FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- C.23 TOPRAK İÇİNDE AEROBİK VE ANAEROBİK DÖNÜŞÜM YÖNTEM
- Test maddesi
- Aerobik dönüşüm
- Mineralleşme
- Yarı Ömür
VERİLER
Tarımsal kimyasalların testi söz konusuysa; açığa çıkan karbondioksit miktarı veya harcanan oksijen miktarı her toprak örneği için ayrı ayrı hesaplanmalı ve ortalama değeri bulunarak tablo hazırlanmalıdır. Sonuçlar uygun ve genel olarak kabul edilen istatistiksel yöntemlerle değerlendirilmelidir (örneğin F-testi, %5 değer seviyesinde).glikoz varlığında teneffüs hızı mg karbon dioksit/kg kuru toprak ağırlığı/saat veya mg oksijen/kg toprak ağırlığı/saat şeklinde ifade edilir. Her işlemde açığa çıkan karbondioksit miktarı veya harcanan oksijen oranı teste tabi tutulmayan toprak örneğiyle (kontrol ile) kıyaslanır ve kontrolden yüzde sapma hesaplanır. Eğer test tarımsal kimyasallar dışındaki kimyasallar için yapılıyorsa, her tekrar vasıtasıyla açığa çıkan karbondioksit miktarı veya harcanan oksijen miktarı belirlenir ECx değerlerinin hesaplanması için doz-cevap eğrisi çizilir. 28. günün sonunda işlemden geçmiş örneklerden bulunan glikoz varlığında teneffüs hızları (örneğin mg karbon dioksit/kg kuru toprak ağırlığı/saat veya mg oksijen/kg toprak ağırlığı/saat olarak) ile teste tabi tutulmayan toprak örneği (kontrol) kıyaslanır. Bu veriler doğrultusunda her test konsantrasyonu için % engelleme değerleri hesaplanır. İstatistiksel prosedürler kullanılarak bu yüzdelere karşı derişim grafiğinden ECx değerlerine ulaşılır. Aynı zamanda hesaplanmış ECx için standart prosedürler kullanılarak güven aralıklarıda belirlenir (15)(16)(17).
Tarımsal kimyasalların test sonuçları değerlendirildiğinde daha düşük muamele (örneğin maksimum tahmin edilen konsantrasyon) ile kontrol teneffüs oranları arasındaki fark 28 gün sonundaki herhangi bir örnekleme zamanında birbirine eşit veya %25 ten az ise ürün toprakta uzun vadede karbon dönüşümüne etkisi olmayan bir ürün olarak değerlendirilir. Tarımsal kimyasallar dışındaki kimyasalların kullanımından elde edilen sonuçların değerlendirilmesinde EC50 EC25 ve /veya EC10 değerleri kullanılır.
Test raporu Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir. Kullanılan toprağın eksiksiz tanımıyla birlikte aşağıdakileri içerir,
Test maddesi:
Test koşulları:
Sonuçlar :
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994. (2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). (3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987. (4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels. (5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy,18-20 January 1995. (6) TS ISO 10381-6 Toprak Kalitesi-Numune Alma Bölüm 6-Toprakların Aerobik Mikrobiyal Faaliyetlerinin Laboratuvar Şartlarında Değerlendirilmesi İçin Numune Alma, Taşıma ve Muhafaza Kuralları (7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflora”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60. (8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in "Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties". Agronomy Monograph N° 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871. (9) TS ISO 11266-1. Toprak Kalitesi-Aerobik Şartlar Altındaki Toprakta Organik Kimyasal Maddelerin Biyolojik Parçalanabilirliği ile İlgili Laboratuvar Deneyleri Kılavuzu (10) TS ISO 14239 Toprak Kalitesi- Toprakta Aerobit Şartlarda Organik Kimyasal Maddelerin Parçalanmasının Ölçülmesi İçin Lâboratuvar Kuluçka Sistemleri (11) Heinemeye,r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81. (12) TS ISO 14240-1 Toprak Kalitesi- Toprak Mikrobiyal Biyokütlesi Tayini- Bölüm 1: Substratla Hızladırılmış Solunum Metodu (13) TS ISO 14240-2 Toprak Kalitesi- Toprak Mikrobiyal Biyokütlesi Tayini- Tütsüleme Özütleme Metodu (14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120. (15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113. (16) Finney,D.J. (1971). Probit Analysis.3rd ed., Cambridge,London and New-York. (17) Finney D.J. (1978).Statistical Methods in biological Assay.Griffin,Weycombe, UK. C.23 TOPRAK İÇİNDE AEROBİK VE ANAEROBİK DÖNÜŞÜM
Bu yöntem OECD TG 307 (2002) ile eşdeğerdir.
Bu yöntemde var olan yönergeler (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9) temel alınmıştır. Bu test yönteminde bahsedilen yöntem, topraktaki kimyasalların aerobik ve aerobik olmayan dönüşümlerini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Deneyler (i) test maddesinin dönüşüm oranını (ii) bitki ve toprak organizmalarının maruz kalabileceği oluşumların tabiatını, oranlarını ve dönüşüm ürünlerindeki azalmayı, belirlemek için yapılır. Toprağa doğrudan uygulanan ve toprak ortamına ulaşma eğilimdeki kimyasallar için bu tür çalışmalar gereklidir. Bu tür laboratuar çalışmalarının sonuçları, ilgili alan çalışmaları için örnekleme ve analiz protokollerinin geliştirilmesi içinde kullanılabilir. Dönüşüm yollarının (8)(10)(11) değerlendirilmesi için bir toprak tipiyle yapılan aerobik ve aerobik olmayan çalışmalar genel olarak yeterlidir. Dönüşüm oranı (8)(10) ek olarak en az üç toprak örneğiyle belirlenmelidir. 1995 yılında İtalyanın Belgirate şehrinde yapılan Toprak/Tortu seçimi ile ilgili bir OECD uygulamalı seminerinde (10), bu testte kullanılan toprağın bilhassa tipi ve sayısı üzerinde mutabakata varılmıştır. Test edilen toprak tipi kullanımın veya salınımın olacağı yerdeki çevresel koşulları temsil etmelidir. Örneğin, astropikal’ den tropikala kadar olan iklimlerde salınabilecek kimyasallar, Ferrasoller veya Nitosoller (FAO sistemi) ile test edilmelidir. Bu uygulamalı seminer ayrıca, ISO yönergesini (15) temel alarak, toprak örneklerinin toplanması, kullanımı ve depolanması ile ilgili tavsiyelerde de bulunmuştur. Çeltik tarlası (pirinç) topraklarının kullanımı da bu yöntemde dikkate alınmıştır.
Test maddesi: Ana madde veya ana maddenin dönüşümü sonucu açığa çıkacak herhangi bir madde. Dönüşüm ürünleri: CO2 ve bağlı kalıntıları da içeren test maddesinin biyotik ve abiyotik dönüşüm reaksiyonlarından elde edilen tüm maddeler. Bağlı kalıntılar: “Bağlı kalıntılar” ekstraksiyon sonrası toprak, bitki veya hayvanda, ana madde ve metabolit şeklinde matriks içinde kalmakta ısrar eden maddeleri temsil eder. Ekstraksiyon metodu bileşikleri ve matriksin yapısını büyük ölçüde değiştirmemelidir. Bağın doğası matriks-değişim ekstraksiyonu ve gelişmiş analitik metotlar ile aydınlatılabilir. Bugüne kadar, örneğin, kovalent, iyonik ve tutucu bağlar gibi bağlanma şekilleri bu yolla tanımlanmıştır. Genel olarak, bağlı artıkların oluşumu biyolojik erişilirliği ve biyolojik kullanılabilirliği belirgin bir biçimde azaltır (12) [IUPAC 1984 (13) ‘den değiştirilerek] . Aerobik dönüşüm: Moleküler oksijen varlığında gerçekleşen reaksiyonlar (14). Anaerobik dönüşüm: Moleküler oksijen olmadan gerçekleşen reaksiyonlar (14). Toprak: Mineral ve organik kimyasal bileşenlerin bir karışımı, ve son olarak yüksek karbon ve azot içerikli ve yüksek molekül kütlesine sahip bileşikler içeren, küçük organizmalar (çoğunlukla mikro) tarafından canlılık katılmış bir karışımdır. Toprak, testlerde iki halde kullanılabilir:
Mineralleşme: Aerobik koşullarda bir organik bileşiğin tamamen CO2 ve H2O’ ya ve aerobik olmayan koşullarda tamamen CH4, CO2 ve H2O’ ya bozunmasıdır. Bu test metodunun içeriğinde, 14C-işaretlenmiş bileşik kullanıldığında, mineralleşme, uygun miktarda 14CO2 salınımı ile işaretlenmiş karbon atomu yükseltgenirken, molekülün büyük oranda bozunması anlamına gelir (14). Yarı Ömür: t0,5, dönüşüm, birinci dereceden kinetik ile tanımlandığında (konsantrasyondan bağımsız), test maddesinin %50 dönüşümü için geçen zamandır. DT50 (Kaybolma zamanı 50): Test maddesinin ilk derişiminin %50 oranında azaltılması içinde geçen zamandır. Dönüşüm birinci dereceden kinetik üzerinden yürümüyorsa, yarı ömür t0,5 ’den farklıdır. DT75 (Kaybolma zamanı 75): Test maddesinin ilk derişiminin %75 oranında azaltılması içinde geçen zamandır. DT90 (Kaybolma zamanı 90): Test maddesinin ilk derişiminin %90 oranında azaltılması içinde geçen zamandır.
Referans maddeleri dönüşüm ürünlerinin spektroskopik ve kromatografik olarak belirlenmesi ve/veya tanımlanması için kullanılmalıdır.
Yöntem genelde yeterli doğruluk ve hassasiyete sahip analitik metotların varlığında kimyasal maddelere (işaretlenmemiş veya radyoaktif olarak işaretlenmiş) uygulanabilir. Az miktarda uçucu, uçucu olmayan, suda çözünebilir veya suda çözünmeyen bileşikler içinde uygulanabilir. Bu test şartlarında toprakta tutulamayan, çok uçucu kimyasallar (dezenfektant, organik çözücü, vb.) için bu test uygulanmamalıdır.
İşaretlenmemiş veya işaretlenmiş test maddesi, dönüşüm oranını ölçmek için kullanılabilir. İşaretlenmiş madde kullanımı, dönüşümün yollarını belirlemek ve kütle denkliği kurabilmek için gereklidir. 14C ile işaretleme tavsiye edilir, fakat 13C, 15N, 3H, 32P gibi diğer izotopların kullanımı da faydalı olabilir. İşaretleme, mümkün oldukça molekülün1 en kararlı kısmına veya kısımlarına yerleştirilmelidir1. Test maddesinin saflığı en az %95 olmalıdır. Topraktaki aerobik ve anaerobik dönüşüm ile ilgili bir test gerçekleştirmeden önce, Test maddesi ile ilgili aşağıdaki bilgiler mevcut olmalıdır:
Diğer faydalı bilgiler test maddesinin toprak içindeki mikro organizmalar üzerindeki toksisitesi hakkında verileri içerebilir [Test yöntemleri C.21 ve C.22] (16). Test maddesinin ve dönüşüm ürünlerinin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için analitik metotlar (ekstraksiyon ve temizleme metotlarını içeren) mevcut olmalıdır.
Toprak örnekleri, kontrollü laboratuar koşulları altında (sabit sıcaklıkta ve toprak neminde), karanlıkta biyometre-tip kaplar içinde veya akış yollu sistemlerde, test maddesi ile muamele edilir ve inkübasyon yapılır. Uygun zaman aralıklarından sonra, toprak örnekleri ana madde ve dönüşüm ürünleri için analiz edilir. Uçucu ürünler de uygun soğurma cihazları ile analiz için toplanır. 14C ile işaretlenmiş madde kullanarak, test maddesinin çeşitli mineralleşme oranları, açığa çıkan 14CO2 tuzaklanarak ölçülebilir ve bir kütle dengesi, toprağa bağlı kalıntıları içerecek şekilde kurulabilir.
En az bir çift toprak örneğine test maddesinin hemen katılmasından sonra yapılan ekstraksiyon ve analiz, analitik yöntemin tekrarlanabilirliğinin ilk belirtisini ve test maddesi için uygulama işleminin aynılığını gösterir. Deneyin daha sonraki bölümleri için geri kazanım ilgili kütle denkliği ile verilir. Geri kazanımlar, işaretlenmiş kimyasallar için %90 ile %110 aralığında (8), işaretlenmemiş kimyasallar için %70 ile %110 arasında olmalıdır (3).
Test maddesinin ve dönüşüm ürünlerinin miktarını belirlemek için kullanılan analitik yöntemin tekrarlanabilirliği (ilk ekstraksiyon verimliliğini hariç tutarak) dönüşüm ürünlerinin oluşumu için yeterince uzun inkübasyon yapılmış aynı toprak ekstrakt örneğinin ikinci kez analizi ile kontrol edilebilir. Test maddesi ve dönüşüm ürünleri için analitik yöntemin tayin sınırı (Limit of Detection, LOD) 0,01 mg.kg-1 toprak (test numunesi) veya test sistemine daha düşük miktarda uygulanan ilk miktarın en az % 1’ i kadar olmalıdır. Ek olarak, miktar belirleme limiti (Limit of Quantification, LOQ)’ de belirtilmelidir.
Test maddesi derişimine, zamanın bir fonksiyonu olarak uygulanan regresyon analizi, dönüşüm eğrisinin doğruluğu üzerinde uygun bilgiler verir ve yarı ömürler (eğer sahte (pseudo) birinci-dereceden kinetik uygulanırsa) veya DT50 değerleri ve eğer uygunsa, DT75 ve DT90 değerleri için güvenlik aralığı hesaplamasına imkan verir.
Inkübasyon sistemleri statik kapalı veya uygun akış yollu sistemlerden oluşur (7)(17). Uygun akış yollu toprak inkübasyon aygıtı ve biyometre-tip kap sırasıyla Ek-III Şekil 1 ve 2’ de gösterilmiştir. Her iki inkübasyon sistemininde bazı avantajları ve sınırlandırmaları vardır (7)(17). Özellikle gerekli olan laboratuar donanımı aşağıdaki gibidir:
Kullanılan kimyasallara örnek olarak:
Toprağa ekleme ve karıştırma için test maddesi su (iyonu giderilmiş veya damıtılmış) içinde veya gerektiğinde, test maddesinin yeterli derecede çözünmesi ve kararlı olarak kalması için minimum miktarda aseton veya diğer organik çözücüler (6) içinde çözülebilir. Ama, seçilen çözücü miktarının, toprağın mikrobiyal aktivitesi üzerinde belirgin bir etkisi olmamalıdır (Bakınız bölüm 1.5 ve 1.9.2-1.9.3). Mikrobiyal aktiviteyi azaltan kloroform, diklorometan ve diğer halojen içeren çözücülerin kullanımından kaçınılmalıdır. Test maddesi, örneğin kuartz kum (6) içinde veya küçük örnek gurupları halindeki hava ile kurutulmuş ve sterilize edilmiş test toprağı içinde karıştırılarak katı olarak da eklenebilir. Eğer test maddesi çözücü kullanılarak eklenirse, steril olmayan orijinal toprak örneğine çözücü içeren bu küçük örnek eklenmeden önce, çözücünün uçmasına izin verilmelidir.
Formülasyon ürünlerinin kullanımı rutin olarak tavsiye edilmez. Fakat örneğin az çözünür test maddeleri için, formülasyon maddelerin kullanımı uygun bir alternatif olabilir.
Dönüşüm yolunu belirlemek için, alındığı bölgeyi temsil eden bir toprak kullanılabilir; pH’ sı 5,5-8,0, organik karbon içeriği %0,5-2,5 ve mikrobiyal biyolojik kütlesi toplam organik içeriğinin en az %1’ i olan, kumlu kil, tortulu kil, kil veya killi toprak [FAO ve USDA sınıflandırmasına göre (18)] olması önerilir (10). Dönüşüm oranı çalışmaları için ilgili toprağı temsil eden en az üç ek toprak örneği kullanılmalıdır. Topraklar organik karbon içeriklerine, pH’ a, kil içeriğine ve mikrobiyal biyolojik kütleye göre çeşitlilik gösterebilir (10).
Test toprağının toplandığı bölge tarihi hakkında detaylı bilgi mevcut olmalıdır. Detaylar kesin yer, bitki örtüsü, kimyasallarla muamele, organik ve inorganik gübrelerle muamele, eklenmiş biyolojik maddeler ve diğer kirleticiler, gibi bilgileri içermelidir. Eğer topraklar önceki dört yıl içinde, test maddesi veya yapısal olarak benzerleriyle muamele edilmişse, bunlar dönüşüm çalışmaları için kullanılmamalıdır (10(15). Toprak bölgeden, elemeyi kolaylaştıran toprak suyuyla beraber taze iken toplanmalıdır. Çeltik tarlaları dışında kalan toprak örnekleri için, uzun süreli (>30 gün) kuraklık, donma veya sel sonrasında hemen veya bu gibi durumlar esnasında örnekleme yapmaktan kaçınılmalıdır (14). Örnekler, toprak suyu içeriğinde minimum değişiklik olacak şekilde ve mümkün olduğunca serbest hava girişine izin verecek şekilde karanlıkta taşınmalıdır. Bu amaç için gevşekçe bağlanmış polietilen bir torba genel olarak yeterlidir.
Kışın, bölgede örnekleme yapmak zor olduğunda (toprak donmuş veya kar tabakası ile kaplı olduğunda), sera içinde bitki altından bir toprak yığını alınabilir (örneğin, çim veya çim-yonca karışımı). Bölgeden taze olarak toplanmış toprak ile yapılan çalışmalar şiddetle tercih edilir, fakat toplanan ve işlenen toprağın, çalışmanın başlangıcından önce depolanması gerekiyorsa, depolama koşulları, mikrobiyal aktiviteyi1 koruyacak şekilde yeterli ve sınırlı bir zaman süresinde (maksimum üç ay için 4±2 °C) olmalıdır. Biyolojik dönüşüm deneylerinde kullanılacak olan toprağın toplanması, işlenmesi ve depolanması hakkında detaylı açıklamalar (8)(10)(15)(26)(27) içinde bulunabilir. Test için işlenmiş toprağı kullanmadan önce, filizlenmeye, tohumların ayrılmasına ve örnekleme veya depolama koşullarıyla inkübasyon koşulları arasındaki işlemlerden kaynaklanan değişikliği takiben mikrobiyal metobolizma dengesinin yeniden kurulmasına olanak verecek şekilde, ön-inkübasyon yapılmalıdır. Gerçek testin sıcaklık ve nem koşullarında 2 ile 28 gün arası bir ön inkübasyon periyodu, genellikle yeterlidir.Depolama ve ön inkübasyon sürelerinin toplamı 3 ayı geçmemelidir.
Tüm test periyodu esnasında, test toprağı, kullanımın ve salınımın gerçekleştiği iklim koşullarını temsil edecek şekilde sabit sıcaklıkta ve karanlıkta inkübasyon yapılmalıdır. İklim sıcaklığında toprağa ulaşabilecek tüm test maddeleri için 20±2 °C’ lik bir sıcaklık önerilir. Sıcaklık izlenmelidir. Daha soğuk iklimlerde (örneğin, kuzey ülkelerinde, güz/kış periyotları esnasında) uygulanan veya salınan kimyasallar için, ek toprak örnekleri düşük sıcaklıkta (örneğin, 10±2 °C’ de) inkübasyon yapılmalıdır.
Aerobik olmayan şartlar altındaki dönüşüm testleri için, toprak nem içeriği2 pF 2,0 ve 2,5 olarak ayarlanmalı ve korunmalıdır (3). Toprak nem içeriği kuru toprak kütlesi başına su kütlesi olarak ifade edilir ve inkübasyon kapları düzenli olarak (örneğin, 2 haftalık aralıklar içinde) tartılarak kontrol edilir ayrıca su kaybı su eklenerek telafi edilir (tercihen steril-filtrelenmiş çeşme suyu ile). Nem ekleme esnasında, buharlaşma ve/veya ışınla bozunma (eğer varsa) ile test maddesi ve dönüşüm ürünleri kaybını önlemek veya en aza indirgemek için ihtimam gösterilmelidir. Aerobik olmayan ve çeltik tarlası gibi koşullar altında dönüşüm testlerinde toprak su baskını ile suyla doyurulur.
Akış yollu sistemlerde, aerobik koşullar, kesintili yıkama veya nemlendirilmiş hava ile sürekli havalandırarak sağlanacaktır. Biyometre kaplarında, hava değişimi difüzon vasıtasıyla sağlanır.
Bir test maddesinin Abiyotik dönüşümünün belirginliği ile ilgili bilgi elde etmek için, test toprak örnekleri bölüm 1.9.1.3’ te açıklandığı gibi steril hale getirilebilir, (sterilizasyon yöntemleriları, bakınız kaynaklar 16 ve 29) steril test maddesi ile muamele edilebilir (steril filtreden çözeltinin eklenmesi gibi…)ve nemlendirilmiş steril hava ile havalandırılabilir. Çeltik tarlası toprakları için, toprak ve su, bölüm 1.9.1.6’ da açıklandığı gibi steril hale getirilebilir ve inkübasyon yürütülebilir.
Aerobik olmayan koşulları oluşturmak ve korumak için, toprak test maddesi ile muamele edilir ve aerobik koşullar altında 30 gün boyunca inkübasyon yapılır veya bir yarı-ömür veya DT50 (hangisi kısa ise) daha sonra su ile doyurulur (1-3 cm su tabakası) ve inkübasyon sistemi reaktif olamayan bir gaz (örneğin, azot veya argon)1 ile temizlenir. Test sistemi, pH, oksijen derişimi ve redoks potansiyeli gibi ölçümlere izin vermeli ve uçucu ürünler için tuzaklama aygıtları içermelidir. Biyometre-tip sistem difüzyon ile hava girişini engellemek için kapatılmalıdır.
Çeltik tarlası topraklarındaki dönüşümü çalışmak için, toprak 1-5 cm’ lik su tabakası ile kaplanır ve test maddesi su fazına uygulanır (9). En az 5 cm’ lik toprak derinliği önerilir.. Sistem aerobik koşullarda olduğu gibi hava ile havalandırılır. Sulu tabakanın pH’ sı, oksijen derişimi ve redoks potansiyeli izlenmeli ve rapor edilmelidir. Dönüşüm çalışmalarına (Bakınız bölüm 1.8.3.2) başlamadan önce en az 2 haftalık ön inkübasyon periyodu gereklidir.
Oran ve seyir tarzı çalışmaları normal olarak 120 günü2 geçmemelidir (3)(6)(8), çünkü daha sonra doğal ikmal yollarında izole edilmiş yapay bir laboratuar sisteminde toprak mikrobiyal aktivitesi üzerinde bir düşme umulabilir. Test maddesindeki azalmanın ve ana dönüşüm ürünlerindeki oluşumun ve azalmanın karakterizasyonu gerekli olduğunda, çalışmalar daha uzun periyotlar halinde devam ettirilebilir (örneğin 6 veya 12 ay)(8). Daha uzun inkübasyon periyotlarının haklı gerekçeleri, periyotlar esnasında ve test sonundaki biyokütle ölçümleriyle beraber test raporunda belirtilmelidir.
Yaklaşık 50 ile 200 g toprak (kuru ağırlık bazında) her inkübasyon kabına yerleştirilir (Bakınız Ek-III içindeki Şekil 1 ve2) ve toprak, bölüm 1.8.2’ de bahsedilen yöntemlerden biri vasıtasıyla test maddesi ile muamele edilir. Test maddesinin uygulanması için organik çözücüler kullanıldığında, bunlar topraktan uçurularak ayrılmalıdır. Daha sonra toprak, bir spatül ile ve/veya kabın çalkalanmasıyla tamamen karıştırılır. Eğer çalışma çeltik tarlası koşulları altında yürütülüyorsa, toprak ve su test maddesi uygulandıktan sonra tamamen karıştırılmalıdır. Muamele edilmiş toprakların küçük miktarları, düzenli dağılımı kontrol etmek için test maddesi açısından analiz edilmelidir. Alternatif yöntem için aşağıya bakınız. Muamele oranı, kullanılan talimatlarda gerekli görülen ve bölgedeki uygun derinliğe düzgün olarak dağıtılacak şekilde (örneğin, 10 cm’ lik toprak tabakası1 üstüne) ve mahsul koruma ürünlerindeki en yüksek uygulama oranlarına uygun olmalıdır. Örnek olarak, kimyasallar veya kimyasalla birleştirilmeksizin uygulanan toprakta, her kaba eklenmesi gereken kimyasalın hesaplanması için uygun derinlik, 2,5 cm’ dir. Kimyasallarla birleştirilmiş topraklar için uygun derinlik, kullanılan talimatlarda belirtilen birleştirme derinliğine uygun olan derinliktir. Genel kimyasallar için uygulama oranı toprağa giriş şekline en uygun yol temel alınarak hesaplanabilir; örneğin, en önemli toprağa giriş yolunun lağım çamuru olduğu durumda, çamur içine, beklenen çamur derişimini yansıtacak şekilde, kimyasal dozu eklenmelidir ve toprağa eklenen çamur miktarı, tarımsal topraklara eklenen normal çamur yükleme miktarını yansıtacak şekilde olmalıdır. Eğer bu derişim ana dönüşüm ürünlerini tanımlamak için yeterli değilse, daha yüksek oranlar içiren ayrı toprak örneklerinin inkübasyonu yardımcı olabilir, fakat toprağın mikrobiyal aktivitesini etkileyen yüksek oranlardan kaçınılmalıdır (Bakınız bölüm 1.5 ve 1.8.2). Alternatif olarak, daha toprağın daha geniş deney grupları test maddesi ile muamele edilebilir, uygun karıştırma makinesinde dikkatlice karıştırılır ve daha sonra 50’ den 200’ e kadarlık küçük bölümler halinde inkübasyon kaplarına transfer edilir (örneğin, örnek ayırıcılar kullanarak). Muamele edilmiş toprak gruplarının küçük miktarları, test maddesi açısından düzenli dağılımı kontrol etmek için analiz edilmelidir. Bu gibi bir prosedürün tercih edilmesinin sebebi, test maddesinin toprağın içinde düzenli bir şekilde dağılmasına imkan vermesidir. Ek olarak muamele edilmemiş toprak örnekleri, örneklerde olduğu gibi aynı koşullar (aerobik) altında test maddesi ile inkübasyon yapılır. Bu örnekler test esnasında ve sonunda biyolojik kütle ölçümü için kullanılır. Toprağa uygulanan test maddesi organik bir çözücü veya çözücüler içinde çözüldüğü zaman, aynı miktardaki çözücü veya çözücülerle muamele edilmiş toprak örnekleri, test maddesi ile muamele edilen örneklerde olduğu gibi, aynı koşullar altında (aerobik) inkübasyon yapılır. İlk önce biyolojik kütle ölçümleri için kullanılan bu örnekler, çözücülerin mikrobiyal biyolojik kütle içerisindeki etkilerini kontrol etmek için çalışmaların başında ve sonunda da kullanılır. İşlem görmüş toprağı içeren kaplar ya şekil 1 de tanımlanan akış-yollu yada şekil 2 de (bakınız Ek-III) görülen absorpsiyon kolonu ile kapatılmış sisteme bağlanır.
Farklı polaritedeki uygun çözücülerle ekstrakte edilen ve test maddesi ve/veya dönüşüm ürünleri açısından analiz edilen toprak örnekleri ve inkübasyon kapları uygun zaman aralıklarıyla çift olarak ayrılır. İyi tasarlanmış bir çalışma yeterince kap içermelidir, böylelikle her örnekleme işleminde iki kap feda edilebilir. Hatta, belirli zaman aralıklarında (ilk ayda 7 gün aralıklarla ve bir ay sonra 17 günlük aralıklarla) ve her toprak örneğinin inkübasyonu esnasında ve sonunda soğurma çözeltileri ve katı emme malzemeleri ayrılır ve uçucu maddeler için analiz edilir. Ayrıca, uygulamadan sonra doğrudan alınan bir toprak örneğinin yanında, en az 5 ek örnekleme noktasından alınmış toprak örneği de dahil edilmelidir. Test maddesindeki azalma şekli ve dönüşüm ürünlerinin oluşum ve azalma şekilleriyle seçilmesi gereken zaman aralıkları elde edilebilir (örneğin, 0, 1, 3, 7 gün; 2, 3, hafta; 1, 2, 3 ay, vs.). 14C ile işaretlenmiş test maddesi kullanıldığında, ekstrakte edilemeyen radyoaktivite miktarı yanma ile belirlenmiş olacaktır ve her örnekleme aralığı için kütle dengesi hesaplanmış olacaktır. Aerobik olmayan ve çeltik tarlası şartlarındaki inkübasyonda, toprak ve su fazları test maddesi ve dönüşüm ürünleri yönünden beraberce analiz edilir veya ekstraksiyon analizinden önce, süzme veya santrifüj ile ayrılır.
Aerobik, steril olmayan çalışmalarda, ek sıcaklıklar ve toprak nemi, test maddesinin ve/veya dönüşüm ürünlerinin dönüşüm oranlarına sıcaklığın ve toprak neminin etkisinin hesaplanması için kullanışlı olabilir. Ekstrakte edilemeyen radyoaktivitenin ilave karakterizasyonuna örneğin, süperkritik akışkan ekstraksiyon kullanılarak teşebbüs edilebilir.
|