Instrucţiuni pentru testarea migrării aminelor aromatice primare de pe articolele de bucătărie din poliamide

4 PROTOCOL PRIN BY HPLC-DAD

Acest protocol a fost validat prin validarea unui singur laborator de EURL (JRC) şi validare UE organizată de NRL-DE (BfR) (raport: REF 2009)

4.1 Principiu

Eşantioanele apoase de simulant sunt supuse unei etape de concentrare pe o coloană de schimb cationic. Soluţiile eluţionate sunt analizate de HPLC cu detecţie ultra violetă (UV). Limitele inferioare de detecţie sunt obţinute utilizând un volum mare de injecţie şi o concentraţie mare a acestui volum printr-o procedură de spălare în contracurent a precoloanei. Confirmarea identităţii PAA se face cu detecţie de vector diodă.

4.2 Materiale şi substanţe chimice

NOTĂ: Toţi reactivii trebuie să aibă o calitate analitică şi să fie adecvaţi pentru HPLC. În absenţa prevederilor contrare, sunt vizate soluţiile apoase.

1. Analiţi şi substanţe chimice

1,3-Phenylendiamine, nr. CAS 00108-45-2, C6H8N2, masă moleculară 108,14 g/mol

2,6-Toluenediamine (2,6 TDA), CAS 823-40-5, C7H10N2, MW: 122,2 g/mol

2,4-Toluenediamine (2,4 TDA), CAS 95-80-7, C7H10N2, MW 122,2 g/mol

1,5-Diaminonaphthalene, CAS 2243-62-1, C10H10N2, MW 158,2 g/mol

Anilină, CAS 142-04-1, C6H7N HCI, MW 129,6 g/mol

4,4'-Oxydianiline, CAS 101-80-4, C12H12N20, MW 200,2 g/mol

4,4'-Diaminodiphenylmethane (4,4'-MDA), CAS 101-77-9, C13H14N2, MW: 198,3 g/mol

3,3'-Dimethylbenzidine, CAS xxxxx

2,2'- Diaminodifenilmetan (2,2'-MDA), CAS

2,4'- Diaminodifenilmetan (2,4'-MDA), CAS

Metanol

acid acetic pur

Acetat de sodiu anhidru

Trisodium citrat dezhidratat, masă moleculară: 294,2 g/mol

4.2.2 Soluţii

1. 
   Tampon citrat (c = 0,1 mol/l)
   

2. 
   Soluţie eluţie
   

70 vol% 0,1 M tampon citrat + 30 vol% metanol

3 % acid acetic (m/v)

3. 
   Soluţie de stoc
   

Se cântăresc exact 3-4 mg din fiecare analit într-o fiolă gradată de 25 ml, se dizolvă cu metanol, se umple până la marcaj şi se amestecă cu atenţie.

NOTĂ: soluţia de stoc poate fi depozitată în frigider la 4 °C până la 1 săptămână

4. 
   Soluţie diluată de stoc
   

Se transferă 2 ml de soluţie de stoc cu pipeta într-o fiolă gradată de 25 ml, se umple până la marcaj cu soluţie de eluţie (12.2.2) şi se amestecă.

5. 
   Soluţii standard (10-250 μg/l)
   

Se adaugă 4 ml apă distilată într-o serie de fiole gradate de 10 ml. Se transferă cu ajutorul unei micro-siringi 10, 30, 50, 100 şi 250 μl de soluţie diluată de stoc în fiole, se umple până la marcaj cu soluţie de eluţie (3.2.1.2) şi se amestecă.

4.2.3 Aparatură

PRS-coloane de extracţie a fazei solide (acid propilsulfonic, 500 mg, Varian Bond Elut Art. No. 1210-2039)
Cromatograf lichide de înaltă performanţă cu buclă de injecţie 100 μl, detector variabil UV şi echipament de spălate precoloană în contracurent.
Coloane HPLC: Următoarele coloane sunt adecvate:

Precoloană: Nucleosil 100- 5 C18 30*3 mm I D.

Coloană: Nucleodur C18, Gravitaţie 3 μ, 250*3 mm I D.

4.3 Proceduri

4.3.1 Etapa de concentraţie cu coloană PRS

Procedura de concentraţie se efectuează cu 50 ml soluţie de migrare. Acidul acetic (3 %) are un pH de 2,5, deci soluţia de migrare acidă poate fi aplicată direct în coloanele PRS. Soluţia apoasă de migrare trebuie acidificată prin adăugarea de 1,5 ml de acid acetic pur la 50 ml de soluţie.
Echilibrarea coloanelor PRS se realizează cu 1) 2 x 3 ml metanol şi 2) 2 x 3 ml 3 % acid acetic. Coloanele nu sunt lăsate să se usuce. Cu ajutorul rezervoarelor soluţiile eşantion sunt aplicate pe coloane, paharul şi rezervorul sunt clătite de două ori cu 2 ml acid acetic 3%. Apoi coloana se usucă prin sucţiune timp de 30 secunde şi se eliberează aminele cu 3 ml soluţie de eluţie (12.2.2) încet în fiola gradată de 5 ml. Acest lucru se face în paşi de 1 ml uscându-se coloanele prin sucţiune. Apoi se diluează până la marcaj cu apă dublu distilată (soluţie eşantion concentrată).

4.3.2 Condiţii HPLC

Următoarele condiţii au fost dovedite drept adecvate

Volum injecţie 100 i

Solvent A 0,01 mol/l acetat sodiu pH=7,2

Solvent B metanol

Debit coloană 0.300 ml/min

Temperatură coloană 30.0 °C

Lungime de undă 230, 240, 280 nm

Timp	Solvent B
0,00 min	0,0 %
2,50 min	21,1 %
42,00 min	65,3 %
43,00 min	100,0 %
50,00 min	100,0 %
53,00 min	0,0 %
59,90 min	0,0 %
Fără post-timp
Valoarea de schimbare a coloanei
Timp	Solvent
0,00 min	Fără spălare în contracurent
0,80 min	Cu spălare în contracurent
53,00 min	Fără spălare în contracurent

Post-timp 15,00 min

Volum repaus 0,9 ml

4.3.3 Calibrare HPLC

Calibrarea se efectuează prin injectarea soluţiilor standard în HPLC în condiţiile descrise la articolul 5.2. Datorită etapei de îmbogăţire (5.1) soluţiile standard reprezintă soluţiile de migrare, care au o concentraţie de 10 ori mai redusă.
Pentru fiecare amină se trasează o curbă de calibrare, cu cele mai mari suprafeţe la lungimile de undă cu cea mai mare absorbţie în funcţie de valorile concentraţiei (dimensiune μg/l).
NOTĂ: Curbele de calibrare trebuie să fie liniare iar coeficientul de corelare trebuie să fie cel puţin 0,995.

NOTĂ: Figura 1 prezintă o cromatogramă standard cu toţi analiţii

NOTE: Figura 2 oferă o prezentare a coeficienţilor de corelare şi a lungimilor de undă maxime.

4.3.4 Confirmarea identităţii prin detecţia de vector diodă

Spectrele valorilor maxime sunt luate din domeniul 210-400 nm şi comparate cu spectrele standard. Dacă profilele spectrale suprapuse ale valorilor maxime sunt identice cu spectrele standardelor, identitatea substanţei este confirmată.

4.3.5 Evaluarea datelor

Calculul nivelului de analit

Calculul se efectuează prin metoda standardului extern utilizând zonele de vârf. Suprafeţele standardelor şi concentraţiilor în soluţiile de migrare sunt supuse calculului regresiei. Rezultatul este o funcţie liniară:

Migrarea specifică (μg/l) = A + B x Suprafaţă