İnsan sperm başinda vakuol sperm geliŞİMİ ve olgunlaşma sürecinde oluşan fizyolojik yapilar



Yüklə 51.3 Kb.
tarix06.03.2018
ölçüsü51.3 Kb.

İNSAN SPERM BAŞINDA VAKUOL SPERM GELİŞİMİ VE OLGUNLAŞMA SÜRECİNDE OLUŞAN FİZYOLOJİK YAPILAR

Atsushi Tanaka, M.D.,¹ Motoi Nagayoshi, M.D., ¹ Izumi Tanaka, Phar.B., ¹ and Hiroshi Kusunoki, Ph.D. ²

¹ Saint Mother Obstetrics and Gynecology Clinic and Institute for Assisted Reproductive Technology, Fukuoka; and ² Faunal

Diversity Sciences, Graduate School of Agriculture, Kobe University, Kobe, Japan



(Fertil Steril 2012;98:315–20. 2012 by American Society for Reproductive Medicine.)
KISA ÖZET: İnsan sperm başı vakuolleri ICSI sonuçlarını etkilemez.

Giriş

Mikroskopların kalitesinde dramatik bir iyileşme ile birlikte, intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yüksek optik çözünürlükte mümkün hale gelmiştir, ve insan sperm başkanlarının vakuollerinin önemi (1, 2) tekrar değerlendirilmiştir. Vakuol sperm başının yüzeyinden akrozom boyunca çekirdeğe uzanan konkavitedir. Fawcett (3) e göre insan spermi çekirdeğindeki vakuollerinin evrensel varlığı bir asır önce Eimer tarafından yazılmış bir rapor ile belgelenmiştir . 1950 lerde transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile Sperm başının ultra ince kesiti gerçekleştirildiğinde görüldü ki insan sperm çekirdeği genellikle farklı lokalizasyonlarda bir veya daha fazla vakuol içermektedir (5-7). Bir çok araştırmacı intranüleer vakuollerin fizyolojik önemi olmayan dejeneratif yapılar yerine sperm başının normal yapısında olduğu sonucuna varmıştır (3, 8-10). Bu arada IVF, özellikle ICSI, insan infertilite tedavisine girmesiyle, Mundy ve ark. (11) subfertil erkeklerin sperm çekirdeklerinde fertil erkek kontrol grubuna göre daha fazla intranüleer vakuol olduğunu göstermişlerdir. Daha güncel olarak vakuollü spermlerle uygulanan ICSI de gebelik oranlarının daha az ve gebelik kayıplarının daha fazla olduğu, ve bu vakuoller sadece bir polimorfizm değil, DNA hasarı ile birlikte bir anormallik için risk faktörü olduğu öne sürülmüştür (12-19).

Çelişkili değerlendirmeleri açıklığa kavuşturup, İnsan sperm vakuollerinin önemini değerlendirmek ve bu özelliğin fizyolojik ve normal olup olmadığını saptamak için çeşitli gelişim ve olgunlaşma dönemlerindeki erkek germ hücrelerinde ilk demembranating tedaviler ile veya olmadan vakuol vakalarını incelemek için Normarski differential interference contrast (DIC) sistemi kullanmıştık. Ayrıca, motil, normal yapılı, vakuollü ve vaküolsüz sperm kullanarak morfolojik olarak seçilen spermlerin (IMSI) intrasitoplazmik enjeksiyonunu yaptık ve sonuçları bizim geleneksel ICSI kullandığımız sonuçlarla karşılaştırdık.

Materyal ve Metod

Konular ve Etik Yönleri

Bu retrospektif çalışma, katılan tüm hastaların aydınlatılmış onamları ile gerçekleştirilmiştir.

Yuvarlak ve elangasyon spermatid, testiküler, epididimal ve ejaculat spermatozoa 28 erkek den elde edildi (ort yaş, 37.7+/- 5.6 yaş;aralık 31-50 yaş), bunlar normozoospermik (11 erkek), oligospermik veya astenozoospermik (10 erkek), obstrüktif azospermik (4 erkek) ve obstrüktif olmayan azospermik (3 erkek)di. Metafaz II oosit uzun GnRH agonist protokolü (20) ile kontrollü ovaryan hiperstimülasyon gerçekleştirilen 18 kadın (Ort yaş, 34.6+/- 1.9 yaş;aralık 28-37 yaş) dan alındı.

Spermatozoa Ejakulat hazırlanması

Mastürbasyonla elde edilen semen örnekleri sıvılaşması için 37°C de 30 dakika bekletilip ardında rutin sperm değerlendirilmesi yapıldı. Bu hastalar WHO kriterlerine (21) göre oligozoospermi, astenozoospermi, ve normozoospermik olarak ayrıldı. Vakuol derinliğinin değerlendirilmesinde normozoospermik erkek ejakulatından akrozom ve/veya plazma membranın ayrışmasında üç tedavi kullanıldı; 1-akrozomal reaksiyon indüksiyonu, 2-donma-çözülme ve 3-bir deterjanla demembranation (22-23). Özetle yıkanmış spermatozoa substratsız tuz solüsyonun (NeoK3; 148 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 20 mM N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonic acid, pH 7.4) içinde yüksek sperm konsantrasyonunda tekrar askıya alınıp 40°C de 2-3 saat inkübe edilmiştir. Akrozom reaksiyonu modifiye üçlü boyama tekniği ile değerlendirilmiştir (24).


Epididmal ve Testiküler Spermatozoa ve Spermatidlerin Hazırlanması
Epididmal ve Testiküler Spermatozoa ve Spermatidler çeşitli yerlerde (25-27) tariflenen metodlara göre azospermik erkeklerde elde edildi. Ön biyopsi sonuçları tüm nonobstrüktif azospermik erkeklerde spermatogenezin yuvarlak spermatid evresinde durduğunu göstermektedir. Buna karşılık obstrüktif azospermik hastaların epididim veya testisinde az sayıda spermatozoa bulunmuştu. Spermatozoa epididimal kanallardan direk aspirasyonla elde edilmektedir. Testiküler spermatozoa ve spermatid toplanması için, testis küçük doku parçaları microtesticular sperm ekstraksiyonu (TESE) ile elde edilmiştir. Eritrosit parçalayan tampon maddesi (28) ile yıkandıktan sonra, testis dokuları buz üzerinde oftalmik bıçaklar ile ince kıyılıp, 0.001%deoksiribonükleaz (DNase) I (Sigma-Aldrich) içeren 0.125% kollajenaz (Type IV-S; Sigma-Aldrich) ile 20 dakika için 32.5°C de sindirilmiş ve Dulbecco’s fosfat-tamponlu salin (PBS) ile% 1 glikoz ilave ve 6 mM sodyum piruvat ve antibiyotikler (29) ile yıkanmıştır. İzole spermatojenik hücreler mikroskopik olarak gözlenmiş ve spermatidler mansour ve ark.larının (30) sitolojik kriterlerine göre ayrıştırılmış ve altı faza (Sa, Sb1, Sb2, Sc, Sd1, and Sd2) sınıflandırılmıştır (31-33).
Işık Mikroskobu ile Vakuoller gözlenmesi
Sperm ve spermatidler bir Pipetman (Gilson P-20) veya bir micromanipulator(Three-axis joystick oil hydraulic micromanipulator MO-202U; Narishige), ile bir cam slayt üzerine yerleştirildi. Kuruması engellenmesi için üstü kapatıldı (Paper Bond; Kokuyo). Bu hücrelerin diğer örnekleri de steril mineral yağın altına (mouse embryo tested, M-8410; Sigma-Aldrich) steril % 10 SPS-HTF nin damlasına yerleştirildi. Bu iki örnek de, vakuollerin sayı, şekil, ve pozisyonları normal yapıdaki sperm başı ve spermatid çekirdeklerinde, Normarski DIC sistem yerleşik 2 tip mikroskop (Olympus IX71-ARCEVA; Olympus and Nikon Eclipse TE300; Nikon) altında yağlı immersiyon lensle Χ 1000 ve kuru lensle Χ 600 büyütmede gözlemlendi.

Vakuol sayısı not edildi, büyüklüklerine göre üç tipe ayrılırken (büyük; >50% yüzey alanının, orta; 50%-25% yüzey alanının, ve küçük; <25% toplam sperm başının yüzey alanının), yerleşim yerlerine göre de üç e ayrıldı; akrozomal, ekvatoral veya postakrozomal.


Vakuollü veya Vakuolsüz Seçilmiş Spermatozoların İntrasitoplazmik Enjeksiyonu
Astenozospermik erkeklerden elde edilen yıkanmış ejakulat spermler 3% polyvinylpyrrolidone içeren HTF(Human tubal fluid) nin microdamlasına transfer edilip, hareketli, morfolojik olarak normal olup vakuol içeren veya içermeyen sperm micromanipulator ile toplandı. Büyütme aynı görüntü alanında Χ200 e düşürülerek seçilen sperm metafaz II oosite enjekte edildi. ICSI sonrası oosit iki sıralı media da(Quinn's advantage Cleavage and Blastocyst Media; Sage In-Vitro Fertilization Inc., A Cooper Surgical Company) kültüre edilip, fertilizasyon ve süregelen embryonik oluşum incelenerek seçilmemiş spermlerle yapılan geleneksel ICSI den elde ettiğimiz klinik verilerle karşılaştırıldı.

İstatistiksel Analiz
X² test; çeşitli sperm hücrelerindeki vakuollerin insidansının ve vakuollü veya vakuolsüz sperm kullanılarak yapılan geleneksel ICSI ve IMSI sonrası fertilizasyon hızı ve embryo oluşumu değerlendirilmesinde kullanılmıştır.
Sonuçlar
Tablo 1 de tedavi almayan(Şekil 1A), akrozomal reaksiyon indüksiyonu(Şekil 1B), donma-çözülme veya demembrana(Şekil 1C), tedavisiz epididimal(Şekil 1D), testiküler sperm(Şekil 1E) ve Sb1-Sd2 spermatidlerin(Şekil 1F-1I) DIC mikroskop altında tespit edilmiş ejakülat spermlerin vakuol sıklığını göstermektedir. DIC incelemesi göstermiştir ki, çeşitli ön tedaviler sonrası vakuol görülme sıklığı değişmemektedir(97.4-99.4%, 1.58-1.70 vakuol/spermatozoa). Oligo-asteno ve normospermik erkeklerde belirgin farklılık saptanmadı. Testiküler ve epididimal spermlerin her ikisinde vakuol sıklığı ejakülat hücrelerden daha az, Sc-Sd2 spermatidlerle hemen hemen aynı olarak bulundu. Ancak erken evre spermatidlerde, Sb2-Sb1 gibi, bu değerler belirgin olarak düşüktü.
Tablo 2 de; DIC mikroskopisinde de görüldüğü gibi ejakülat ve epididimal spermatozoalarda ve Sb1-Sb2 spermatidlerde vakuollerin çeşitli boyutlarının dağılımını göstermektedir. Ejakülat ve epididimal spermlerde bulunan vakuollerin 70% i küçük iken büyük vakuoller ancak 15% olarak bulundu(Şekil 1A-1D). Diğer yandan büyük vakuoller daha sıklıkla spermatidlerde bulundu(Şekil 1F-1H), ve bu üç boyut grubunda küçük ve orta boyutlu vakuoller daha az sıklıkla izlendi(Şekil 1G).
Tablo 3 de vakuollü veya vakuolsüz ejakülat sperm kullanılarak yapılan IMSI sonuçları belirtilmektedir. Bu çalışmada, IMSI için gerekli süre geleneksel ICSI(şeçilmemiş sperm enjeksiyonu) ile aynı idi. Büyük veya küçük vakuollü sperm enjeksiyonu sonrası gebelik hızları belirgin olarak farklı bulundu. Ancak bu değerler vakuolsüz sperm kullanılarak yapılan IMSI den belirgin olarak farklı değildi. Gebelik hızları, vakuolsüz veya büyük vakuollü seçilmiş hücreler kullanılarak yapılanlarla, kliniğimizde seçilmemiş hücrelerle yapılan geleneksel ICSI arasında belirgin bir fark izlenmemişken, yine de küçük vakuollü seçilen hücrelerle gebelik hızları belirgin olarak yüksekti. Buna karşılık vakuolsüz seçilmiş hücrelerden elde edilen blastokist oranları vakuollü veya seçilmemiş hücrelerinkinden belirgin olarak düşüktü.

Tartışma
Memelilerde yapılan çalışma sonrası Bedfort(9) ve Zamboni ve ark.(34) hücresel vakuollerin insan sperm başına özgü yapılar olduğunu rapor etmişlerdir. Yaptıkları elektron mikroskopi çalışmasında insanların aksine birçok memeli türünün elektroejekülat veya epididimal sperminde hücresel vakuole rastlamamışlardır. Mevcut çalışmada, DIC gözlemi göstermiştir ki; insan ejakülatında, motilite ve belirgin yapısal kalitesine bakılmaksızın sperm başının yüzeyinde özellikle akrozomal alanda yerleşik çeşitli boyutlarda birden çok vakuol izlenmiştir. Normo-oligo ve astenospermik hastalarda çok yüksek oranda vakuol bulmamız sürpriz olmadı ve Baccetti ve ark(1) tarafından rapor edilen sonuçlarla uyumlu idi. Bartoov ve ark.(13) ileri hareketli insan sperm başında birden fazla büyük vakuol bulunmasının olağandışı olmadığını belirmişlerdir.
Vakuol sıklığı sperm plazma membranı ve/veya akrozomun ayrışması sonrası değişmemektedir ve bu da çoğu vakuol ün plazma membranının çöküntüsü veya akrozomdaki oyuk olmadığını fakat hücredeki kavite olduğunu göstermiştir.
Mevcut çalışmada vakuollerin yoğunlaşan hücresel yapının yüzeyinde hatta erken evre spermatidlerde bulunduğunu ve spermiogenez i takiben ve epididimal geçişle birlikte görülme sıklığının arttığı ve boyutunun küçüldüğünü göstermiştir. Holstein and Roosen-Runger (35) and Johannisson ve ark. (36)insanlarda büyük kromatin vakuollerin 6.basamaktan(akrozom fazı) itibaren ölçülebileceğini ve bu basamaktan sonra bulunduğu bölgede büyümediğini rapor etmişler (37). Buna ek olarak Golan ve ark.(38) epididimis boyunca geçişinde insan sperm kromatinin yoğunlaşmaya devam ettiğini ortaya atmıştır.

Bu raporlar bizim düşüncemizi destekleyip, vakuol oluşumunun sperm çekirdeğinin yoğunlaşması esnasında doğal olarak oluştuğunu ve dejenerasyon olarak değerlendirilmeyip fizyolojik bir değişim olarak gerçekleştiğini göstermiştir.


Güncel olarak modifiye ICSI tekniğini kullanan bazı raporlar(12-19)göstermiştir ki; vakuollü insan spermlerinin erkek gamet olarak kalitesi vaküolsüzleri göre daha düşüktür. Buna uygun olarak IMSI ile gebelik oranları konvansiyonel ICSI ye göre artacaktır. Yine de çalışmamızda, vakuollü hücrelerin daha düşük kalite veya IMSI nin seçilmemiş geleneksel ICSI ye göre daha iyi olduğunu gösteremedik. Bu da göstermektedir ki çalışmamızdaki denek sayısının yetersiz olması aradaki farkı gösterme gücüne ulaşamamıştır. Ayrıca küçük vakuollü hücreler vakuolsüz olanlara göre daha yüksek fertilite hızı bile göstermiştir. Thundathil ve ark. (39) bull çalışmalarında, birden çok hücresel vakuollü bull spermatozoanın zona bağlanmasında kusur olduğunu ve oosit için girişim kazanıp, belirgin olarak erken embryonik oluşum ve fertilizasyonda rol oynadığını göstermişlerdir.
İnsan sperm başında bulunan vakuollerin genel varlığının önemi hala tam olarak anlaşılamamıştır ve ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Ancak, bizim sonuçlarımız vakuollerin sıklıkla insan sperm başının yüzeyinde bulunduğunu ve dejeneratif yapılar olarak değerlendirmek yerine normal hücreiçi yapılar olduğunu kuvvetle belirmiştir. Çalışmamızda, insan sperm vakuollerinin ICSI sonuçlarını etkilemediğini bulduk. İnsanlardaki vakuolsüz sperm sayısı oldukça azdır ve bunları bulup enjekte etmek oldukça zor ve zaman harcayan işlemlerdir. Pratikte genellikle imkansızdır. Bu nedenle, ICSI/IMSI uygulanacağı zaman sperm seçiminde baş vakuolün varlığı spermin atılması için bir sebep olamamalı, vakuolün boyutunun önemli olduğu ve büyük vakuollü spermin kullanılması önlenmelidir.

KAYNAKLAR:

1. Baccetti B, Burrini AG, Collode1 G, Magnano AR, Piomboni P, Renieri T,

et al. Crater defect in human spermatozoa. Gamete Res 1989;22:249–55.

2. Schill WB. Some disturbances of acrosomal development and function in

human. Hum Reprod 1991;6:969–78.

3. Fawcett DW. The structure of the mammalian spermatozoon. Int Rev Cytol

1958;7:195–234.

4. Eimer T. Untersuchungen uber den Bau und die Bewegung der Samenfaden.

Verhandl d Physik –med Gesellschaft zu Wurzburg 1874;6:93–160.

5. Schnall MD. Electron microscopic study of human spermatozoa. Fertil Steril

1952;3:62–81.

6. _Anberg A. The ultrastructure of the human spermatozoon; an electron microscopic

study of spermatozoa from sperm samples and the epididymis including

some observations of the spermatid. Acta Obstet Gynecol Scand

Suppl 1957;36:1–133.

7. Schultz-Larsen J. The morphology of the human sperm; electron microscopic

investigations of the ultrastructure. Acta Path Microbiol Scand Suppl 1958;

44:1–121.

8. Chrzanowski S. Ultrastructure of human spermatozoon. Pol Med J 1966;5:

482–91.


9. Bedford JM. Observation on the fine structure of spermatozoa of the Bush

baby (Galago senegalensis), the African green monkey (Cercopothecus

aethiops) and man. Am J Anat 1967;121:443–60.

10. Pedersen H. Ultrastructure of the ejaculated human sperm. Z Zellforsch

1969;94:542–54.

11. Mundy AI, Ryder TA, Edmonds DK. A quantitative study of sperm head

ultrastructure in subfertile males with excess sperm precursors. Fertil Steril

1994;61:751–4.

12. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F. Selection of spermatozoa with normal nuclei

to improve the pregnancy rate with intracytoplasmic sperm injection. N Engl

J Med 2001;345:1067–8.

13. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, Kogosovski A, Menezo Y, Barak Y. Real-time

fine morphology of motile human sperm cells is associated with IVF-ICSI

outcome. J Androl 2002;23:1–8.

14. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, Kogosovsky A, Yagoda A, Lederman H, et al.

Pregnancy rates are higher with intracytoplasmic morphologically selected

sperm injection than with conventional intracytoplasmic injection. Fertil

Steril 2003;80:1413–9.

15. Berkovitz A, Eltes F, Yaari S, Katz N, Barr I, Fishman A, et al. The morphological

normalcy of the sperm nucleus and pregnancy rate of intracytoplasmic

injection with morphologically selected sperm. Hum Reprod 2005;20:

185–90.


16. Berkovitz A, Eltes F, Ellenbogen A, Peer S, Feldberg D, Bartoov B. Does the

presence of nuclear vacuoles in human sperm selected for ICSI affect pregnancy

outcome? Hum Reprod 2006;21:1787–90.

17. Franco JG Jr, Baruffi RLR, Mauri AL, Petersen CG, Oliveira JBA, Vagnini L. Significance

of large nuclear vacuoles in human spermatozoa: implications for

ICSI. Reprod BioMed Online 2008;17:42–5.

18. Antinori M, Licata E, Dani G, Cerusico F, Versaci C, d'Angelo A, et al.

Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection: a prospective

randomized trial. Reprod BioMed Online 2008;16:835–41.

19. Vanderzwalmen P, Hiemer A, Rubner P, Bach M, Neyer A, Stecher A, et al.

Blastocyst development after sperm selection at high magnification is

associated with size and number of nuclear vacuoles. Reprod BioMed Online

2008;17:617–27.

20. Tan SL. Luteinizing hormone-releasing hormone agonists for ovarian

stimulation in assisted reproduction. Curr Opin Obstet Gynecol 1994;6:

166–72.


21. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination of

human semen and sperm–cervical mucus interaction. 4th ed. Cambridge:

Cambridge Univ. Press; 1999.

22. Kusunoki H, Sakaue M, Kato S, Kanda S. Induction of the acrosome reaction

in ejaculated goat spermatozoa by preincubation in chemically defined

medium. J Exp Zool 1989;249:322–8.

23. Kusunoki H, Kato S, Kanda S. Induction of the acrosome reaction in goat

spermatozoa in simple physiological salt solution. J Exp Zool 1989;250:

346–8.

24. Talbot P, Chacon RS. A triple-stain technique for evaluating normal



acrosome reactions of human sperm. J Exp Zool 1981;215:201–8.

25. Tanaka A. A new sperm collection method for in-vitro fertilization: collection

at tail of epididymis. Hum Reprod 1992;7:838–40.

26. Tanaka A, Nagayoshi M, Awata S, Mawatari Y, Tanaka I, Kusunoki H.

Completion of meiosis in human primary spermatocytes through in vitro

coculture with Vero cells. Fertil Steril 2003;79:795–801.

27. Tanaka A, Nagayoshi M, Awata S, Tanaka I, Kusunoki H. Differentiation of

human round spermatids into motile spermatozoa through in vitro coculture

with Vero cells. Reprod Med Biol 2009;8:169–75.

28. Verheyen G, De Croo I, Tournaye H, Pletincx I, Devroey P, van

Steirteghem AC. Comparison of four mechanical methods to retrieve

spermatozoa from testicular tissue. Hum Reprod 1995;10:2956–9.

29. Blanchard Y, Lavault MT, Quernee D, Le Lannou D, Lobel B, Lescoat D.

Preparation of spermatogenic cell populations at specific stages of differentiation

in the human. Mol Reprod Dev 1991;30:275–82.

30. Mansour RT, Fahmy IM, Taha AK, Tawab NA, Serour GI, Aboulghar MA.

Intracytoplasmic spermatid injection can result in the delivery of normal

offspring. J Androl 2003;24:757–64.

31. Clermont Y. The cycle of the seminiferous epithelium in man. Am J Anat

1963;112:35–51.

32. de Kretser DM. Ultrastructural features of human spermiogenesis.

Z Zellforsch Mikrosk Anat 1969;98:477–505.

33. de Kretser DM, Kerr JB. The cytology of the testis. In: Knobil E, Neill J,

Greenwald GS, Markest CL, editors. The physiology of reproduction. New

York: Raven Press; 1994:1177–290.

34. Zamboni L, Zemjanis R, Stefanini M. The fine structure of monkey and human

spermatozoa. Anat Rec 1971;169:129–54.

35. Holstein AF, Roosen-Runge EC. Atlas of human spermatogenesis. Berlin:

Grosse; 1981.

36. Johannisson R, Rehder H, Wendt V, Schwinger E. Spermatogenesis in two

patients with the fragile X syndrome I. Histology: light and electron microscopy.

Hum Genet 1987;76:141–7.

37. Auger J, Dadoune J-P. Nuclear status of human sperm cells by transmission

electron microscopy and image cytometry: changes in nuclear shape and

chromatin texture during spermiogenesis and epididymal transit. Biol

Reprod 1993;49:166–75.

38. Golan R, Cooper TG, Oschry Y, Oberpenning F, Schulze H, Shochat L, et al.

Changes in chromatin condensation of human spermatozoa during

epididymal transit as determined by flow cytometry. Hum Reprod 1966;

11:1457–62.

39. Thundathil J, Palasz AT, Barth AD, Mapletoft RJ. Fertilization characteristics

and in vitro embryo production with bovine sperm containing multiple



nuclear vacuoles. Mol Reprod Dev 1998;50:328–33.

320

Dostları ilə paylaş:


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©muhaz.org 2017
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə