Izolarea unor mutante de Hansenula polymorpha ncy 495 cu capacitate ridicată de biosinteză a alcooloxidazei

Figura 14. Consumul de fosfor, potasiu şi azot în cadrul bioprocesului de cultivare în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt
Evoluţia concentraţiilor biomasei celulare în cadrul cultivării tulpinii Hansenula polymorpha 6 în sistem batch pe substrat mixt este prezentată în Tabelul 21.
Tabelul 21. Evoluţia funcţiilor X (t) şi  (t) din cadrul bioprocesului în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6, pe substrat mixt.

Nr. probe	1	2	3	4	5	6	7	8	9
t, ore	8	12	16	20	24	28	32	36	40
X, g×l^-1	4,00	5,60	7,50	10,30	14,20	23,40	30,65	38,25	46,85
ln X	1,38	1,72	2,01	2,33	2,65	3,15	3,42	3,64	3,85
ln X – ln (X – 1)	-	0,34	0,29	0,32	0,32	0,50	0,27	0,22	0,21
, h^-1	-	0,085	0,073	0,080	0,080	0,125	0,068	0,055	0,053

_mediu = 0,077 h^-1; T_D = = = 8,96 h; _max = = 0,125 h^-1

Viteza maximă de creştere celulară în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt a fost de 0,125 h^-1, iar pe glucoză de 0,168 h^-1.

Cultivarea continuă s-a realizat la o rată de diluţie de 0,140 h^-1, timp de 72 de ore.

Rezultatele cultivării tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6 în sistem continuu, pe substrat mixt sunt prezentate în Tabelul 22.

Tabelul 22. Bioproces de cultivare în flux continuu a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt (metanol – glucoză) la D = 0,140 h^-1.

Durată bioproces, ore	Metanol, %	Glucoză, %	WCW, g×l^-1	DCW, g×l^-1	P, ppm	K, ppm	N, ppm	Fe, ppm	C.P., %
0	0,295	0,048	147,30	46,85	130	225	275	1,7	48,70
8	0,187	0,055	140,50	43,20	137	240	280	2,3	48,90
16	0,196	0,040	138,90	38,40	141	243	290	2,6	47,50
24	0,275	0,048	136,40	37,50	146	237	282	2,2	49,20
32	0,206	0,056	137,50	37,80	145	247	280	2,4	50,25
40	0,214	0,046	135,40	36,20	152	250	275	2,5	49,30
48	0,195	0,051	136,90	38,10	150	253	277	2,1	48,70
56	0,283	0,042	138,20	37,60	154	260	290	2,6	49,50
64	0,185	0,053	137,10	38,25	153	258	288	2,6	50,50
72	0,203	0,051	137,35	38,30	155	255	285	2,5	49,30

Durata bioprocesului a fost de 72 de ore, iar concentraţia biomasei de 39 g×l^-1. Debitul de alimentare corespunzător acestei rate de diluţie a fost de 1,12 l×h^-1. S-au obţinut 3,145 kg biomasă, consumându-se 7,076 kg substrat mixt şi 2,673 kg amoniac. Consumul specific de substrat mixt a fost de 2,25 (kg/kg), de amoniac 0,85 (kg/kg), iar de metanol 1,80 (kg/kg). Productivitatea celulară la această rată de diluţie a fost de 5,46 g×l^-1×h^-1, iar randamentul de bioconversie a substratului mixt în biomasă a fost de 44,45%, biomasa proteică având un conţinut în proteină totală de 49,18%. Timpul de dublare a concentraţiei celulare la D = 0,140 h^-1 a fost:

T_D = = 4,92 ore

Comparând rezultatele obţinute prin cultivarea drojdiei Hansenula polymorpha 15 – 50 şi Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt (metanol – glucoză), se observă că ele sunt superioare celor obţinute pe o singură sursă de carbon, atât în sistem batch, cât şi în sistem continuu (Tabelul 23).

Tabelul 23. Rezultatele comparative privind procesul de cultivare a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 pe substrat metanol şi a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt (metanol – glucoză).

Tulpina de drojdie	Sistem de cultivare	DCW, g×l^-1	Consum specific substrat, g/g	Consum specific amoniac, g/g	Rată de diluţie, h^-1	max, h^-1	Produc-tivitate, g×l^-1×h^-1	Randa- ment de biocon-versie, %	C.P., %
Hansenula polymorpha 15 – 50 Substrat metanol	Batch	43,92	2,63	1,76	-	0,130	-	40,00	45,00
	Continuu	36,16	2,30	0,96	0,130	-	4,70	43,47	47,05
Hansenula polymorpha 6 Substrat mixt	Batch	46,85	2,50	1,05	-	0,125	-	40,10	48,70
	Continuu	39	2,25	0,85	0,140	-	5,46	44,45	49,18

Consumarea simultană a două surse de carbon (metanol – glucoză) în sistem batch, de către tulpina mutantă Hansenula polymorpha 6 este pentru prima dată prezentată în literatura de specialitate. În funcţie de raportul de amestecare a celor două substraturi, creşte viteza de utilizare simultană a lor, care influenţează viteza de creştere şi de formare a biomasei.

În cercetările efectuate cu tulpina mutantă Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt în raport de 4:1 (metanol – glucoză) în sistem batch s-a obţinut o concentraţie a biomasei celulare de 25 g×l^-1, iar la raport 6:1, concentraţia biomasei celulare a crescut până la 46 g×l^-1 în sistem batch şi 39 g×l^-1 în sistem continuu la rata de diluţie de 0,140 h^-1.

Studiile prezentate în literatura de specialitate de către Egli şi alţii [17], Brinkmann şi alţii [18], Bryers şi Yeh [19], Bobel şi alţii [20] se referă la cultivarea diferitelor tulpini de Hansenula polymorpha pe substraturi mixte (inclusiv metanol – glucoză), dar numai în sistem continuu la diferite raporturi dintre metanol – glucoză şi la diferite rate de diluţie, de la 0,1 h^-1 la 0,3 h^-1, constatându-se că, la rate de diluţie sub 0,2 h^-1 are loc consumarea simultană a celor două surse de carbon, iar la rate de diluţie mai mari de 0,2 h^-1, se consumă de preferinţă glucoza, metanolul acumulându-se în mediul de cultură.

Rezultatele obţinute cu tulpina Hansenula polymorpha 6 sunt comparabile cu cele prezentate în literatura de specialitate în ceea ce priveşte raportul dintre cele două surse de carbon şi rata de diluţie optimă, 0,140 h^-1, la care are loc utilizarea simultană a lor, dar sunt mai mari decât cele referitoare la concentraţia biomasei celulare şi la randamentul de bioconversie (Tabelul 24).
Tabelul 24. Comparaţie între rezultatele din literatura de specialitate referitoare la cultivarea diferitelor tulpini de Hansenula polymorpha pe substrat mixt şi rezultatele obţinute cu tulpina mutantă Hansenula polymorpha 6.

Tulpina de drojdie	Rată de diluţie, (h^-1)	DCW, (g×l^-1)	Raport C1 – C6	Randament de bioconversie, %
Hansenula polymorpha (studii de literatură)	0,1 – 0,35	2 - 22	3 – 1 4 – 1 5,6 – 1 8 - 1	33 – 39
Hansenula polymorpha 6	0,14	25 - 46	4 – 1 6 - 1	40,10 – 44,45