Fiziologiya kafedrasi "biofizika" fanidan laboratoriya

Birinchi mashq. Oqsilning yutish spektorini aniqlash.
Qon zardobi albumin (yoki tuxum albumini, pepsin va x.k.)ning suvdagi 5mg/ml li konsentratsiyali eritmasi tayyorlanadi. Optik zichligi 280 mmk to‘lqin uzunligida kvars to‘rtburchakli kyuvetalar yordamida o‘lchanadi. So‘ng eritma optik zichligi 0,5 atrofida bo‘lgunga qadar suyultiriladi. Eritma yutish spektri 230-320 mmk chegarada har 5mm oralig‘ida o‘lchanadi. Yutish egri chizig‘i tasviri chiziladi, bunda abssissaga to‘lqin uzunligini, ordinataga eritmaning optik zichligi qiymatlari qo‘yiladi.


Ikkinchi mashq. O‘simlik barglari pigmentlarining spirtli ekstraktini yutish spektrini o‘lchash.
Loviya (yoki boshqa o‘simlik) ning 1-2 ta bargi chinni hovonchada kvars qum yoki shisha bo‘lakchalari, ozgina magniy karbonat va 5-10 ml spirt qo‘shib yaxshilab yanchiladi. Hosil bo‘lgan pigmentlarning yashil rangli eritmasi filtrlanadi. Eritmaning optik zichligi spektrofotometr SF-4da 660 mmk da o‘lchanadi. Kyuveta ichidagi eritmaning erituvchisi bug‘lanib ketmasligini ta‘minlash uchun qopqoqchalar bilan yopiladi.
Agar zarurat bo‘lsa, eritma uning 660 mmk dagi zichligi spektrofotometrning 1,0-1,2 ko‘rsatkichidan ziyod va 0,5-0,8 dan kam bo‘lmaydigan kattalik darajasida suyultiriladi. Eritmaning yutish spektri 400-700 mmk chegarasida har 5 yoki 10 mmk oralig‘ida o‘lchanadi. Eritmaning maksimum spektri darajasi aniqlangandan so‘ng uning yutish spektrini 2,0-2,5 mmk oraliqlarda o‘lchashga kirishiladi. Olingan natijalarga muvofiq ravishda yutish spektrining egri chizig‘i chiziladi. Tadqiq qiluvchi biomaterialning asosiy maksimum (xlorofill-a, xlorofill-b, karotinoidlar) lari aniqlanadi.


Uchinchi mashq. Oqsil tarkibidagi tirozin va triptofaning miqdorini aniqlash.
Yutish spektriga qarab bir yoki bir necha moddalar aralashmasida miqdoriy tahlil o‘tkazish mumkin. Buning uchun optik zichlik qiymatini birgina to‘lqin uzunligini emas, balki ikki yoki bir necha to‘lqin uzunliklaridagi qiymatlarini ham bilish kerak. Aralashmaning har bir to‘lqin uzunlikdagi optik zichligi undagi komponentlarning optik zichliklarining yig‘indisiga teng bo‘ladi:

D=D_a +D_b; D= ε_a –s_a + ε_bs_b ; D= ε_a c_a+ ε_b s_b

Bu tenglamalarni yechish A va V moddalar konsentratsiyalarini
ifodalashning quyidagi imkoniyatini yaratadi:


C_a = (D ch_b –Dch₆) / (ε_a+ε_b – ε_a ε_b);
C_v = (Dε_b –Dε_a) / (ε_a+ε_b – ε_a ε_b);


Bu yerda D^/ va D^//–ikki xil to‘lqin uzunligi ₁ va ₂ dagi aralashmaning optik zichligi; ε^/_a va ε^/_v - o‘sha to‘lqin uzunliklarida A va B moddalarning ekstinksiya koeffitsientlari; c- molyar konsentratsiya. Bu formulada a indeksi A komponentga, b indeksi esa B komponentga tegishli kattalikdir. O‘lchov olib borilayotgan to‘lqin uzunligi shunday tanlanadiki, bunda ₁ to‘lqin uzunligida asosiy nurni A komponent, ₂ to‘lqin uzunligida B komponent yutishi lozim bo‘ladi.
Bunday o‘lchov olib borish jarayonida miqdoriy jihatdan aniqlanishi lozim bo‘lgan moddalarning har ikki to‘lqin uzunligida molyar ekstinksiya koeffitsientlari farqi mumkin qadar katta bo‘lishi kerak.
Ishni bajarish jarayonida tadqiq qilinadigan oqsil eritmasi 0,1n NaON eritmasida tayyorlanadi. Uning konsentratsiyasi 2mg/ml ga teng bo‘ladi. Eritmaning optik zichligi 270 va 300 mmk (D^/ va D^/) larda aniqlanadi. Tirozin (A komponent) uchun
ε^/_a=1110 va ε^//_b=1830, triptofan (B komponent) uchun esa, ε^/_a=5300 va ε^//_b=1270 qiymatlardan foydalanib yuqorida keltirilgan formula asosida oqsil tarkibidagi tirozin va triptofan miqdorlari aniqlanadi.
Molyar ekstinksiya koeffitsientlari tirozin va triptofanning konsentratsiyasi ma‘lum bo‘lgan eritmalardan foydalanib aniqlanadi. Buning uchun aminokislotani aniq analitik tarozida tortib olinadi va 0,1 n NaON eritmasiga solib eritiladi, hajmi tegishli ko‘rsatkich hajmigacha olib boriladi. D qiymatni aniqlangandan so‘ng, ε-hisoblab topiladi.
Organizmlar hayot faoliyati protsesslarini o’rganishning qiyinligini tirik materiyaning funksional xossalarini aks ettiruvchi termodinamik va kinetik ko’rsatgichlarning murakkabligigagina emas, balki tirik organizm barcha qismlarining tuzilish jihatidan juda yuksak tashkil topganligiga ham bog‘liqdir. Tirik organizm birligi barcha asosiy hayot funksiyalarini bajarib hujayradir. Hujayra atrofdagi muhit bilan energiya va moddalarni almashib turadigan ochiq termodinamik sistemani tashkil etadi.
Elektron mikroskop bilan tekshirish hujayra ultrastrukturasini analiz qilishga imkon beradib chunki elektron mikroskopning hal qiluvchi layoqati 160 000 marta kattalashtirishga imkon beradib holbuki yorug‘lik mikroskopida faqat 500-1500 marta kattalashtirilib ko‘rish mumkin. Ultrastrukturalar molekulalarning fazoda olgan joyini o‘rganishib ichki molekulyar tuzilishini aniqlash uchun tekshirilayotgan modda orqali o‘tuvchi rentgen nurlarining difraksiyalanishiga asoslangan rentgenostruktur analiz metodi qo‘llaniladi.
Elektron va optik mikroskopiya, rentgenostruktur va biokimyoviy analiz usullaridan olingan ma'lumotlar asosida hujayra har xil elementar struktura birliklarni o‘z ichiga oladigan murakkab strutura ekanligib shularning har biri biror funksiyani bajarishga moslashganligi aniqlangan. Yuqori darajada tuzilgan tirik sistemalarning har xil to‘qimalaridagi hujayralar spetsifik funksiyalarni ado etadigan va shunga ko‘ra tuzilishi hamda shakli jihatidan nihoyatda xilma-xil bo‘lishiga qaramay, ularning hammasi plazmatik membrana bilan o‘ralib turgan sitoplazmadan iborat bo‘lib, yadrosi va har xil sitoplazmatik organoidlari bor.
Sitoplazma tarkibiga har xil moddalar: oqsillar, uglevodlar, lipoidlar, organik kislotalar, vitaminlar, elektrolitlar va boshqalar kiradi. Unda 75-85% suv, 10-20% oqsil, 2-3% lipidlar, 1% uglevodlar va 1% ga yaqin tuz va boshqa moddalar bor.
Hujayra ichidagi suv tinmasdan o‘zgarib turadigan mikrofazali holatda bo‘ladi: kristal-suyuqlik, suyuqlik-kristal.
Sitoplazmadagi suv organik va anorganik moddalar uchun erituvchi hamda kolloid zarralar uchun disnersion muhit bo‘lib xizmat qiladi. Hujayradagi jami suvning 4g‘5% ga yaqini (E.de-Robertson) vodorod va boshqa bog‘lar yordamida oqsil molekulalari bilan mustahkam bog‘langandir. Bu suv boshqa moddalar uchun erituvchi bo‘lib xizmat qila olmaydi. Membranalarning ana shunday modellarida hujayra membranalariga ham xo‘s bo‘lgan ba'zi fizik-kimyoviy xossalarni tekshirish mumkin, masalan bunday membranasining shu parametrlari kattaligiga mos keladi.
Bir qancha olimlar membrananing tuzilishiga taalluqli har xil modellar taklif etishgan, chunonchi J.Danielli gipotezasiga muvofiq, membrana hujayra yuzasiga radial tarzda joylashgan qavat fosfolipidlar molekulasidan iboratdir, bunda ularning qutbli gruppalari suv fazasi tomonga qarab tursa, qutbsiz gruppalari esa bir-biriga taqalib turadi. Membrana globulyar oqsillar qatlami bilan qoplangan, bu qatlamning qutbli gruppalari ham suv fazasi tomoniga, qutbsiz gruppalari esa lipid fazasi tomoniga qarab turadi. J.Danielli ma'lumotlariga qaraganda membrananing umumiy qalinligi taxminan 80 A⁰ ga teng.
J.Robertsonning elektron mikroskopik tekshirishlari shu modelning to‘g‘riligini tasdiqlab berdi. Biroq J.Robertson lipidlar qatlamiglobulyar oqsil molekulalari bilan qoplangan bo‘lmay, balki membrananing tashqi va ichki yuzalarida chegaralar hosil qiladigan fibrillyar oqsil bilan qoplangan deb taxmin qiladi.
J. Robertsonning taxminiga ko‘ra, aksonlar va shvani hujayralari membranalarining tashqi yuzasi asosan uglevodlar-mukopolisaxaridlardan tuzilgan. Grin mitoxondriyalar membranasini tekshirib, uning tuzilishi to‘g‘risida quyidagi gipotezani taklif etdi: mitoxondriyalarning membranalari takrorlanib turadigan birliklar- “bloklar” dan tuzilgan turdan iboratdir. Ana shunday “blok”ning har biri gidrofob bog‘lar bilan bir-biriga birikkan oqsil va fosfolipid mitsellaridan tashkil bo‘ladi.
Hozir ko‘pchilik olimlar membrananing tuzilishi to‘g‘risida quyidagi fikrni quvvatlaydi: ikkita ingichka fibrillyar oqsil molekulalari qatlami orasida qo‘shaloq fosfolipidlar qatlami joylashgan, fibrillyar oqsil molekulalari qatlamini globulyar oqsil molekulari o‘rab turadi, deb taxmin qilinadi.
Ko‘pchilik hujayralar membranalarning suvni yaxshi o‘tkazishi ularda teshiklar-kovaklar bor deb taxmin qilishga imkon beradi. Membranalarni tuzilishini o‘rganish bilan shug‘ullangan J.Danielli, J.Robertson, A.A.Aiberman va boshqa olimlar oqsil molekulalalari ba'zi joylarda membranalarning yog‘ qatlamlarini teshib o‘tib, teshiklar hosil qiladi, deb taxmin qildilar. Bu teshiklar juda kichik bo‘ladi. Diametri 8 A⁰ dan kattaroq keladigan modda molekulalari ulardan o‘ta olmaydi. Membranadagi teshiklar diametri suvda erib, membrana orqali o‘tishga hali layoqatli bo‘lgan modda molekulasining katta-kichikligiga bog‘liq.
Mana shu fikr va boshqa usullardagi natijalarga asoslanib ko‘pchilik hujayralardagi teshiklar diametri 3,5 A⁰ dan 8 A⁰ gacha bo‘lishi aniqlangan. Teshiklar tuzilishi jihatidan egri-bugri uzun kanal ko‘rinishida bo‘lishi mumkin. Membranada teshiklar ko‘p emas, ular bir-biridan ancha olisda joylashgan, shunga ko‘ra ularni tuzilishiga to‘g‘ri keladigan butun maydon, masalan, eritrotsitlarda, umumiy yuzaning mingdan bir qismidan ortmaydi.
Biokimyoviy usullar bilan birga qo‘shib olib borilgan rentgenostruktur analiz va elektron mikroskop bilan tekshirishda olingan ma'lumotlar asosida hozir har bir hujayraning protoplazmasi qalinligi 100 A⁰ atrofida bo‘ladigan membrana bilan o‘ralgan deb taxmin qilinadi (J. Robertson ma'lumotlariga qaraganda membrana qalinligi 75 A⁰).
Plazmatik membranalarning kimyoviy tarkibi eritrotsitlarning gipotonik eritmada gemolizlanishi natijasida olinadigan “soyalari” deb ataluvchi pardalari ustida tekshirilgan. Mana shu ob'ektlarni biokimyoviy yo‘l bilan tekshirish natijasida bitta oqsil molekulasiga (asosan molekulyar og‘irligi yuqori bo‘ladigan fibrillyar oqsilga) taxminan 75-90 ta lipidlar molekulasi (asosan fosfolipidlar molekulasi) to‘g‘ri kelishi aniqlangan.
Fosfolipid molekulasi ikki qismdan: uzun, to‘g‘ri uglevodorod zanjiridan tashkil topgan, bu zanjir uglevod, vodorod, kislorod, azot va fosfor atomlariga ega bo‘lgan birmuncha murakkab strukturaga birikadi. Molekulaning fosfor tutadigan ana shu qismi elektrik jihatdan qutblangan bo‘lib, suv molekulalarini o‘ziga tortib turadi, bu molekulalar ham juda qutblangan bo‘ladi. O‘sha molekulaning uglevodorodli zanjirida elektrik qutbi yo‘q, shunga ko‘ra u suvni o‘ziga tortmaydi. Shunday qilib, fosfolipid molekulasining bir uchi gidrofil, ikkinchi uchi gidrofod xossalarga egadir.
Lipid qatlamlar ikkita suv fazasi orasidagi barer funksiyasini bajaradi va membrananing egiluvchan bo‘lishini ta'minlab turadi. Oqsil va lipidlarning suniy monomolekulyar pardalar ko‘rinishidagi modellarni tekshirish membranadagi shu oqsil va lipidlar molekulalarining tuzilishi to‘g‘risida tushuncha beradi. Suv yuziga qanday bo‘lmasin biror uchuvchan moddada erigan fosfolipid yoki yog‘ kislotadan bir tomchi tushirilsa, bularning molekulalari suv yuzasiga tarqalib, erituvchi bug‘lanib ketganidan keyin qalinligi bir molekula keladigan parda hosil bo‘ladi. Lengmyur aniqlaganidek, yuza qatlam batamom to‘yinganida lipidlarning adsorbsiyalangan molekulalari suv yuzasiga shunday tik bo‘lib joylashadiki, bunda gidrofil qutbli gruppa suvga botib tursa, qutbsiz unlevodorod zanjiri yuqoriga qarab tik turib qoladi. Shu tariqa joy olgan molekulalar qatlami “Lengmyur qozig‘i” deb ataladi. Stearnat kislota adsorbsiyalangan holda olinadigan ana shunday monomolekulyar parda qalinligi 25 A⁰ ni tashkil etadi.
Yuzida monomolekulyar parda bo‘lgan suvga shisha plastinka tushirib, o‘sha pardani shu plastinka yuzasiga ko‘chirish mumkin. Shisha plastinka suvga qayta-qayta tushirilganda tushirilganda unda biomolekulyar va hatto ko‘p molekulyar pardalar hosil bo‘lib, ulardagi ayrim qatlamlarning molekulalari bir-biri bilan yo qutblangan gruppalar yoki qutblanmagan gruppalar vositasida birikadi.
Plastik membranalarda topilgan ba'zi xossalarni (elastik qisqaruvchan, mexanik cho‘zida olish xossasini) ularda fibrillyar oqsil molekulalari borligi bilangina tushuntirsa bo‘ladi. Bundan tashqari hujayra membranalarining sirt tarangligi juda kichik, bu ham lipidlar qatlamini qoplab turadigan oqsil molekulalari qatlami borligiga bog‘liq bo‘ladi. Bir qancha olimlar membrananing tuzilishiga taalluqli har xil modellar taklif etishgan. Chunonchi J.Danielli gipotezasiga muvofiq, membrana hujayra yuzasiga radial tarzda joylashgan ikki qavat fosforlipidlar molekulasidan iboratdir.
Membrana hujayradagi biokimyoviy va biofizik jarayonlarni boshqarish funksiyasini bajaradi membrana hujayraga o‘tuvchi moddani o‘tish tezligini, statsionar konsentratsiyasini o‘zgarishini va biokimyoviy va biofizikaviy jarayonlarni ham tezligini nazorat qilish funksiyasini bajaradi.
Membrananing asosiy funksiyasi hujayrada bo‘ladigan biofizik jarayonlarni qanday borishini va ularning ahamiyatini nazorat qilishdan iborat.


Nazorat savollari.

1. 
   Hujayra strukturasi va funksiyasini so‘zlab bering.
   
2. 
   Hujayradagi suvning holati qanday?
   
3. 
   Biologk membrananing ultrastrukturasi.
   
4. 
   Membrananing funksiyalari.