FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

C.26. LEMNA SP. BÜYÜME İNHİBİSYONU TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

Bu yöntem, OECD TG 221 (2006) (1) ile eşdeğerdir. Lemna testinin, fazlasıyla renklendirilmiş algal teste alternatif olarak uygun olduğu AB yetkilileri tarafından kabul edilmiştir (2), (3).

1. 
   Giriş
   

Bu Test Yöntemi, maddelerin Lemna grubu (su mercimeği) taze su sucul bitkilerine toksisitesini değerlendirmek için tasarlanmıştır. Mevcut kılavuzlara (4), (5), (6), (7), (8), (9) dayanır, fakat son gelişmeleri yansıtan yöntemlerin modifikasyonunu ve bir takım anahtar sorunların konsültasyonunu da içerir. Önerilen yöntem, uluslararası dolanım testi ile geçerli kılınmıştır (10).

Bu Test Yöntemi, toksisite testini, Lemna gibba ve Lemna minor kullanarak açıklar, her ikisi de kapsamlı olarak çalışılmıştır ve yukarıda atıf yapılan standartların konusudur. Çok sayıda fenotipin mevcudiyetinden dolayı karmaşık olan Lemna spp taksonomisi zordur. Lemna ile; toksik maddelere yanıt vermede genetik çeşitlilik meydana gelebilmesine rağmen; bu Test Yöntemi ile, kullanılacak belirli bir klon önerebilmek için, bu kaynak çeşitliliğinde yeterli veri yoktur. Test yönteminin saf olarak yürütülmediği dikkate alınmalıdır, fakat diğer organizmalar ile kirlenmesini minimum tutmak için test prosedürü esnasında gerekli önlemler alınır.
Test çözeltisinin yenilenmesi ile (yarı statik ve sürekli akış) ve yenilenmesi olmadan (statik) test yapılması üzerine detaylar açıklanmaktadır. Testin amaçlarına ve düzenleyici gereksinimlere bağlı olarak yarı statik uygulama ve sürekli akış yöntemlerini dikkate almak tavsiye edilir, örneğin, uçuculuk, foto bozunma, tetikleme ya da biyolojik bozunmanın sonucu olarak çözeltiden çabuk bir şekilde kaybolan maddeler için. Daha fazla yardımcı bilgi (11)’de verilmektedir.

2. 
   Tanımlar
   

Aşağıdaki tanımlar ve kısaltmalar, bu Test Yönteminin amaçları için kullanılır:

Biyokütle: popülasyonda bulunan canlı maddenin kuru ağırlığıdır. Bu testte yaprak hesaplamaları veya yaprak alanları için genellikle biyokütle yerine geçen vekiller(surrogate) ölçülür ve buna bağlı olarak ‘biyokütle’ teriminin kullanımı, aynı derecede ölçen bu vekillere karşılık gelir.
Kloroz: yaprak dokusunun sararmasıdır.
Klon: eşeysiz üreme ile tek fertten meydana gelen organizma ya da hücredir. Bu sebeple aynı klondan olan fertler genetik olarak birbirinin aynısıdır.
Koloni: birbirine tutturulmuş (genellikle 2 ila 4) ana ve kız yaprakların (mother and daughter fronds) kümelenmesi anlamına gelir. Bazen bitkiye de refere eder.
EC_x: belirlenmiş maruz kalma süresi içinde (eğer tam ya da normal test sürecinden sapma olursa açık bir şekilde belirtilmek üzere) Lemna büyümesindeki %x (örneğin %50) azalmayla sonuçlanan test ortamında çözünmüş test maddesinin derişimidir. Büyüme hızından ya da veriminden elde edilen EC değerini açık bir biçimde ifade etmek amacıyla büyüme hızı için ‘E_rC’ sembolü ve verim için ‘E_yC’ sembolü kullanılır, kullanılan ölçüm değişkeni tarafından takip edilir, örneğin, E_rC (yaprak sayısı).
Sürekli akış: sürekli olarak yeri değiştirilen test çözeltilerinin olduğu test.
Yaprak : su mercimeği bitkisinin ayrı/tek ‘yaprağımsı’ yapısıdır. Bu en küçük birimidir, örneğin ayrı, üreme yeterliliği olan.
Gibosite: kambur veya şişik görünüm sergileyen yaprak anlamına gelir.
Büyüme: ölçüm değişkenindeki artıştır, örneğin, test süresi boyunca yaprak sayısı, kuru ağırlık, yaş ağırlık ya da yaprak alanı.
Büyüme hızı (ortalama spesifik büyüme hızı): maruz kalma süresi boyunca biyokütledeki logaritmik artıştır.
Etki gözlemlenen en düşük konsantrasyonu (LOEC): Verilen maruz kalma sürecinde kontrol ile karşılaştırıldığında büyüme üzerine etkiyi istatiksel olarak önemli ölçüde azaltma etkisi (p < 0,05) gözlemlenen maddede test edilmiş en düşük konsantrasyondur. Bununla birlikte LOEC üzerindeki bütün konsantrasyonlar; LOEC’de gözlemlenmiş olana eşit ya da bundan daha büyük zararlı etkiye sahip olmalıdır. Bu iki koşula kanaat getirilemediğinde, LOEC’in (ve dolayısıyla NOEC) nasıl seçildiğini göstermek için tam bir açıklama verilmelidir.
Ölçüm değişkenleri: bir ya da daha fazla farklı tepki değişkeni kullanarak testin sonlanma noktasını ifade etmek için ölçülen her hangi bir değişken türü. Bu yöntemde yaprak sayısı, yaprak alanı, taze ağırlık ve kuru ağırlık ölçüm değişkenidir.
Monokültür: bir bitki türü olan kültürdür.
Nekroz: ölü (örneğin beyaz ya da su ile ıslanmış) yaprak dokusu.
Herhangi bir etkinin gözlemlenmediği konsantrasyon (NOEC): LOEC’in hemen altındaki test konsantrasyonudur.
Fenotip: çevresi ile genlerinin etkileşimi ile tayin edilen gözlemlenebilir organizma özellikleridir.
Tepki değişkenleri: farklı hesaplama yöntemleri ile biyokütleyi açıklayan herhangi ölçülmüş değişkenden türetilmiş toksisite tahmini için değişkenlerdir. Bu yöntem için büyüme hızları ve verim; yaprak sayısı, yaprak alanı, taze ağırlık ya da kuru ağırlık gibi ölçüm değişkenlerinden türetilen tepki değişkenleridir.
Yarı statik (yenileme) test: test esnasında belirli zaman aralıklarında periyodik olarak yeri değiştirilen test çözeltisinin olduğu test.
Statik test: test esnasında test çözeltisinin yenilenmesi olmayan test yöntemidir.
Test sonlanma noktası: testin amacı olarak kontrol ile ilgili test kimyasalıyla değişecek olan genel faktörü açıklar. Bu yöntemde test sonlanma noktası, bir ya da daha fazla ölçüm değişkenine dayanan farklı tepki değişkenleriyle ifade edilebilecek büyüme inhibisyonudur.
Test ortamı: test maddesine maruz bırakıldığında üzerinde test bitkilerinin büyüdüğü, tümüyle sentetik büyüme ortamıdır. Test maddesi, normal olarak test ortamında çözünecektir.
Verim: maruz kalma sürecinin sonundaki biyokütle eksi maruz kalma süreci başlangıcındaki ölçüm değişkenini ifade eden ölçüm değişkeninin değeridir.

3. 
   Testin İlkesi
   

Lemna grubunun üssel olarak büyüyen bitki kültürlerinin, yedi günlük periyot boyunca farklı test maddesinin farklı derişimlerinde monokültürler olarak büyümesine izin verilir. Testin amacı, seçilen ölçüm değişkenlerinin değerlendirmesine bağlı olarak bu periyot boyunca bitkisel büyüme üzerine madde ile ilgili etkilerini nicel olarak değerlendirmektir. Yaprak sayısı, primer ölçüm değişkenidir. En az bir diğer ölçüm değişkeni (toplam yaprak alanı, kuru ağırlık ya da taze ağırlık) de ölçülür, çünkü bazı maddeler diğer ölçüm değişkenlerini yaprak sayılarından daha fazla etkileyebilir. Madde ile ilgili etkileri nicel olarak değerlendirmek için test çözeltilerindeki büyüme, kontrolleri ile karşılaştırılır ve belirlenmiş %x büyüme inhibisyonunu (örneğin %50) gerçekleştiren derişim belirlenir ve EC_x (örneğin, EC50) olarak ifade edilir.

Test sonlanma noktası, maruz kalma sürecinde ölçüm değişkeninde (ortalama spesifik büyüme hızı) logaritmik artış olarak ifade edilen büyüme inhibisyonudur. Test çözeltisi serilerinde kaydedilen ortalama spesifik büyüme hızlarından, belirlenmiş %x büyüme hızı inhibisyonunu (örneğin %50) gerçekleştiren derişim tayin edilir ve E_rC_x (örneğin. E_rC₅₀) olarak ifade edilir.
Bu Test Yöntemi içinde kullanılan ilave bir tepki değişkeni de, bazı ülkelerde spesifik düzenleyici gereksinimlerin tamamlanması için gerekli olabilecek olan verimdir. Verim; maruz kalma sürecinin bitimindeki ölçüm değişkeni eksi maruz kalma süreci başlangıcındaki ölçüm değişkeni olarak ifade edilir. Test çözeltisi serilerinde kaydedilen verimden, belirlenmiş %x verim inhibisyonunu (örneğin %50) gerçekleştiren derişim hesaplanır ve E_yC_x (örneğin. E_yC₅₀) olarak ifade edilir.
Ayrıca, gözlemlenmiş en düşük etki konsantrasyonu (LOEC) ve gözlemlenmemiş etki konsantrasyonu (NOEC) istatistiksel olarak da tayin edilebilir.

4. 
   Test Maddesi Hakkında Bilgi
   

Test ortamındaki maddenin nicel olarak değerlendirilmesi için yeterli hassasiyeti olan bir analitik yöntem mevcut olmalıdır.

Test koşullarını oluşturmak için kullanışlı olabilecek olan test maddesi hakkındaki bilgi, yapısal formül, saflık, suda çözünürlük, su içindeki kararlılık ve ışık, pKa, Kow, buhar basıncı ve biyobozunabilirlik hakkındaki bilgileri kapsar. Test periyodu esnasında önemli derecede test maddesi kaybı olması muhtemel ise bunu belirleyecek olan Henry kanunu sabitini hesaplamak amacıyla, sudaki çözünürlük ve buhar basıncı kullanılabilir. Bu, benzer kayıpları kontrol etmek için atılması gereken adımların belirlenmesinde faydalı olacaktır. Test maddesinin çözünürlüğü ve kararlılığı hakkındaki bilgilerin kesin olmadığı durumda, bunların test koşulları altında değerlendirilmesi tavsiye edilir, örneğin; test içerisinde kullanılacak olan büyüme ortamı, sıcaklık, ışıklandırma rejimi.

Özellikle test ortamındaki pH kontrolü önemli olduğunda, örneğin metalleri ya da hidrolitik olarak kararlı olmayan test maddeleri test ederken, büyüme ortamına tampon ilavesi tavsiye edilir (bakınız bölüm 1.7.4, ilk paragraf). Buna ek olarak, testi zor hale getiren fizikokimyasal özellikleri olan maddeler için kılavuz da sağlanmaktadır (11).

5. 
   Referans Madde
   

Uluslararası halka testinde (10) kullanılan 3,5-diklorofenol gibi referans madde(ler), test prosedürünü kontrol etme aracı olarak test edilebilir. En az yılda iki kez ya da testin daha düşük frekansta yapıldığı durumda, test maddesinin toksisite tayinine paralel olarak referans madde ile test etmek tavsiye edilir.

6. 
   Testin Geçerliliği
   

Testin geçerli olabilmesi için kontrol içindeki yaprak sayısının iki katına çıkması için geçen süre, yaklaşık olarak yedi gün içinde yedi-kat artış ve 0,275 d-1 ortalama spesifik büyüme hızına tekabül eden 2,5 günden (60 saat) daha az olmalıdır. Bu Test Yöntemi içinde tanımlanan ortam ve test koşulları kullanıldığında, bu değerlendirme ölçütü statik test rejimi kullanımıyla elde edilebilir (8). Bu değerlendirme ölçütünün yarı-statik ve sürekli akış test koşulları altında da gerçekleştirilebilir olması beklenmektedir. İki katına çıkma süresinin hesaplaması bölüm 2.1’de gösterilmektedir.

7. 
   Yöntemin Açıklaması
   

1. 
   Düzenek
   

Test ortamı ile temas halinde olan bütün ekipmanlar camdan ya da diğer kimyasal olarak inert maddelerden olmalıdır. Kültürleme ve test amaçları için kullanılan cam malzemeler, test ortamının içine nüfuz edebilecek kimyasal artıklardan temizlenmeli ve steril hale getirilmelidir. Test kapları, test bitiminde birbiri üstüne binme olmaksızın büyüme için kontrol kaplarında farklı kolonilerin yaprakları için yeterince geniş olmalıdır. Eğer kökler test kaplarının dibine değer ise önemli değildir ancak her test kabı içindeki minimum 20 mm derinlik ve minimum 100 ml hacim tavsiye edilir. Bu gereksinimler karşılandığı takdirde test kaplarının seçimi kritik bir öneme sahip değildir. Uygun ölçülerdeki cam beherler, kristalleştirme kapları ya da cam petri kaplarının uygun olduğu kanıtlanmıştır. Test kapları gerekli hava değişimine izin verirken, buharlaşmayı en aza indirmek ve kaza ile olabilecek kirlenmeyi minimize etmek amacıyla kapatılmalıdır. Uygun test kapları ve özellikle kapaklar ışığın spektral özelliklerinin değişimini ya da gölgelenmesini önlemelidir.

Kültürler ve test kapları bir arada tutulmamalıdır. Bu en iyi şekilde ayrı çevresel büyüme odacıkları, inkübatörler ya da odalar kullanarak başarılabilir. Işıklandırma ve sıcaklık, sabit bir seviyede olmalıdır ve kontrol edilebilmelidir (bakınız bölüm 1.7.8).

2. 
   Test organizması
   

Bu test için kullanılan organizma ya Lemna gibba ya da Lemna minor’dür. Toksisite testi için kullanılan su mercimeği türlerinin kısa açıklamaları Ek-I’de verilmektedir. Bitki materyali, bir kültür birikintisinden, diğer laboratuvardan ya da sahadan elde edilebilir. Bitkiler, eğer sahadan toplanmış ise, kullanımdan önce en az sekiz hafta test için kullanılanlarla aynı ortamda, kültür içinde muhafaza edilmelidir. Başlangıç kültürlerini toplama için kullanılan saha alanları, kesin kirlilik kaynaklarından arındırılmış olmalıdır. Eğer bir diğer laboratuvardan ya da kültür birikintisinden sağlanmış ise benzer şekilde en az üç hafta muhafaza edilmelidir. Test için kullanılan bitki malzemesi ve türü ve klonlarının (eğer biliniyor ise) kaynağı her zaman rapor edilmelidir.

Alg ve protozoalar gibi diğer organizmalarla gözle görülür bir şekilde kirlilikten arınmış olan monokültürler kullanılmalıdır. Sağlıklı L.gibba kolonileri yedi yaprağa kadar içerebilir iken sağlıklı L.minor bitkiler iki ve beş arasında yaprak içeren kolonilerden oluşur.
Test için kullanılan bitkilerin kalitesi ve homojenliğinin, test sonuçları üzerine önemli bir etkisi olacaktır ve bu sebep dikkatli seçilmelidir. Genç ve görünebilir lezyonlar ve lekeler olmadan hızla büyüyen bitkiler kullanılmalıdır. İyi kalitedeki kültürler, en az iki yaprak içeren kolonilerin yüksek etkisi ile belirlenirler. Büyük miktardaki tek yapraklar ortam stresinin belirleyicisidir, örneğin besin sınırlaması ve kültürler gibi bitki malzemeleri test için kullanılmamalıdır.

3. 
   Yetiştirme
   

Kültür muhafazasının frekansını azaltmak için (örneğin bir periyot için Lemna testi planlanmadığında) kültürler, azaltılmış ışıklandırma ve sıcaklık (4-10 oC) altında tutulabilir. Kültürlemeye ait detaylar Ek-II’de verilmektedir. Alg ve diğer organizmalar ile gözle görülür kirlenme işaretleri, temiz ortama aktarımı takip eden Lemna yapraklarının alt örneklerinin yüzey sterilizasyonunu gerektirecektir (bkz. Ek-II). Bunun sonucu olarak kalan kirlenmiş kültür atılmalıdır.

En az testten yedi gün önce etkili koloniler, aseptik olarak taze steril ortam içerisine transfer edilir ve test koşulları altında 7-10 günlüğüne kültürlenir.

4. 
   Test ortamı
   

Aşağıda açıklandığı üzere Lemna minör ve Lemna gibba için farklı ortamlar tavsiye edilir. Test maddesi ile tepkiye girebileceği ve toksisite ifadesini etkileyebileceği konusunda şüphe duyulduğunda; test ortamına pH tamponunun (L.minor ortam içinde MOPS (4-morfolin propan sülfonik asit, CAS No: 1132-61-2; EINECS No: 214-478-5) ve L.gibba ortam içinde NaHCO3) dahil edilmesine dikkat edilmelidir. Steinberg Ortamı (12) da, geçerlilik kriteri sağlandığı takdirde kabul edilebilirdir.

L.minor ile test yapma ve kültürleme için Lemna büyüme ortamı İsveç Standardı (SIS) modifikasyonu tavsiye edilir. Ortam içeriği, Ek-III içinde verilmektedir.
Ek-III içinde açıklanan 20X – AAP büyüme ortamı, L.gibba ile test yapma ve kültürleme için tavsiye edilir.
Steinberg ortamı Ek-III içinde açıklandığı gibi L.minor için uygundur aynı zamanda geçerlilik kriteri sağlandığı sürece L.gibba için de kullanılabilir.

5. 
   Test çözeltileri
   

Test çözeltileri, genellikle stok çözeltinin seyreltilmesi ile hazırlanır. Test maddelerinin stok çözeltileri, genellikle maddenin büyüme ortamında çözülmesi ile hazırlanır.

Test maddesinin en yüksek test edilmiş derişimi, normal şartlarda test koşulları altında maddenin sudaki çözünürlüğünü geçmemelidir. Bununla birlikte Lemna spp.ın yüzeyde gezindiği ve su-hava ara yüzeyinde birikmiş maddelere maruz kalabileceği dikkate alınmalıdır (örneğin yetersiz derecede suda çözünen ya da hidrofobik maddeler ya da yüzey aktif maddeler). Bu gibi durumlarda maruz kalma çözeltiden değil materyalden kaynaklanacaktır ve test maddesinin özelliğine bağlı olarak test derişimleri sudaki çözünürlüğü geçebilir. Sudaki çözünürlüğü düşük olan test maddeleri için; test ortamına test maddesinin doğru miktarının eklenmesini kolaylaştırmak ve dağılımına ve çözünmesine yardım etmek amacıyla organik solvent ya da dağıtıcı kullanarak konsantre edilmiş stok çözeltisi ya da madde dispersiyonu hazırlamak gerekebilir. Mümkün olduğunca bu gibi maddelerin kullanımından kaçınılmalıdır.
Yardımcı çözücü ya da dağıtıcı kullanımından kaynaklanan hiçbir fitotoksisite olmamalıdır. Örneğin 100 μl∙l–1’e kadar derişimlerde fitoktoksisiteye sebebiyet vermeyen yaygın kullanımlı çözücüler, aseton ve dimetilformamit içerir. Eğer bir çözücü ya da dağıtıcı kullanılır ise son derişim rapor edilmeli, minimuma (≤ 100 μl∙l–1) sabitlenmeli ve bütün muamele ve kontroller, aynı çözücü ya da dağıtıcı derişimini içermelidir. Dağıtıcı kullanımı hakkında daha fazla bilgi (11)’de yer almaktadır.

6. 
   Test ve kontrol grupları
   

Test maddesinin, Lemna’ya toksisitesi hakkındaki ön bilgiler, örneğin aralık bulma testi, uygun test konsantrasyonlarının seçiminde yardımcı olacaktır. Açıklayıcı toksisite testinde, normal durumda geometrik serilerde hazırlanmış en az beş test konsantrasyonu olmalıdır. Tercihen test konsantrasyonları arasındaki ayrım faktörü 3,2’yi geçmemelidir, fakat konsantrasyon-tepki eğrisinin düz olduğu yerde daha büyük bir değer kullanılabilir. Eğer beşten daha az konsantrasyon kullanılır ise gerekçelendirme yapılmalıdır. Her test konsantrasyonunda en az üç tekrarlama kullanılmalıdır.

Test konsantrasyonları aralığının belirlenmesinde (aralık bulma ve/veya açıklayıcı toksisite testi için) aşağıdakiler dikkate alınmalıdır:

— EC_x tayini için, uygun güven seviyesini sağlamak amacıyla test konsantrasyonları, EC_x değerini desteklemelidir. Örneğin, eğer EC50 tahmini yapılır ise en yüksek test konsantrasyonu, EC50’den daha büyük olmalıdır. Eğer EC50 değeri, test konsantrasyonları aralığının dışında olur ise ortak güven aralıkları büyük olacaktır ve modelin istatiksel uyumunun düzgün bir değerlendirmesi mümkün olmayabilir.

— Eğer amaç LOEC/NOEC tahmini ise, en düşük test konsantrasyonu, büyümenin kontroldekinden önemli derecede daha az olmamasını sağlayacak yeterlilikte düşük olmalıdır. Buna ek olarak en yüksek test konsantrasyonu, büyümenin kontroldekinden önemli derecede daha düşük olmasını sağlayacak yeterlilikte yüksek olmalıdır. Eğer durum böyle değil ise, farklı konsantrasyon aralığı kullanarak test tekrar edilmek zorunda kalacaktır (en yüksek konsantrasyon, sınır çözünürlükte ya da konsantrasyon sınırı gerektiren maksimumda değil ise, örn. 100 mg∙l–1).
Her test, test maddesi olmadan test kapları gibi aynı besin ortamından, yaprak ve koloni sayısından, çevresel koşullardan ve prosedürlerden oluşan kontrolleri içermelidir. Eğer yardımcı çözücü ya da dağıtıcı kullanılır ise içinde test maddesi olan kaplar içindeki ile aynı konsantrasyonda bulunan çözücü/dağıtıcı ile ilave bir kontrol muamelesi içermelidir. Tekrarlama kontrol kaplarının sayısı (ve çözücü kapları, eğer uygulanabilir ise), her test konsantrasyonu için kullanılan kap sayısının en az iki katına eşit olmalıdır.
Eğer NOEC tayini gerekli değil ise test tasarımı, konsantrasyon sayısını arttırmak ve her konsantrasyon için tekrar sayısını azaltmak için değiştirilebilir. Ancak kontrol tekrarlarının sayısı en az üç olmalıdır.

7. 
   Maruz Kalma
   

2 ila 4 görünür yapraktan meydana gelen koloniler, aşılama kültüründen aktarılır ve aseptik koşullar altında rastgele bir şekilde test kaplarına verilir. Her test kabı, toplamda 9 ila 12 yaprak içermelidir. Yaprak ve kolonilerin sayısı, her test kabında aynı olmalıdır. Bu yöntem ve dolanım testi verileri ile kazanılan deneyim; her muamele için üç tekrar (her tekrar başlangıçta 9 ila 12 yaprak içerir) kullanılmasının, muameleler arasındaki büyüme hızı (verimle hesaplanmış %10 ila %15) ile hesaplanmış yaklaşık %4 ila %7 inhibisyonun büyümedeki farklılıklarını tespit etmek için yeterli olduğunu göstermiştir (10).

İnkübatör içindeki test kaplarının yerleşimi için rastgele bir tasarım, ışık şiddetindeki ve sıcaklıktaki uzaysal farklılıkların etkisini en aza indirmek amacıyla gerekmektedir. Bloke edilmiş bir tasarım ya da gözlemler yapıldığında kapların rastgele yerdeğiştirilmesi (ya da daha sık yer değiştirilmesi) de gereklidir.

Eğer ön stabilite testi, test maddesi konsantrasyonunun test süresi boyunca (7 gün) muhafaza edilemeyeceğini gösterir ise (örneğin ölçülmüş derişim ölçülmüş başlangıç derişiminin %80’i altına düşer), yarı statik bir test rejimi tavsiye edilir. Bu durumda koloniler, test esnasında (örneğin 3. ve 5. günlerde) en az iki uygun zamanda taze olarak hazırlanmış test ve kontrol çözeltilerine maruz bırakılmalıdır. Taze ortama maruz kalma sıklığı test maddesinin kararlılığına bağlı olacaktır; yüksek derecede kararlı olmayan ya da uçucu maddelerin sabite yakın derişimlerini muhafaza etmek amacıyla daha yüksek bir frekans gerekli olabilir. Bazı durumlarda bir sürekli-akış prosedürüne ihtiyaç duyulabilir (11), (13).

Yaprak uygulaması (sprey) yoluyla maruz kalma senaryosu, bu Test Yöntemi içinde kapsanmamaktadır, bunun yerine bakınız (14).

8. 
   İnkübasyon koşulları
   

Lemna yaprakları gibi (6 500 – 10 000 lüks’e eşit) ışık kaynağından aynı mesafedeki noktalarda fotosentetik olarak aktif radyasyon (400 – 700 mm) içinde ölçüldüğünde 85-135 μE∙m–2∙s–1 aralığından seçilmiş bir ışık şiddetini sağlamak amacıyla sürekli ısıtma ya da serin beyaz floresan ışıklandırma kullanılmalıdır. Test alanı üzerinden seçilmiş ışık kuvvetindeki herhangi bir farklılık ± %15’i geçmemelidir. Işık tespiti ve ölçümü yöntemi, özellikle algılayıcı tipi, ölçülen değeri etkileyecektir. Küresel algılayıcılar (ölçüm düzleminin altındaki ve üzerindeki bütün açılardan ışığa tepki gösteren) ve ‘kosinüs’ algılayıcılar (ölçüm düzleminin üzerindeki bütün açılardan ışığa tepki gösteren) tek yönlü algılayıcılara nazaran tercih edilir ve bunlar, bu bölümde açıklanan tipin çoklu nokta ışık kaynağı için daha yüksek okuma değeri verecektir.

Test kaplarındaki sıcaklık 24 ± 2 °C olmalıdır. Kontrol ortamının pH’ı, test esnasında 1,5 birimden daha fazla artmamalıdır. Bununla birlikte geçerlilik kriterinin sağlandığı gösterildiği takdirde, 1,5 birimden daha fazla sapma, testi geçersiz kılmayacaktır. Kararlı olmayan maddeler ya da metallerin test edilmesi gibi özel durumlarda pH kayması için ilave önleme ihtiyaç duyulur. Daha fazla bilgi için (11)’e bakınız.

9. 
   Süreç
   

Bitkiler, test kaplarına aktarıldıktan 7 gün sonra test sonlandırılır.

10. 
    Ölçümler ve analitik tayinler
    

Testin başlangıcında, hesaplanmış açıkça görünen yaprakların çıktığına emin olunmasına dikkat edilerek test kaplarındaki yaprak sayısı hesaplanır ve kaydedilir. Normal ya da abnormal görünen yaprak sayıları, testin başlangıcında, maruz kalma süresince her 3 günde bir (örneğin 7 günlük periyot esnasında en az iki uygun zamanda) ve test bitiminde tayin edilmelidir. Örneğin; yaprak boyutu, görünümü, nekrosis belirtisi, kloroz ya da gibosite, koloninin dağılması ya da kaldırma kuvvetindeki kayıp gibi bitki gelişimindeki ve kök uzunluğu ve görünümündeki değişiklikler dikkate alınmalıdır. Test ortamının önemli özellikleri (örneğin çözünmeyen madde olması, test kabında alg büyümesi) de dikkate alınmalıdır.

Test esnasında yaprak sayısının tayinine ek olarak aşağıdaki ölçüm değişkenlerinin biri (ya da daha fazlası) üzerindeki test maddesinin etkileri de değerlendirilir:

(i) toplam yaprak alanı;

(ii) kuru ağırlık;

(iii) taze ağırlık.

Toplam yaprak alanının, her test ve kontrol kabı için test başlangıcında, test esnasında ve test bitiminde belirlenebilme avantajı vardır. Kuru ya da taze ağırlık tayini, test başlangıcında, testi başlatmak için kullanılan temsili aşılama kültür numunesinden ve testin bitiminde her test ve kontrol kabından bitki materyali ile yapılmalıdır. Eğer yaprak alanı ölçülmez ise taze ağırlığa göre kuru ağırlık tercih edilir.
Toplam yaprak alanı, kuru ağırlık ve taze ağırlık aşağıdaki şekilde belirlenebilir:
(i) Toplam yaprak alanı: Bütün kolonilerin toplam yaprak alanının tayini görüntü analizleri ile yapılabilir. Test kaplarının ve bitkilerinin görüntüsü video kamera kullanılarak çekilebilir (örneğin kabı bir ışık kutusu üzerine yerleştirerek) ve son görüntü sayısallaştırılır. Bilinen alanın düz şekiller ile kalibrasyonu yapıldıktan sonra bir test kabındaki toplam yaprak alanının tayini yapılabilir. Test kabının kenarından kaynaklanan müdaheleyi hariç tutmak için önlem alınmalıdır. Bir alternatif fakat daha zor bir yaklaşım; test kaplarının ve bitkilerinin kopyasını almak, kolonilerin son görünümünü kesip almak ve yaprak alanı analizörü ya da grafik kağıdı kullanarak alanlarını belirlemektir. Diğer teknikler (örneğin koloni alanları ve birim alan görünümü arasındaki sayfa ağırlık oranı) de uygun olabilir.

(ii) Kuru ağırlık: Bütün koloniler her bir test kabından alınır ve damıtık ya da deiyonize su ile yıkanır. Su fazlasının uzaklaştırılması için kurutma kağıdında tutulur ve daha sonra sabit bir ağırlığa ulaşana kadar 60 oC’de kurutulur. Herhangi bir kök fragmenti içerilmelidir. Kuru ağırlık en az 0,1 mg doğrulukla ifade edilmelidir.

(iii) Taze ağırlık: Bütün koloniler, yuvarlak tabanında küçük (1 mm) delikler olan önceden tartılmış polistiren (ya da başka bir inert madde) tüplere aktarılır. Daha sonra tüpler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3 000 rpm’de santrifüjlenir. Artık kuru olan kolonileri içeren tüpler yeniden tartılır ve taze ağırlık, boş tüpün ağırlığı çıkartılarak hesaplanır.

1. 
   Ölçümlerin sıklığı ve analitik tayinler
   

Eğer statik bir test tasarımı kullanılır ise test başlangıcında ve test sonunda, her muamelenin pH’ı ölçülmelidir. Eğer yarı statik bir test tasarımı kullanılır ise pH, her yenilemeden önce her bir seri ‘taze’ test çözeltisinde ve ilgili ‘harcanmış’ çözeltide ölçülmelidir.

Işık şiddeti, büyüme odacığında, inkübatör ya da ışık kaynağından Lemna yaprakları kadar aynı uzaklıkta bulunan noktalardaki odalarda ölçülmelidir. Ölçümler, test esnasında en az bir kere yapılmalıdır. Büyüme odacığı, inkübatör ya da odadaki ile aynı koşullar altında tutulan vekil (surrogate) bir kap içindeki ortam sıcaklığı en az günlük olarak kaydedilmelidir
Test esnasında test maddesinin derişimleri uygun aralıklarda tayin edilir. Statik testlerde asgari gereksinim, testin başlangıç ve bitiminde derişimlerin tayinini yapmaktır.
Test maddesi derişiminin nominal derişimin ± %20’si içinde kalmasının beklenmediği yarı statik testlerde, her yenilenmede taze olarak hazırlanmış bütün test çözeltilerini ve aynı çözeltileri analiz etmek gereklidir (bkz. bölüm 1.7.7, üçüncü paragraf). Ancak test maddesinin ölçülmüş başlangıç derişiminin, nominalin ± %20’si içinde olmadığı fakat başlangıç derişiminin tekrarlanabilir ve kararlı olduğunu gösterebilmek için yeterli kanıtın sağlanabildiği (örneğin başlangıç derişiminin %80-120 aralığı içinde) durumdaki testlerde kimyasal tayinler, sadece en yüksek ve en düşük test derişimlerinde yürütülebilir. Bütün durumlarda yenilenmeden önce test maddesi derişimlerinin tayininin, her test derişiminde sadece bir tekrarlama kabında yürütülmesi gerekir (ya da kapların içeriği tekrarlama ile bir araya getirilir).
Eğer sürekli-akış testi kullanılmakta ise, testin başlangıcında, ortasında ve bitimindeki analizleri içeren yarı statik testler için açıklanmış olan benzer numuneleme rejimi uygundur, fakat bu durumda ‘harcanan’ çözelti ölçümü uygun değildir. Bu tür bir testte seyreltici akış hızı ve test maddesi ya da test maddesi stok çözeltisi günlük olarak kontrol edilmelidir.
Eğer test edilmiş madde derişiminin, nominal ya da test süresince ölçülmüş başlangıç derişimin ± %20’si içinde tatmin edici derecede elde edildiğine dair kanıt var ise sonuçların analizi, nominal ya da ölçülmüş başlangıç değerlere dayanabilir. Eğer nominal ya da ölçülmüş başlangıç derişiminden sapma ± %20’den daha büyük ise sonuçların analizi, maruz kalma esnasındaki geometrik ortalama derişimine ya da test maddesinin derişim düşüşünü tanımlayan modellere dayanmalıdır (11).

11. 
    Limit Testi
    

Bazı durumlarda, örneğin 100 mg∙l–1’e kadar olan ya da test ortamında (daha düşük olan) çözünürlük limitine kadar olan derişimlerde test maddesinin toksik etkisinin olmadığını gösteren bir ön test olduğunda, bir kontrol grubu ya da bir muamele grubu (100 mg∙l–1 ya da çözünürlük limitine eşit derişim) içindeki tepkilerin karşılaştırmasını içeren bir limit testi yapılabilir. Bunun maruz kalma derişiminin analizi ile desteklenmesi şiddetle tavsiye edilir. Daha önceden tanımlanan test koşulları ve limit testine uygulanan geçerlilik kriteri, muamele tekrar sayısının haricinde iki katına çıkarılmalıdır. Kontrol ve muamele grubundaki büyüme, ortalamaları karşılaştırmak için bir istitistiksel test kullanılarak analiz edilebilir, örneğin Student’s t-test.

2.