Imunofenotipare limfocitara-sindrom limfoproliferativ Informatii generale

Imunofenotipare limfocitara-sindrom limfoproliferativ

Informatii generale

Imunofenotiparea prin citometrie in flux (IFCF) reprezinta un instrument indispensabil pentru diagnosticul, clasificarea, stadializarea si monitorizarea neoplaziilor hematologice.

La Conferinta Internationala de Consens din 2006 de la Bethesda, Maryland s-au emis recomandari privind indicatiile medicale ale testarii prin citometrie in flux. Astfel, aceasta este indicata in urmatoarele situatii clinice:

-citopenii, in special bicitopenia si pancitopenia;

-numar crescut de leucocite, incluzand limfocitoza, monocitoza si eozinofilia;

-prezenta de celule atipice sau blasti in sangele periferic, maduva osoasa sau alte lichide ale corpului;

-plasmocitoza sau gamopatia monoclonala;

-organomegalia si masele tisulare.

In aceste situatii imunofenotiparea poate constitui un screening sensibil pentru prezenta/absenta unei neoplazii hematologice. In plus, citometria in flux este un instrument util in stadializarea unei neoplazii limfoide diagnosticate anterior, in monitorizarea raspunsului la tratament incluzand detectarea bolii minime reziduale, in documentarea recaderii sau progresiei si in diagnosticul unei malignitati hematologice intercurente.

In malignitatile hematologice mai multi pasi sunt urmati in aplicarea si interpretarea informatiei imunofenotipice:

1. 
   identificarea celulelor din linii diferite si determinarea daca acestea sunt mature sau imature;
   
2. 
   detectarea celulelor anormale prin identificarea expresiei antigenice care difera semnificativ de normal;
   
3. 
   documentarea detaliata a fenotipului populatiei celulare anormale (adica prezenta sau absenta antigenelor) si, prin comparatie cu populatia normala, documentarea unei cresteri sau scaderi a intensitatii colorarii cu anticorpi marcati cu fluorocromi;
   
4. 
   evaluarea faptului daca informatiile obtinute sunt diagnostice pentru o anumita boala, iar daca nu, stabilirea unei liste de entitati posibile cu sugerarea unor studii suplimentare ce pot avea valoare diagnostica, cum ar fi imunohistochimie (IHC), citogenetica, FISH sau studii moleculare;
   
5. 
   furnizarea de informatii imunofenotipice ce pot avea valoare prognostica suplimentara, incluzand identificarea de tinte pentru o potentiala terapie tintita.
   

Atunci cand se primeste o proba pentru testare prin citometrie in flux, se stabilesc liniile celulare si antigenele ce trebuie evaluate pe baza tipului de proba si alte informatii disponibile, cum ar fi: indicatia medicala pentru testare, istoricul clinic, elementele morfologice, testarile anterioare prin citometrie in flux, rezultatele altor teste de laborator, precum si rezultatele unei eventuale testari preliminare sceening prin citometrie in flux. Pentru indicatiile medicale identificate de grupul Bethesda s-a stabilit un consens privind liniile celulare care trebuie evaluate si antigenele incluse in evaluarea primara a fiecarei linii¹.

Astfel reactivii de consens mentionati in tabelul 17.9.5.1, atunci cand sunt evaluati in combinatiile potrivite, reprezinta minimul care permite evaluarea eficienta a liniilor celulare indicate pentru neoplazia hematopoietica cu un grad acceptabil de sensibilitate².

Tabel 17.9.5.1: Reactivii consens pentru evaluarea initiala a neoplaziilor hematopoietice¹⁶

Linia celulara	Reactivii primari
Celulele B	CD5, CD10, CD19, CD20, CD45, Kappa, Lambda
Celulele T si NK	CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45, CD56
Celulele mielomonocitare	CD7, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, CD45, CD56, CD117, HLA-DR
Celulele mielomonocitare (panel limitat)	CD13, CD33, CD34, CD45
Plasmocite	CD19, CD38, CD45, CD56

Este furnizat de asemenea un set secundar de reactivi potrivit pentru caracterizarea in situatii specifice, dar numai un numar limitat dintre acestia va fi utilizat intr-un caz particular (vezi tabelul 17.9.5.2). De mentionat faptul ca in conditii practice specifice poate fi necesara inlocuirea anumitor reactivi intre cele doua paneluri pentru adaptarea la o anumita populatie de pacienti sau o anumita prevalenta a bolilor, dar numarul total al reactivilor utilizati trebuie sa ramana acelasi.

Tabel 17.9.5.2: Reactivi pentru evaluarea secundara a liniilor celulare hematopoietice specifice¹⁶

Linia celulara	Reactivii secundari
Celulele B	CD9, CD11c, CD15, CD22, cCD22, CD23, CD25, CD13, CD33, CD34, CD38, CD43, CD58, cCD79a, CD79b, CD103, FMC7, Bcl-2, cKappa, cLambda, TdT, ZAP-70, cIgM
Celulele T si NK	CD1a, cCD3, CD10, CD16, CD25, CD26, CD30, CD34, CD45RA, CD45RO, CD57, αβ-TCR, γδ-TCR, cTIA-1, T-izoformele lantului beta, TdT
Celulele mielomonocitare	CD2, CD4, CD25, CD36, CD38, CD41, CD61, cCD61, CD64, CD71, cMPO, CD123, CD163, CD235a
Plasmocite	CD10, CD117, CD138, cKappa, cLambda

 In prezent imunofenotiparea limfocitelor din sangele periferic este utilizata in mod comun in evaluarea pacientilor cu limfocitoza sustinuta pentru determinarea naturii sale reactive sau maligne³.

 NEOPLAZIILE LIMFOIDE MATURE

Acestea includ leucemia limfocitara cronica si limfoamele non-Hodgkin, recunoscute dupa un fenotip care este  similar celulelor limfoide mature normale (cum ar fi prezenta Ig de suprafata pe celulele B mature) si lipsa trasaturilor antigenice de imaturitate (cum ar fi expresia TdT, CD34 si intensitate scazuta a expresiei CD45). Prin identificarea antigenelor asociate liniei celulare, neoplaziile limfoide mature pot fi impartite in neoplazii ale liniei celulare B, T sau NK.

Neoplaziile limfoide cu celula B matura

Citometria in flux este indispensabila pentru diagnosticul neoplaziilor limfoide cu celula B matura, prin identificarea celulelor anormale fenotipic apartinand liniei celulare B si recunoasterea fenotipurilor caracteristice diferitelor entitati². Multe cazuri de posibil limfom cu celula B sunt evaluate initial prin imunofenotiparea sangelui periferic si/sau aspiratului de maduva osoasa inaintea efectuarii biopsiei tisulare. Limfoamele cu celula B identificate astfel sunt adesea incadrate in spectrul larg al bolilor limfoproliferative cronice cu celula B (BLPC-B), aceasta terminologie fiind utilizata deoarece subclasificarea precisa utilizand criteriile OMS necesita corelarea cu histopatologia tisulara. In ciuda acestei cerinte, necesitatea unui diagnostic specific rapid, utilizand proceduri minim invazive, a dus la cresterea tendintei de subclasificare completa a BLPC-B care afecteaza sangele periferic si maduva osoasa in mare parte pe rezultatele IFCF sau in combinatie cu histopatologia medulara. Aceasta tendinta a fost impulsionata de studii ce au documentat identitatea fenotipica in neoplaziile cu celula B cu afectare concomitenta a sangelui periferic sau maduvei osoase si ganglionilor limfatici¹³.

In plus citometria in flux poate fi utilizata pentru identificarea expresiei unor tinte pentru terapia cu anticorpi si furnizarea de informatii prognostice suplimentare. De asemenea, in urma terapiei, citometria de flux constituie metoda stabilita pentru evaluarea bolii minime reziduale².

Celulele limboide B mature neoplazice pot fi distinse de celulele normale prin identificarea a 2 tipuri principale de anomalii fenotipice: restrictia clasei lanturilor usoare de Ig si expresia aberanta de antigene^2;11.

Spre deosebire de majoritatea populatiilor normale sau reactive, neoplaziile cu celula B matura reprezinta de obicei o singura clona celulara care exprima o singura clasa de lant usor de Ig, adica kappa sau lambda, reflectata printr-un raport anormal kappa-lambda. In mod tipic, leucemia limfocitara cronica (CLL) prezinta o intensitate scazuta a colorarii pentru Ig de suprafata. Unele celule B nu prezinta Ig de suprafata, acestea incluzand limfoblastii, plasmocitele si celulele B timice, precum si corespondentele lor neoplazice: leucemia acuta limfoblastica, neoplaziile plasmocitare si limfomul cu celula B mediastinal primar. Rezultate fals negative pentru Ig de suprafata se pot datora interferentei Ac solubili cu legarea Ac de detectie sau alterarii/deletiei epitopilor recunoscuti, datorate de exemplu mutatiilor hipersomatice din limfomul folicular.

Prin IFCF se poate identifica expresia aberanta de antigene la nivelul celulelor B. Expresia CD5 la nivelul celulelor B este in general raportata ca un fenotip aberant, dar exista populatii mici de celule B normale mature CD5⁺, aflate de obicei in sangele periferic, dar si la nivelul ganglionilor limfatici, in special la pacientii cu boli autoimune. Expresia CD5 a fost raportata si la nivelul unor precursori normali ai celulelor B din maduva osoasa. Astfel expresia CD5 trebuie interpretata in corelatie cu alte anomalii, incluzand restrictia lantului usor de Ig sau alterarea intensitatii colorarii CD20, CD22 si CD79b. Un alt tip de aberatie fenotipica este expresia de antigene care nu sunt in mod tipic prezente intr-un subset de celule B apartinand unui compartiment biologic distinct (de exemplu expresia bcl-2 pe celulele B CD10⁺)².

Intr-un studiu, Morice si colaboratorii au evaluat retrospectiv abilitatea IFCF a sangelui periferic si maduvei osoase de a prezice tipul de limfom cu celula B intr-un grup de 252 pacienti cu IFCF pozitive si biopsii tisulare diagnostice, iar concluziile extrase din acest studiu corelativ sunt rezumate intr-un algoritm pentru clasificarea limfoamelor cu celula B prin IFCF a sangelui periferic/maduvei osoase (vezi figura 17.9.5.1)¹³.

  

Fig. 17.9.5.1  Adaptare dupa Morice W G et al. Mayo Clin Proc. 2008; 83:776-785.

* Se recomanda ciclina D1 (FISH sau IHC)                                                   ** Este necesara corelarea cu biopsia de tesut  

*** Se recomanda confirmare prin TRAP si/sau biopsie maduva osoasa

Imunofenotiparea prin citometrie in flux este in mod particular utila pentru subtiparea limfoamelor/leucemiilor cu celula B compuse predominant din celule mici (vezi tabelul 17.9.5.3)⁵.

Tabel 17.9.5.3

Antigenele de suprafata in limfoamele/leucemiile cu celula B mica
NHL	sIg	CD5	CD10	CD23	CD11c	CD103	CD25
CLL/SLL	Slab	+	-	++/+	-	-	-
MCL	+	+	-/+	-/+	-	-	-
Folicular	+	-	+	+/-	-	-	-
LPL	+	-	-	-	-	-	-
MZL	+	-	-	-	+/- slab	-	-
SMZL	+	-	-	-	+/- slab	+/- slab	-
Hairy cell	+	-	-/+	-	++	+	+

NHL = limfom non-Hodgkin, sIg = imunoglobuline de suprafata, CLL = leucemie limfocitara cronica, SLL = limfom cu limfocite mici, LPL = limfom limfoplasmocitar, MCL = limfom/leucemie cu celula a mantalei, MZL = limfom de zona marginala, SMZL = limfom de zona marginala splenic

 ▪ Expresia aberanta a CD5 este caracteristica pentru CLL/SLL si MCL, care prezinta manifestari superpozabile. Coexpresia omogena a CD5 si CD23 de catre o BLPC-B, atunci cand este insotita de colorarea slaba atat pentru sIg cat si pentru CD20, CD22, CD79b, iar FMC-7^- prezice CLL/SLL cu specificitate inalta. Acest fenotip exclude MCL (in care de obicei CD23 este negativ), iar alte limfoame similare fenotipic sunt relativ indolente, astfel incat efectele clinice ale clasificarii unuia din aceste cazuri in categoria CLL ar fi probabil minime. Totusi acest diagnostic IFCF trebuie confirmat prin corelarea cu date clinice, de laborator si citologice, cu recomandarea de biopsie tisulara cand subclasificarea precisa ramane neclara¹³.

Un fenotip caracterizat prin expresia intensa a sIg si CD20, pozitivitate CD5 uniforma, iar expresia CD23 fie absenta fie partiala si FMC-7⁺ se asociaza puternic cu MCL^2;13.

In anumite cazuri IFCF prezinta aspecte care se suprapun intre fenotipurile CLL si MCL, expresia slab pozitiva a CD23 putand fi intalnita in ambele. Astfel, dat fiind comportamentul clinic relativ agresiv al MCL, studii suplimentare, care includ imunohistochimie pentru supraexpresia ciclinei D1 sau examen citogenetic pentru identificarea translocatiei t(11;14)(q13;q32) sau FISH pentru gena de fuziune CCND1/IGH, sunt necesare pentru diagnostic in toate cazurile de BLPC-B care prezinta expresia uniforma a CD5 si in care lipsesc alte atribute fenotipice tipice pentru CLL. Totusi absenta genei de fuziune in aceste cazuri nu stabileste diagnosticul definitiv de CLL, alte boli (LPL, SMZL) putand prezenta un imunofenotip similar. De asemenea in cazurile cu IFCF tipica pentru MCL un FISH negativ nu exclude complet diagnosticul, in cazuri rare alte tipuri de ciclina D putand fi supraexprimate^2;5;13.

CD5 poate fi exprimat si in alte BLPC-B, in mod particular LPL sau SMZL, in multe din aceste cazuri expresia CD5 fiind partiala. Expresia partiala a CD5 nu exclude CLL sau MCL, iar pe de alta parte nu prezice un anume tip de limfom¹³. Posibile aspecte distinctive includ absenta expresiei CD23 in majoritatea MZL si prezenta diferentierii plasmocitare intr-un subset semnificativ din acestea demonstrata de expresia CD138, expresia intensa a CD38 si restrictia lantului usor de imunoglobuline citoplasmatice (cIg). Totusi si alte subtipuri de neoplazii limfoide B pot demonstra diferentiere plasmocitara, in special LPL². De aceea, in cazul unei BLPC-B detectata prin IFCF a sangelui periferic sau maduvei osoase, cu expresia partiala a CD5, pentru un diagnostic precis se recomanda biopsia tisulara^2;13. Uneori studiile de genotipare pot sustine diagnosticul de MZL. Desi unele anomalii genetice pot fi intalnite atat in CLL/SLL cat si in MZL (de exemplu, trisomia 18), urmatoarele anomalii sunt mai tipice pentru MZL: t(11;18)(q21;q21), t(1;14)(p22;q32), t(14;18)(q32;q21), precum si deletia 7q31 in SMZL².

Un mic subset din pacientii cu leucemie prolimfocitara B (B-PLL) pare sa fie CD5⁺. Unii dintre acestia au fost ulterior diagnosticati cu varianta blastoida de MCL prin testarea pentru translocatia t(11;14)(q13;q32) sau rearanjamentele genei CCND1. Este dificil sa se distinga intre CLL cu numar crescut de prolimfocite, transformarea prolimfocitoida a CLL sau PLL de novo. Transformarea prolimfocitoida se caracterizeaza prin colorare scazuta pentru CD5, intensitate crescuta a colorarii pentru CD20 si sIg si achizitia FMC-7. Totusi unii pacienti cu transformare prolimfocitoida demonstreaza un fenotip identic cu cel al CLL/SLL precedente. Fenotipul B-PLL de novo este variabil, incluzand unii pacienti CD5⁺, dar care, spre deosebire de CLL/SLL, de obicei sunt CD23^{- 2}.

Este putin probabil ca o BLPC cu celula mica B CD5 negativa sa reprezinte CLL, iar aceste cazuri sunt clasificate mai potrivit ca NHL in faza leucemica.

▪ Expresia CD10 la IFCF se coreleaza puternic cu diagnosticul tisular de limfom folicular (FL) sau limfom difuz cu celula mare B (DLBCL), urmate de limfomul Burkitt (BL)^2;13. Expresia CD10 in alte tipuri de limfoame este neobisnuita, fiind foarte rara in LPL, MZL si MCL. Pe de alta parte CD10 este in mod normal exprimat de celulele B ale centrului folicular, leucemia/limfomul limfoblastic cu precursor de celula B, subseturi de celule T mature, limfoblasti precursori ce celula T, neutrofile si unele celule nonhematolimfoide.

Aproximativ 20-40% din toate DLBCL prezinta un fenotip CD10⁺, acestea putand fi dificil de diferentiat de BL sau de FL compus din multe celule mari. Astfel cand un fenotip B matur CD10⁺ este identificat prin IFCF, distinctia intre aceste posibilitati trebuie evaluata in continuare prin morfologie².

BL al copilului este in general CD10⁺ si CD5^-. Desi BL al adultului este de obicei CD10⁺, fenotipul in aceste cazuri este mai variabil si este mai dificil de diferentiat de DLBCL, dar spre deosebire de unii pacienti cu DLBCL si majoritatea pacientilor cu FL, BL este de obicei bcl-2^{- 2}.

▪ HCL are un fenotip distinctiv care permite diagnosticul si detectia unor niveluri scazute de boala ulterior terapiei: CD20 intens, CD22 intens, CD11c intens,CD25⁺, CD103⁺, sIg intermediar sau intens, FMC-7⁺, CD23^-, CD5^-, CD10^-. Acest fenotip este mai sensibil si specific pentru diagnosticul de HCL decat coloratia pentru fosfataza acida tartrat rezistenta (TRAP). CD103 este caracteristic exprimat in HCL, alte boli CD103⁺ fiind rare si nu raspund bine la acelasi tip de terapie, acestea incluzand HCL varianta (HCLv) si limfomul pulpei rosii a splinei cu limfocite viloase (SRPL), care sunt frecvent CD103⁺, precum si rare cazuri de SMZL si DLBCL. Coexpresia CD103 si CD25 este considerata unul din cele mai utile criterii de diagnostic pentru HCL. Ocazional HCL clasica deviaza de la fenotipul caracteristic. Un mic subset de HCL (10-26%) sunt CD10⁺, dar sunt morfologic similare HCL CD10^- si raspund la terapia tipica. Astfel diagnosticul de HCL trebuie luat in considerare atunci cand se identifica un fenotip CD10⁺, CD5^- asociat cu identificarea altor aspecte fenotipice caracteristice HCL. Alte variatii fenotipice raportate includ lipsa CD103 (foarte rar), lipsa CD25, expresia bcl-1 sau prezenta colorarii pentru CD23. Cazurile CD25^- au morfologie variabila, de la HCLv si SMZL la PLL si DLBCL. Recent, coloratia histochimica pentru anexina A1 a fost aratat ca distinge cu o sensibilitate si specificitate de 100% intre HCL si alte BLPC-B, incluzand SMZL si HCLv. HCLv se caracterizeaza prin numar mai mare de leucocite, absenta monocitopeniei, prezenta de celule cu nucleoli proeminenti, lipsa colorarii pentru TRAP, CD25^-, dar in rest este similara fenotipic HCL clasice. Este importanta recunoasterea acestei HCL variante deoarece raspunsul la agentii eficienti in HCL clasica este de obicei slaba, iar supravietuirea mediana este semnificativ scurtata. Totusi existenta HCLv este dezbatuta si s-a pus intrebarea daca unele din aceste neoplasme nu reprezinta SMZL, cu care prezinta similitudini morfologice. In clasificarea OMS 2008, HCLv si SRPL au fost listate sub termenul de “limfom splenic cu celula B, neclasificabil”, HCLv nemaifiind considerata legata biologic de HCL^2;4;5.

• 
  MZL prezinta de obicei un fenotip CD5^-, CD10^-, iar diagnosticul se bazeaza pe identificarea trasaturilor morfologice caracteristice si excluderea altor neoplazii cu celula mica B: FL CD10^-, MCL CD5^- si HCL. Distinctia de HCL este mai dificila datorita fenotipurilor care se pot suprapune. MZL este adesea CD11c⁺ si poate fi pozitiv pentru CD103. Totusi in MZL colorarea pentru CD11c este mai slaba, lipseste combinatia CD103, CD11c si CD25 si lipseste colorarea intensa pentru CD20 si CD22².
  
• 
  Aproximativ 60-80% din pacientii cu LPL sunt raportati cu un fenotip CD5^-, CD10^-, CD23^-; multi pacienti exprima CD11c si CD25, dar spre deosebire de HCL sunt CD103^{- 2}.
  

▪ Neoplazii limfoide cu celula B matura care sa exprime atat CD5 cat si CD10 sunt putin comune. Acest grup include, in ordinea incidentei: DLBCL, FL, MCL, CLL/SLL, BL. Evaluarea morfologica si studii genetice (rearanjamentele genei BCL-2 in FL, tranlocatia t(11;14)(q13;q32) sau rearanjamentele genei CCND1 in MCL, translocatiile MYC in BL) pot fi necesare pentru stabilirea diagnosticului².

Expresia CD38 si ZAP-70 a fost raportata ca ar avea valoare prognostica in CLL/SLL. Desi majoritatea studiilor au utilizat un cut-off de 30% celule pozitive pentru a determina pozitivitatea expresiei CD38, unele studii au demonstrat un prognostic advers pentru pacientii cu expresia CD38 pe 20% sau chiar mai putine celule tumorale². Expresia ZAP-70 a fost aratat ca se coreleaza cu statusul mutational al regiunii variabile a lantului greu de Ig (IgVH), progresie mai rapida a bolii si supravietuire mai mica⁵. Exista o serie de dificultati tehnice in determinarea statusului ZAP-70, legate de intensitatea relativ slaba a colorarii cu multi fluorocromi disponibili comercial, localizarea intracitoplasmatica a marker-ului care face necesara folosirea de tehnici de permealizare care pot duce la scaderea intensitatii colorarii, prezenta colorarii nespecifice la nivelul celulelor B nonneoplazice, expresia labila in timp si sensibilitatea la diferiti anticoagulanti (a fost recomandata utilizarea EDTA si transportul in maxim 24 ore in laborator). Nu s-a ajuns la un consens in ceea ce priveste metoda optima de determinare a caror celule ar trebui considerate pozitive pentru ZAP-70. Recent au fost propuse cateva sisteme de calculare implicand media si mediana intensitatii fluorescentei ZAP-70 in celulele leucemice, celulele T, NK si celulele B normale².