılır. Test süresi 28 gündür. Balıklar günlük olarak beslenir. Yiyecek payı balığın başlangıçtaki ağırlığına bağlıdır ve 14 gün sonra tekrar hesaplanabilir. Testin sonunda balıklar tekrar tartılır. Büyüme hızında %x değişime, ECx (örneğin EC10, EC20, veya EC30), yol açacak derişimi hesaplamak için büyüme hızına olan etkiler bir regresyon metodu ile analiz edilir. Alternatif olarak, LOEC veya NOEC değerlerini belirlemek için veriler kontrol değerleri ile karşılaştırılabilir.
Bu test için seçilen test türleri ile yürütülen akut toksisite testinin (bakınız Test Yöntemi C.1) sonuçları mevcut olmalıdır. Bu sudaki çözünürlük, buhar basıncının bilinmesini ve test çözeltilerindeki maddenin miktar tayini için güvenilebilir, rapor edilen doğrulukta ve tayin sınırında bir analitik yöntemin var olmasını içerir. Kullanışlı olabilecek bilgiler, yapısal formül, maddenin saflığı, sudaki ve ışıktaki kararlılık, pKa, Pow ve hazır biyolojik bozunma için testin sonuçlarıdır.
Testin geçerli olabilmesi için aşağıdaki koşullar sağlanmalıdır:
Normal laboratuar ekipmanı ve özellikle aşağıdakiler bulunmalıdır:
Test türlerinin uzun süre yaşayabildiği ve büyüyebildiği herhangi bir su test suyu olarak kullanılabilir. Su test boyunca sabit kalitede olmalıdır. Suyun pH değeri 6 ila 8.5 aralığında olmalıdır, ancak verilen bir testte ise ±0.5 pH birimi aralığında olmalıdır. 140 mg/L (CaCO3 olarak) üzerinde sertlik tavsiye edilir. Seyreltme suyunun gereksiz olarak test sonuçlarını etkileyemeyeceğinden (örneğin test maddesi ile kompleksleşerek) emin olmak için aralıklarla analiz için örnek alınmalıdır. Ağır metallerin ( örn, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni ) ve temel anyonların ve katyonların ( Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4 ), pestisitlerin (toplam fosfatlı organik pestisit ve klorlu organik pestisit ), toplam organik karbonun ve asılı katıların tayini suyun kalitesinin bağıl olarak sabit kalitede kaldığı bilinen bir zamanda örneğin 3 ayda yapılmalıdır. Su kalitesinin en azından 1 yıl boyunca sabit kalitede olduğu durumlarda ölçümler daha az sıklıkta ve ölçüm aralıkları (her 6 ayda) uzatılarak yapılabilir. Ek -II de seyreltme suyu için kabul edilebilen kimyasal karakteristikleri listelemektedir.
Test maddesinin seçilen derişimlerdeki çözeltileri stok çözeltisinden seyreltilerek hazırlanır. Stok çözelti test maddesini uygun mekanik araçlarla (karıştırıcı, ultrasonikasyon) seyreltme suyunda basitçe çözüp, çalkalayıp, karıştırarak hazırlanır. Uygun derişik stok çözelti elde etmek için doyurma kolonları (çözünürlük kolonları) kullanılabilir. Çözücülerin ve dağıtıcıların (çözünürleştirici ajanlar) kullanımı bazı durumlarda uygun ve derişik bir stok çözelti hazırlamak için gerekli olabilir. Kullanılabilen çözücüler aseton, etanol, metanol, dimetilsülfoksit, dimetilformamit ve trietilen glikoldür. Kullanılabilen dağıtıcılar Cremephor RH-40, Tween 80, %0.01’lik metilselüloz ve HCO-40’tır. İç akış testinde bakteri üremesine neden olabilecek kolaylıkla bozunabilir (örn. aseton) ajanlar ve/veya çok uçucu bileşikler kullanırken dikkatli olunmalıdır. Çözünürleştirici ajan kullanıldığında, balık büyümesine yada yavru balıklara çözücü kontrolü ile açığa çıkan gözle görülebilir bir olumsuz etkisi olmamalıdır. İç akış testleri için, test bölmelerine test derişimlerini uygulamak için, test maddesinin stok çözeltisini sürekli olarak dağıtan bir sisteme ( ölçüm pompası, oransal seyreltici, doyurucu sistemi) ihtiyaç vardır. Stok çözeltilerinin ve seyreltme suyunun akış hızı test süresince aralıklarla ve tercihen en azından günlük olarak kontrol edilmelidir ve test boyunca 10%’dan fazla değişmemelidir. Yarı-durağan testler için (yenileme testleri), ortam yenilemesinin sıklığı test maddesinin kararlılığına bağlıdır ancak günlük su değişimi önerilir. Eğer ilk kararlılık testlerinden (bkz bölüm1.4), yenileme periyodu süresince test maddesi derişimi kararlı değilse (nominal değerin %80-%120’si yada ölçülen başlangıç derişiminin 80%’sine düşüyorsa), iç akış testi kullanırken dikkat edilmelidir.
Bu testte yavru gökkuşağı alabalığı (Oncorynchus mykiss) halka-testi ile en çok tecrübe bu türden elde edildiği için önerilen türdür (1)(2). Diğer iyi belgelenmiş türlerde kullanılabilir ancak bu durumda test yöntemi uygun test şartlarını sağlamak için bu türler için uyarlanmalıdır. Örneğin, zebra balığı (Danio rerio ) (3)(4) ve pirinç balığı türlerinin (medaka, Oryzias latipes) (5)(6)(7) büyümesi ile ilgili tecrübeler vardır. Bu durumda türlerin seçimindeki sebep ve deneysel yöntem belirtilmelidir.
Test balıkları tek depodan ve tercihen aynı yumurtadan çıkmış ve test şartlarında ve testteki ışıklandırma şartlarında testten önce en az 2 hafta tutulmuş bir popülasyondan seçilir. Balıklar muhafaza periyodunda ve test süresince günlük olarak vücut ağırlıklarının en az 2%’lik ve tercihen 4%’lük payı kadar besinle beslenmelidir. Başlangıç periyodunu takiben, ölümler 48 saat kaydedilir ve aşağıdaki ölçütler uygulanır:
Hasta olan balıklar atılır. Balıklar testten 2 hafta önce yada test esnasında tedavi edilmemiş olmalıdır.
Test tasarımı test derişimlerinin seçim ve aralıklarını ve her derişim seviyesindeki tankların sayısı ve tank başına düşen balık sayısını ilişkilendirilir. İdeal olarak test tasarımı:
Hedef beyanı, eğer mümkünse, belirlenmesi gereken verilen fark büyüklükleri (büyüme hızı) için gerekli olan istatistiksel gücü yada alternatif olarak tahmin edilmesi gereken ECx (x=10, 20, 30 ve tercihen 10’dan az olmayan kesinliğini) belirtmelidir. Bunlar olmadan, çalışmanın kesin büyüklüğü verilemez. Bir istatistiksel yöntem ile optimum kullanım için en iyi (kaynak kullanımının en iyi olması) olan bir tasarımın bir başka yöntem içinde aynı şekilde uygun olmayabileceği bilinmelidir. Dolayısıyla LOEC/NOEC tahmini için önerilen tasarım regresyon ile analiz için önerilen ile aynı olmayabilir. Pek çok halde, Stephan ve Rogers (8) tarafından açıklanan ve tartışılan sebeplerden dolayı regresyon analizi değişiklik (varyans) analizi için tercih edilir. Ancak uygun bir regresyon analizi yoksa (r2 <0.9) NOEC/LOEC kullanılmalıdır.
Regresyon ile analiz edilecek olan bir testte dikkate alınması gerekenler şunlardır.
Her bir derişim için tercihen yedek tanklar bulunmalıdır ve her bir tank seviyesinde (10) istatistiki analiz yapılmalıdır. Bir birinin benzeri tanklar olmadan, tek bir balık dolayısıyla tanklar arasında değişkenlik toleransı yapılamaz. Ancak tecrübeler (11) tanklar arasındaki değişkenliğin, tank içi değişkenlikle( balıklar arası) karşılaştırıldığında değişkenliğin çok küçük olduğunu göstermiştir. Bu yüzden oldukça kabul edilebilir bir alternatif tek bir balıkta istatistiksel analiz yürütmektir. Geleneksel olarak, 3.2 faktörünü geçmeyen bir geometrik seri oluşturan en azından beş test derişimi kullanılır. Genel olarak, testler bir birine benzer tanklar ile yürütülür, bir birine benzer kontrol tanklarının sayısı ve dolayısıyla balıkların sayısı bir birine eşit büyüklükteki her bir test derişimindeki sayısının iki katı olmalıdır(12)(13)(14). Karşıt olarak, bir birine benzer tankların yokluğunda, kontrol grubundaki balıkların sayısı her bir test derişimindeki sayıyla aynı olmalıdır. Eğer ANOVA tek bir balık yerine tanklara dayanıyorsa (yalancı özel büyüme hızı testlerinin kullanımını veya (bakınız bölüm 2.1.2) balıkların tek tek işaretlenmesini gerektirebilir), tankların derişim standart sapmasını belirlemek için yeterince bir birine benzer tanka ihtiyaç olabilir. Bunun anlamı varyans analizindeki hata için serbestlik derecelerinin en azından 5 olması gerekir (10). Eğer sadece kontroller tekrarlanırsa, hata değişkenliğinin sapma tehlikesi olacaktır. Çünkü söz konusu olan araştırılan büyüme hızının ortalama değeri ile artabilir. Büyüme hızı artan derişimle muhtemel azalma eğiliminde olduğu için, bu değişkenliğin hesabında abartıya neden olabilir.
Testin başlangıcında balıkların ağırlığındaki değişimi en aza indirmek önemlidir. Kullanım için önerilen farklı türlerin uygun büyüklük aralıkları EK- I’de verilmiştir. Bu testte kullanılan bütün seri balıklar için, testin başlangıcındaki tek bir balık ağırlığının aralığı ortalama aritmetik ağırlığın ±10’unda tutulmalı, ve her durumda, %25’i geçmemelidir. Ortalama ağırlığı hesaplamak için testten önce bir balık örneğini tartmak önerilir. Testin başlangıcından 24 saat önce stok balık popülasyonuna yiyecek verilmesi kesilmelidir. Balıklar daha sonra rasgele seçilmelidir. Genel bir anestezik kullanarak (örneğin MS 222’nin parçası başına iki parça sodyum bikarbonat eklenerek nötralize edilen 100 mg/L sulu trikain metan sülfonat çözeltisi (MS222)), EK-I’de verilen kesinlikte ıslak ağırlıkları (kurutma kağıdı ile kurulanmış) ile tek tek tartılmalıdır. İstenen ağırlık aralığındaki balıklar saklanmalı ve saha sonra test kaplarına gelişigüzel dağıtılmalıdır. Her test kabındaki balığın toplam ağırlığı kaydedilmelidir. Anestezik kullanımı balık elleçlenmesinde (tartılması ve kurutma kağıdı ile kurulanması dahil) olduğu gibi yavru balıklarda,özellikle küçük olanlarda, stres ve yaralanmalara yol açabilir. Bu yüzden yavru balık elleçlenmesi stres ve yaralanmadan kaçınmak için mümkün olduğu kadar dikkatle yapılmalıdır. Balıklar testin 28. gününde tekrar tartılır.( bakınız bölüm 1.8.6) Eğer besin oranının tekrar hesabı gerekli olursa, balıklar testin 14. gününde tekrar tartılabilir (bakınız bölüm 1.8.2.3). Fotografik yöntem gibi diğer yöntemlerle yem payları ayarlanarak ve balıkların boyutundaki değişimi belirlemek için kullanılabilir.
Testin süresi ≥28 gündür.
Yükleme hızı ve depolama yoğunluğunun kullanılan türler için uygun olması önemlidir( bakınız EK-I). Eğer depolama yoğunluğu çok fazla ise, aşırı kalabalık olmasından dolayı stres düşük büyüme hızlarına ve hastalığa yola açar. Eğer çok düşükse, büyümeyi etkileyecek bölgesel davranış gözlenir. Her iki durumda da yükleme hızı, ASV’nin %60’ı oranında çözünmüş oksijen derişiminin havalandırma olmadan sağlanabileceği kadar olmalıdır. Halka testi (2) gökkuşağı alabalığı için, 3-5 g ağırlığında 16 balığın 40 litre hacme doldurulduğu nispette bir yükleme hızının uygun olduğunu göstermiştir. Test boyunca önerilen su uzaklaştırma sıklığı 6 litre/balık/gündür.
Balıklar kabul edilebilir bir besleme hızı oluşturabilecek bir hızda uygun bir besinle beslenmelidir.(Ek-I). Mikrobiyal büyüme ve su bulanıklığından kaçınmak amacıyla dikkatli olunmalıdır. Gökkuşağı alabalıkları için günlük olarak toplam vücut ağırlıklarının % 4’ü kadar bir besleme hızı bu koşulları sağlar.(2)(15)(16)(17). Günlük oran eşit olarak ikiye bölünebilir ve gün içinde aralarında 5 saat olan iki ayrı öğün olmak üzere verilebilir. Yiyecek payı her bir kaptaki ilk toplam balık ağırlığına dayanır. Eğer balıklar 14. günde tekrar tartılırsa, yiyecek payı tekrar hesaplanır. Balıklar tartımdan 24 saat önce yemlenmemelidir. Yenilmeyen besin ve posa test kaplarının dibi vakumlanarak dikkatlice temizlenmelidir.
Işıklandırma süresi ve su sıcaklığı test türleri için uygun olmalıdır.(Ek-I)
Test tasarımı ne olursa olsun normal olarak 5 farklı test derişimi gereklidir. (bkz bölüm 1.7.2) Test maddesinin toksisitesi hakkında bilgi sahibi olmak (akut test ve aralık bulma çalışmalarından) uygun derişimleri belirlemekte yardımcı olabilir. Eğer 5 den az sayıda derişim kullanılacaksa gerekçeler onaylanmalıdır. En yüksek derişim maddenin sudaki çözünürlük sınırını geçmemelidir. Stok çözelti hazırlamak için bir çözünürleştirici ajan kullanıldığında, son derişim; 0.1 ml/L’den büyük olmamalıdır ve tercihen bütün test kaplarında aynı olmalıdır. (bkz bölüm 1.6.3). Ancak bu tür maddelerin kullanımından mümkün olduğunca kaçınılmalıdır.
Seyrelme suyu kontrollerinin sayısı test tasarımına bağlıdır (bakınız bölüm 1.7-1.7.2). Eğer çözünürleştirici ajan kullanılmışsa, çözünürleştirici ajan içeren sayıda kontrol seyrelme suyu kontrollerine paralel olarak yürütülmelidir.
Test maddesinin derişimleri test boyunca düzgün aralıklarla ölçülür( aşağıya bakınız). İç akış testlerinde, seyrelme çözeltisi ve toksin stok çözeltilerinin akış hızları aralıklar ile kontrol edilmelidir ve test boyunca %10 dan fazla değişiklik gözlenmemelidir. Test maddelerinden derişimleri nominal değerlerinin ±%20’si içinde olduğu durumlarda, en az olarak, (%80-%120 aralığında, bkz bölüm1.6.2 ve1.6.3) en düşük ve en yüksek derişimlerin testin başında daha sonra haftalık periyotlarda ölçülmesi önerilir. Test maddesinin derişiminin nominal değerin ±%20’si içinde kalmadığı durumlarda (test maddesinin kararlılığı baz alınarak), bütün derişimleri aynı şartlarda analiz etmek gereklidir. Test maddelerinin derişimlerinin nominal değerlerin ±%20’si içinde olmasının beklendiği yarı-durağan testlerde, en az olarak, en düşük ve en yüksek derişimlerin hazırlandıktan sonra ve çalışmanın başında yenilemeden hemen önce taze olarak ve daha sonra haftalık olarak ölçülmesi önerilir. Test maddesinin derişiminin nominal değerin ±%20’si içinde kalmadığı durumlarda (test maddesinin kararlılığı baz alınarak), daha kararlı maddelerin bütün derişimleri aynı şartlarda analiz etmek gereklidir. Sonuçların ölçülen derişimlere dayanması önerilir. Ancak test çözeltisindeki maddenin derişiminin nominal değerin ±%20’si yada test boyunca ölçülen başlangıç derişiminde kaldığına ilişkin kanıt varsa, sonuçlar nominal yada ölçülen değerlere dayandırılabilir. Örneklerin filtrelenmesi (0.45 mikron gözenekli filtre ile) yada santrifüj edilmesi gerekebilir. Santrifüjleme tavsiye edilen işlemdir. Eğer test malzemesi filtrelere adsorplanmıyorsa filtreleme de tercih edilebilir. Test boyunca çözünmüş oksijen, pH ve sıcaklık bütün test kaplarında ölçülmelidir. Toplam sertlik, bazlık ve tuzluluk kontrolde ve en yüksek derişime sahip tankta ölçülmelidir. Çözünmüş oksijen ve tuzluluk (eğer gerekli ise) en az 3 kez ölçülmelidir. (Testin başında ortasında ve sonunda). Yarı durağan testlerde, çözünmüş oksijenin daha sık, tercihen en azından haftada bir kez suyun yenilenmesinden sonra ölçülmesi tercih edilir. İç-akış testlerinde pH, başlangıçta ve durağan yenileme testinde her su yenilemesinin sonunda ölçülmelidir. Sıcaklık en azından bir test kabında tercihen sürekli olarak kontrol edilmelidir.
Ağırlık: Yaşayan balıklar testin sonunda ıslak ağırlık (kurulama kağıdı ile kurutulmuş) cinsinden ya tek tek yada gruplar halinde ölçülmelidir. Balıkların işaretlenmesini gerektiren tek tek tartıma göre toplu halde tartılmaları tercih edilir. Tek bir balığın özgül büyüme hızının belirlenmesi için tek tek balıkların tartılmasında, hayvanların stres altına girmemelerini sağlayacak bir işaretleme tekniği seçilir. (alternatif olarak dondurup işaretleme ve renkli bir işaretleme şeridi kullanmaktır) Balıklar test periyodunda günlük olarak incelenmeli ve herhangi bir dış anomali (kanama, renk yitimi) ve anormal davranış not edilmelidir. Ölümler kaydedilmeli ve ölü balıklar mümkün olduğu kadar çabuk uzaklaştırılmalıdır. Yükleme hızı ve depolama yoğunluğu tanktaki balıkların büyüme hızına etki edecek ölçüde ise ölü balıkların yerine yenisi konulmaz. Ancak yemleme hızı ayarlanmalıdır.
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
