Izolarea unor mutante de Hansenula polymorpha ncy 495 cu capacitate ridicată de biosinteză a alcooloxidazei
Yüklə 0,54 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- 3.1. Taxonomia drojdiilor metilotrofe
- Tabelul 1
- Grupa Specia Conţinut, GC% Sistem ubiquinonic
- 3.2. Caracterizarea drojdiilor metilotrofe
- 3.3. Elemente specifice de ultrastructură
- 3.4. Biochimia oxidării metanolului la drojdiile metilotrofe
- 3.4.1. Oxidarea metanolului la formaldehidă
- 3.4.1.2. Sinteza alcooloxidazei
- Figura 1
- 3.4.1.3. Importul alcooloxidazei în peroxizomi
- 3.4.2. Oxidarea formaldehidei la formiat
- 3.4.3. Oxidarea formiatului la CO 2
- Figura 2 [38]. Figura 2.
- 3.4.4. Asimilarea metanolului
- Figura 2
- 3.5. Metabolismul diauxic al drojdiilor metilotrofe
- 3.5.1. Creşterea pe amestecuri C 1 (metanol) – C 6 (glucoză)
- Figura 3
|
3. Biotehnologia drojdiilor metilotrofe Introducere Creşterea continuă a necesarului de proteine pentru alimentaţia umană şi animală a determinat dezvoltarea unor noi posibilităţi de obţinere a proteinelor cu proprietăţi superioare. În aceste condiţii se presupune că acoperirea necesarului de proteine se va putea realiza atât prin dezvoltarea resurselor tradiţionale bazate pe agricultură, zootehnie, piscicultură, cultura algelor, cât şi prin dezvoltarea producţiei industriale de proteine bazată pe procese de biosinteză, cunoscute în literatura de specialitate sub denumirea de SCP (Single Cell Protein). Pentru cel din urmă caz se are în vedere atât existenţa unor materiale secundare şi subproduse din agricultură şi industrie (ape reziduale din industria alimentară şi zootehnie, subproduse din sectorul de celuloză şi hârtie, ape de condens de la fabricarea unor îngrăşăminte chimice, ape reziduale metanolice) cât şi disponibilitatea în unele ţări a metanolului, etanolului şi a unor zaharide. Microorganismele cele mai frecvent utilizate ca sursă de proteine în nutriţia omului şi animalelor sunt drojdiile. Dintre materiile prime care s-au impus până în prezent ca substrat (C1) pentru cultivarea microorganismelor, metanolul continuă să se situeze pe primul loc, datorită avantajelor sale tehnologice şi economice. Mai ieftin decât alte materii prime, cu un domeniu de întrebuinţări mai restrâns decât glucidele şi etanolul, mai puţin periculos la manipulare decât metanul, perfect miscibil cu mediul apos de cultivare, permiţând biosinteza de concentrate proteice lipsite de toxicitate, metanolul continuă să rămânâ în atenţia specialiştilor, evoluţia în viitor a preţului acestuia fiind în conexiune directă cu posibila extindere de utilizare ca înlocuitor a unor carburanţi. Pentru obţinerea de proteine unicelulare din metanol ca sursă de carbon şi energie există două posibilităţi: folosirea drojdiilor sau a bacteriilor metilotrofe. În cazul folosirii drojdiilor s-a plecat de la premiza că aceste microorganisme sunt utilizate de foarte multă vreme în alimentaţia umană şi animală şi deci vor trece uşor bariera psihologică reprezentată de acest nou tip de proteine. Deasemenea, se remarcă faptul că drojdiile conţin vitamine, sunt mai rezistente la contaminarea cu germeni străini în condiîiile unui pH acid, se pretează mai bine la asocierea cu alimente clasice, se pot separa uşor din mediul de cultură şi au un conţinut redus de acizi nucleici (2 – 6%). În procesul de biosinteză a proteinelor, metanolul, amoniacul, oxigenul şi sărurile minerale sunt transformate în masă celulară, metaboliţi extracelulari, dioxid de carbon, apă şi căldură. În dezvoltarea proceselor biotehnologice pentru obţinerea de proteine din drojdii metilotrofe, principalele etape sunt: (a) - Evaluarea şi optimizarea parametrilor biologici la nivel de laborator şi micropilot care include: izolarea şi selecţia drojdiilor metilotrofe, studii de metabolism şi studii genetice, îmbunătăţirea performanţelor productive ale tulpinilor selecţionate; (b) - Elaborarea procesului tehnologic la nivel de pilot industrial presupune: utilizarea unui bioreactor adecvat, stabilirea sistemului de cultivare, prelucrarea mediului de cultură, refolosirea apelor reziduale, analize biochimice pe flux şi caracterizarea produsului finit, calcul de economicitate, teste pe biomodele animale sub aspect farmacologic, mutagen, cancerigen, stabilirea valorii nutritive şi a efectului bioproductiv. Tehnologia elaborată la nivel de laborator este verificată şi optimizată la nivel de micropilot şi pilot industrial, când se stabilesc modalităţile cele mai potrivite pentru prelucrarea mediului de cultură şi obţinerea proteinelor la randamente superioare [1]. Deşi utilizarea metanolului ca sursă de carbon a fost raportată prima dată la bacterii, primele levuri metilotrofe au fost izolate după 1970 [2]. Cu această ocazie au fost investigate şi drojdiile prezente în diferite colecţii internaţionale, pentru capacitatea lor de a utiliza metanolul (găsindu-se printre acestea specii care aparţin genurilor: Hansenula, Pichia, Candida, Torulopsis, Rhodotorula şi Saccharomyces). Dintre levurile izolate în anii ’70 este de remarcat Hansenula polymorpha şi Pichia methanotherma. Prima specie a fost izolată din solul colectat din regiunile tropicale, dovedindu-se termotolerantă [6]. O altă tulpină de Hansenula polymorpha, care este şi halofilă, a fost izolată din apa de mare [7]. La obţinerea proteinelor din metanol, principala problemă este aceea de a selecţiona o tulpină capabilă de a transforma metanolul în proteină la randamente de interes industrial şi care să prezinte următoarele caracteristici: mediu nutritiv puţin pretenţios, randamente superioare în aminoacizi esenţiali, valoare biologică ridicată, absenţa totală a toxicităţii, producţie stabilă. Drojdiile metilotrofe sunt capabile să metabolizeze metanolul ca singură sursă de carbon şi energie, fie o varietate de substraturi mixte: metanol – glucoză, metanol – xiloză, metanol – glicerol. Metabolizarea metanolului începe în peroxizomi, unde este oxidat la formaldehidă via metanol – oxidază, cu producerea concomitentă de apă oxigenată. Efectele dăunătoare ale unor concentraţii crescute de H2O2sunt anulate de valorile ridicate ale activităţii metanol – catalazei din peroxizomi. În culturile chemostat, cu limitare de carbon, drojdiile metilotrofe pot asimila ambele substraturi simultan. În timp ce glucoza este metabolizată prin glicoliză sau prin ciclul pentozofosfatului, producând unităţi C3 pentru dezasimilaţie şi asmilaţie, carbonul din metanol este asimilat prin ciclul xilulozo-monofosfatului, în direcţie contrară. Utilizarea unor substraturi mixte în producţia de biomasă proteică, vizează mărirea vitezei de creştere a microorganismului în scopul producerii unei cantităţi cât mai mari de biomasă sau produse. În timpul creşterii pe amestecuri C1 – C6 viteza specifică de consum a metanolului creşte linear cu viteza de creştere celulară, până când aceasta este afectată, în metabolismul celulelor, de trecerea de la utilizarea unui substrat mixt la utilizarea unui singur substrat. 3.1. Taxonomia drojdiilor metilotrofe Cu toate că drojdiile consumatoare de metanol reprezintă un grup important de microorganisme utilizate pentru producţia de biomasă, sistematica lor nu a tost studiată în detaliu. In 1980, Lee si Komagata au introdus în clasificarea drojdiilor metilotrofe. alături de criteriile descrise anterior, şi criterii chemotaxonomice. pe care autorii le-au aplicat. atăt la o serie de tulpini nou izolate în Japonia, cât şi la tulpini de drojdii metilotrofe apaiţnând unor colecţii internationale [12]. Criteriile chemotaxonomice introduse au fost urmatoarele: conţinutul în guanină şi citozină (% G+C) al ADN, compoziţia peretelui celular (spectre RMN ale mananilor). sistemele ubiquinonice, tipul electroforetic al alcooloxidazelor. Pe baza acestor criterii, drojdiile consumatoare de metanol au fost împărţite în 4 mari grupe: Grupa 1 cuprinde numai tulpinile de Candida boidinii, care se caracterizează printr-un conţinut mai scăzut în GC, comparativ cu celelalte drojdii consumatoare de metanol. Grupa a 2-a cuprinde aproape toate drojdiile consumatoare de metanol cunoscute, cu excepţia C. boidinii si Hanseniila capsulata. Continulul de GC al acestui grup este cuprins între 34.5 şi 50,2 %. Sistemul ubiquinonic este Q7. Tipul electroforetic al alcooloxidazelor este I, II si III şi variază în interiorul grupului. Această grupă poate fi subdivizată, la randul său în trei sau 4 subgrupe, tot pe baza unor criterii chemotaxonomice. Toate drojdiile metilotrofe din genul Hansenula aparţin acestei grupe cu excepţia H. capsulata. Conţinutul % în GC al ADN al acestor drojdii este cuprins între 45,1-50,24 %, iar tipul electroforetic al alcooloxidazei este II cu excepţia H. philodendra. Toate aceste date par să ateste o corelaţie strânsă între spcciile consumatoare de metanol din cadrul genului Hansenula. Grupa a 3-a conţine numai Pichia cellobiosa. Spectrul RMN al mananilor peretelui celular şi tipul electroforetic al alcooloxidazelor sunt similare cu cele ale drojdiilor din grupa a 2-a, dar sistemul ubiquinonic caracteristic este Qs cu cantităţi mici de Q7 - diferit de cel al altor drojdii metilotrofe. Grupa a 4-a cuprinde speciile Hansenuila capsulala (Torulopsis molischiana) şi Pichia pastoris. Sistemul uhiquinonic este Qs. Drojdiile consumatoare de metanol izolate de Lee si Komagata se încadrează în genurile Hansenula, Pichia. Torulopsis, Candida. Ca şi drojdiile ascosporogene, Hansenula si Pichia sunt considerate similare, delimitarca lor fiind determinată numai de capacitatea de utilizare a azotatului de potasiu. Ele sunt similare nu numai din punct de vedere al caracteristicilor de cultivare si fiziologice, ci şi din acela al proprietăţilor chemotaxonomice şi anume: conţinutul în (% GC) al ADN, sistemul ubiquinonic şi al spectrelor RMN ale mananilor din pereţii celulari. In Tabelul 1 este prezentată gruparea drojdiilor consumatoare de metanol pe baza criteriilor chemotaxonomice descrise mai sus. Tabelul 1. Gruparea drojdiilor consumatoarc de metanol pe baza unor caracteristici chemotaxonomice [12].
GC % reprezintă procentui de guanină+citozină din ADN. 3.2. Caracterizarea drojdiilor metilotrofe Desigur, caracterizarea drojdiilor metilotrofe se suprapune, până la un anumit punct, cu identificarea lor, adică, o serie întreagă de carcateristici ale drojdiilor mctilotrofe reies chiar la efectuarea testelor de importanţă primară (care permit clasificarea unei drojdii la nivel de genă, chiar de specie) precum şi a testelor de confirmare. [9]. Pentru tulpinile de interes industrial este necesar însă o caracterizare cât mai completă a lor, caracteristicile de producţie ocupând un loc important. Dintre caracteristicile de producţie enumerăm: mărimea fazei lag, pH optim, temperatura optimă, randamentui de bioconversie a metanolului la biomasa, consumul specific de metanol, rata specifică de creştere, rata de diluţie, viteza transferului de oxigen, coeficientul transferului de masă în funcţie de diferiţi parametri, conţinutul în proteine. Deci, caracterizarea drojdiilor metilotrofe este impusă de exigenţele elaborării unui proces tehnologic industrial şi, legat de aceasta, de exigenţele efectuării lucrărilor de mutageneză şi/sau inginerie genetică. La rândul său, caracterizarea tulpinilor de lucru furnizează informaţiile necesare stahilirii principalelor direcţii de imbunătăţire a performanţelor economice a tulpinilor de drojdii metilotrofe prin mutageneză, prospectând totodată posibilităţile de îmbunătăţire a performanţelor lor prin tehnici de inginerie genetică. La microorganismele metilotrofe interesează, de asemenea, calea de asimilare a metanolului, cunoscut fiind faptul că asimilarea metanolului pe calea ribulozomonofosfatului este cea mai eficientă din punct de vedere energetic. Din punct de vedere al capacităţii lor de a asimila metanolul ca unică sursă de carbon şi energie, microorganismele metilotrofe pot fi: strict consumatoare de metanol care cresc numai pe compuşi C1 cum ar fi metanul, metanolul, metilamina şi facultativ consumatoare de: metanol, care cresc şi pe alte substraturi, cum ar fi glucoza sau succinatul. 3.3. Elemente specifice de ultrastructură Caracteristica ultrastructurală esenţială a celulor drojdiilor metilotrofe, ca urmare a creşterii pe metanol, este apariţia unor organite specifice: peroxizomi. Peroxizomii sunt delimitaţi de o singură membrană, care din punct de vedere ultrastructural este organizată ca toate membranele biologice. Studiile de ultrastructură şi de electroforeză au indicat că la nivelul peroxizomilor se găsesc trei enzime: alcooloxidaza, catalaza şi dihidroxi-aceton-sintaza. Adesea, în interiorul peroxizomului apare o structură numită cristaloid. Se presupune că structura cristaloidă ar fi alcătuită din alcooloxidază şi catalază, enzime dispuse într-o anumită arhitectură specifică. Alţii apreciază că matricea cristaloidului ar fi alcatuită numai din alcooloxidază, iar catalaza ar fi liberă. neprinsă în această structură [27]. 3.4. Biochimia oxidării metanolului la drojdiile metilotrofe Un factor critic în găsirea unui microorganism convenabil pentru producerea de proteine este eficienţa cu care acesta transformă substratul de carbon din mediul de cultură. Aceasta poate fi stabilită, printre altele, prin elucidarea căilor metabolice de asimilare a metanolului. Pentru necesităţile practicii, problema care se pune este aceea a determinării activităţii unui număr restrâns de enzime, care să furnizeze maximum de informaţii. Enzimele respective trebuie să catalizeze reacţii cheie în căile metabolice specifice tulpinii date. Este de remarcat faptul că există o uniformitate a căii metabolict, a metanolului la drojdiile metilotrofe. În linii mari, principalele reacţii presupun oxidarea metanolului la formaldehidă. şi oxidarea acesteia în trepte până la CO2 în calea catabolică, iar în calea anabolică. pătrunderea în ciclul xilulozo-5-fosfatului, de unde rezultă gliceraldehid-3-fosfat, ce poate fi implicat în sinteza de compuşi celulari. 3.4.1. Oxidarea metanolului la formaldehidă Prima treaptă în calea metaholică a metanolului este constituită de oxidarea acestuia la formaldehidă, reacţie catalizată de enzima alcooloxidază după următoarea reacţie: CH3OH + O2 HCHO + H2O2 În această recaţie O2, este folosit ca acceptor de electroni. 3.4.1.1. Alcooloxidaza Alcooloxidaza este un octomer de aproximativ 600 kDa, constituită din 8 unităţi identice, fiecare conţinând o moleculă de flavindinucleotid oxidat (FAD). În ciuda eforturilor de a descifra structura moleculara complexă a enzimei, acest lucru încă nu a fost realizat. Cercetări recente arată că la specia Hansenula polymorpha cultivată pe metanol se formează două tipuri de FAD: cel clasic şi m-FAD. Conversia FAD clasic în m-FAD se observă la purificarea enzimei alcooloxidazâ din celulele dezvoltate în sistem batch şi continuu, când echilibrul între cele două forme variază în proporţie de 5- 95 %. în funcţie de condiţiile de cultivare şi de stocare. Alcooloxidaza a fost purificată de la mai multe drojdii metilotrofe: H. polymorpha, Pichia pastoris, Kloeckera sp. La toate aceste specii, preparatele enzimei au prezentat proprietăţi fizice, chimice şi enzimologice similare [24, 37]. Spectrul de absorbţie al preparatelor enzimatice obţinute de la drojdiile metilotrofe este deosebit de cel al enzimelor flavinice ale altor specii. Absorbţia mai mare la =373 nm decât la =461 nm indică prezenţa unor radicali flavinici anionici. De asemenea, spectrul de absorbţie indică prezenţa unui cromofor suplimentar, altul decât FAD. S-a dovedit că alcooloxidaza de Hansenula polymorpha conţine 5 semiquinone flavmice "roşii" şi 2 molecule flavinice oxidate per octomer. Adăugarea alcoolului metilic are ca rezultat reducerea celor două molecule flavinice oxidate şi nu afectează semiquinonele flavinice. 3.4.1.2. Sinteza alcooloxidazei Ca toate enzimele peroxizomale studiate până acum, alcooloxidaza este codificată de o genă nucleară. Genele AOX de la H. polyniorplia, C. boidinii şi P. pastoris au fost izolatc şi secvenţionate. Astfel, în H. polymorpha şi C. boiilinii s-a găsit câte o singură genă, iar în Pichia pastoris, două gene (AOX1 şi AOX2). Gena AOX de la H. polymorpha conţine un cadru deschis citirii de 2.046 nucleotide, fără secvenţe necodificatoare, care să o întrerupă. Analiza secvenţială a genelor care codifica alcooloxidaza a indicat o similitudine extinsă a secvenţclor pentru alcooloxidazele celor trei levuri [25]. Secvenţa de aminoacizi de la capătul N-terminal al monomenlor alcooloxidazei sugerează că aceasta ar putea fi regiunea implicată în legarea nucleotidului adenilic monofosforilat de FAD, deoarece această secvenţă se găseşte frecvent în proteinele ce leagă nucleotide [31]. Regiunea N-terminală implicată în legare conţine 30-35 (chiar42) aminoacizi, cu 11 aminoacizi foarte bine conservaţi (Figura 1). 
Figura 1. Secvenţa dc aminoacizi din alcooloxidaza speciei H. Polymorpha. Investigaţiile făcute prin mutageneză „situs direcţionată" asupra regiunii de legare, şi anume prin substituirea secvenţelor pentru glicină din poziţiile 13, 15 şi 18 şi a celor pentru acid glutamic din poziţiile 39 şi 42 au indicat faptul că glicina din poziţia 13 şi 18 permite lanţului polipeptidic să se organizeze într-o structură compactă cu multe interacţii hidrofobe între structurile şi helixul . Mutaţiile în secvenţele ce codifică aceşti aminoacizi previn înfăşurarea polipeptidului, dar nu interferă cu legarea la FAD, în timp ce glicina din poziţia 15 permite pirofosfatului din molecula de FAD să fie în vecinătatea capătului terminal al -helixului, datorită ahsenţei unui lanţ lateral şi participă la legarea FAD, dar nu şi în procesul de înfăşurare a catenei polipeptidice. Modelele structurale sugerează că se pot forma legături de hidrogen între oxigenul carboxilic al unui rest de aminoacid ce se găseşte la capătul celei de-a doua structuri P şi grupările hidroxilice ale ribozei din mononucleotidul adenilic din FAD. Se presupune că acidul glutamic din poziţia 39 este implicat în formarea acestor legături, fapt dovedit şi prin studiile în care s-a folosit mutageneza „situs direcţionată”. În concluzie, rcsturile de glicină din poziţiile 13 şi 18 sunt implicate în înfăşurarea în jurul FAD, iar aminoacizii din poziţiile 15 şi 39 interferă cu legarea FAD. O înfăşurare corectă a secvenţei N-terminale formând cuta de legare a nucleotidului va fi crucială
Această structură proteică înfăşurată în jurul nucleotidului poartă numele de „cuta Rossman" sau cuta şi leagă nucleotidul monofosforilat al adeninei din FAD sau, în cazul unor enzime ce au dinucleotide ca şi cofactori, nucleotidul monofosforilat al adeninei din structura NAD. Toate aceste enzime au proprietatea de a se organiza sub formă de cristale. Inelul flavinic şi lanţul ribitil al FAD sau partea nicotinamidică a NAD sunt legate de alte regiuni ale proteinei. Alcooloxidaza este sintetizată în citosol pe polisomi liberi, sub forma unor polipeptide de 75 kDa, care apoi sunt transportate în peroxizomi fără nici o prelucrare proteolitică. Secvenţele responsabile pentru importul în peroxizomi al alcooloxidazei n-au fost încă identificate. În interiorul peroxizomilor monomerii de alcooloxidază se asamblează în octomeri care formează cristale active. Nu se cunoaştc în ce stadiu al asamblării este legat FAD. Goodman şi alţii au propus un model al căii de asamblare a alcooloxidazei în care
Enzima, în forma sa octomerică, este foarte rezistentă la digestia cu tripsină, pe când monomerul sintetizat " in vitro" este foarte sensibil la această protează. Având în vedere că rezistenţa la atacul proteazelor este o măsură a împachetării proteinei, se poate trage concluzia că monomerul, foarte sensibil, are o structură neîmpachetată, aşa cum au, în general, toţi precursorii proteici. 3.4.1.3. Importul alcooloxidazei în peroxizomi Aşa cum am arătat alcooloxidaza este sintetizată pe polosomi liberi în citosol, urmând să fie apoi dirijată către peroxizomi. Proteinele astfel sintetizate care sunt apoi dirijate spre anumite organite, conţin o informaţie ce reprezintă de fapt o scurtă secvenţă de aminoacizi (secvenţă semnal sau secvenţă ţintă), care le dirijează spre localizarea normală. În cazul microcorpilor, din categoria cărora fac parte şi peroxizomii, secvenţa semnal identificată în luciferaza de la licuriciul nord-american este constituită dintr-un tripeptid localizat la capătul carboxil terminal şi compus din următoarea secvenţă: -Ser-Lys-Leu. Această secvenţă este necesară şi suficientă pentru a dirija diferite proteine de origine animală, vegetală sau din levuri către microcorpi [27]. Experimentele bazate pe studii de mutageneză „situs direcţionată" au dovedit faptul că este permis un oarecare grad de substituire a aminoacizilor. Ar fi posihilă substituirea Leu cu Met, aşa cum se întâmplă în cazul luciferazei de la licuriciul japonez. Dar multe din enzimele peroxizomale, în special cele din levuri, nu conţin aceste secvenţe la capătul carboxil terminal. Unele posedă această secvenţă în interior, lângă capătul C-terminal, dar există îndoieli că această secvenţă internă ar putea acţiona ca secvenţă semnal pentru peroxizomi. Recent s-a dovedit că deleţia acestei secvenţe: interne în cazul aminooxidazei H. Polymorpha nu împiedică pătrunderea enzimei în peroxizomi. Pe de altă parte, s-a demonstrat şi situaţia în care două secvenţe diferite din acil-CoA oxidază, una N-terminală şi una internă sunt insuficiente pentru a dirija această proteină spre peroxizomi. Toate proteinele matricei proxizomale studiate sunt translocate posttranslaţional în peroxizomi. Alcooloxidaza de C. boidinii apare întâi sub formă solubilă în citosol şi numai după un anumit interval de timp poate fi detectată în peroxizomi. În general, o astfel de translocare prin membrană necesită anumiţi factori proteici şi consum energetic. Activitatea alcooloxidazică a fost detectată numai în forma octomerică, ce conţine FAD şi care se găseşte în peroxizomi. În literatura de specialitate există încă puţine date referitoare la mecanismele implicate în asamblarea şi activarea enzimelor din matricea peroxizomală. Ultimele cercetări sugerează că în activarea alcooloxidazei se parcurg mai multe etape: (a)-importul monomerilor inactivi în peroxizomi, la nivelul matricei, monomeri care nu conţin FAD, şi (b)-legarea FAD şi octomerizarea finală. Nu există dovezi experimentale pentru prima ctapă, dar este foarte probabil ca monomerii citosolici să nu contină FAD şi deci să nu prezinte activitate alcooloxidazică. Există dovezi experimentale că legarea FAD şi pătrunderea în peroxizomi sunt procese independente. Legarea FAD are loc cel mai probabil la forma octomerică, deoarece forma octomerică ce a pierdut FAD " in vivo" nu mai leagă FAD în cazul incubării celulelor în mediu cu metanol şi FAD în exces. N-au fost detectaţi niciodată intermediari de tipul tetramerilor şi dimerilor, de unde există părerea că asamblarea ar avea loc într-o singură treaptă. Există supoziţia că asamblarea alcooloxidazei poate fi catalizată de proteinele Chaperons, o familie de proteine recent descrisă care pot media structurarea altor proteine şi uneori asamblarea în oligomeri. [30] Alcooloxidaza este specific indusă de creşterea pe metanol. În urma trecerii pe mediu cu glucoză are loc inactivarea catolică, ce constă în degradarea proteolitică a alcooloxidazei şi apoi dispariţia activităţii alcooloxidazice, urmate şi de degradarea peroxizomilor. De asemenea, în principiu, în absenţa metanolului, care are rol de inductor, enzima nu se sintetizează. Alte surse de carhon, cum sunt glucoza, etanolul au un efect represor asupra sintezei alcooloxidazei. S-a observat însă că la H. polymorpha, în condiţiile în care sursa de carbon este limitată, de exemplu atunci când creşterea se face pe glucoză, are loc o derepresare a sintezei alcooloxidazei, în fază staţionară de creştere, în cultură batch, în ahsenţa metanolului. Acest lucru sugerează că sinteza alcooloxidazei în H. polymorpba este mai degrabă dirijată de represie/derepresie decât de inducţie. Primele două procese sunt determinate de glucoză, iar al treilea de metanol. S-a dovedit, de asemenea, că inducţia sintezei de alcooloxidază are loc şi pe medii de cultură care conţin riboză-metanol, glicerol-metanol, glucoză-metanol, sorbitol- metanol, în cazul limitării sursei de carbon. În nici o situaţie nu s-a înregistrat activitate alcooloxidazică, folosindu-se etanolul ca sursă de carbon sau amestec de etanol-glucoză. La fel ca şi alcooloxidaza, şi celelalte enzime peroxizomale sunt controlate prin mecanisme de inducţie, represie/derepresie. 3.4.1.4. Catalaza În metabolismul drojdiilor metilotrofe, catalaza joacă un rol deosebit de important, datorită faptului că oxidarea metanolului de către alcooloxidază este însoţită de formarea unui produs toxic H2O2, ce este degradat dc catalază. Acest fapt este susţinut de inducerca formării catalazei de către metanol si de localizarea acesteia, alături de alcooloxidază în peroxizomi. Enzima a fost purificată de la mai multe drojdii metilotrofe şi s-a dovedit că are proprietăţi rnolecularo-cinetice asemănătoare cu cele de la Saccharomyces cerevisiae. După unii autori, calalaza are, de asemenea, funcţie peroxidazică, putând oxida metanolul, formaldehida şi formiatul în prezenţa unui exces de H2O2. Surprinzător este faptul că, dacă oxidarea metanolului de către alcooloxidază este puternic inhihată de către H2O2 în cazul oxidării acestuia de către catalază H2O2, are un efect puternic stimulativ. Ca urmare cele două reacţii decurg astfel: CH3OH + O2 CH3OH + H2O2 3.4.2. Oxidarea formaldehidei la formiat Toate drojdiile metilotrofe posedă o dehidrogenază dependentă de glutation care utilizează NAD+ ca acceptor de electroni şi care catalizează oxidarea formaldehidei, atunci când drojdiile sunt crescute pe metanol. Dependenţa formaldehid-dehidrogenazei de glutation se bazează pe faptul că substratul enzimei este un complex, numit S-hidroximetilglutation, care se formează între formaldehidă şi glutation [3, 4]. Oxidarea formaldehidei are loc, ca urmare, după următoarea reacţie: HCHO + GSH HOCH2 – S – G + NAD+ H Formaldehid-dehidrogenaza este localizată în citoplasmă şi are capacilatea de a reduce NAD+ introducând un electron al formaldehidei în lanţul respirator. S-formil glutationul poate fi hidrolizat enzimatic sub acţiunca unei hidrolaze la
H – CGSO Reacţia globală poate fi: HCHO + NAD + H2O 3.4.3. Oxidarea formiatului la CO2 Formiat-dehidrogenaza este enzima care catalizează ultima treaptă a oxidării etanolului în drojdiile rnetilotrofe. Enzima este NAD+-dependentă şi sinteza sa este indusa de metanol şi represată de glucoză. Enzima are o greutate moleculara de 94.000 D şi este compusă din două subunităţi. Se apreciază că această enzimă hidrolizează S-formilglutationul formând complexul enzimă-formiat, ce apoi este oxidat la CO2: HCOOH + NAD+ CO2 + NADH + H+ Oxidarea metanolului la drojdiile metilotrofe este prezentată în Figura 2 [38].
Metanolul este oxidat de alcooloxidază (1) în peroxizoini cu producerea de formaldehidă şi apă oxigenată H2O2, este redusă la apă şi oxigen molecular de catalază (2). Formaldehida poate difuza în citosol, unde reacţionează spontan cu glutationul. Acest complex este oxidat apoi la formiat şi CO2 prin acţiunea formaldehid-dehidrogenazei (3), şi respectiv formiat-dehidrogenazei (4). În acelaşi timp, formaldehida poate reacţiona în peroxizomi cu xilulozo-5-fosfatul (Xu5P) prin intermediul dihidroxiaceton-sintazei (5) cu producere de gliceraldehid 3-fosfat (GAP) şi dihidroxiacetona (DHA). Fosforilarea în citosol a DHA la dihidroxiacetonfosfat prin acţiunea dihidroxiacetonkinazei (DHAK) facilitează producerea de 1, 6 – difosfatfructoză (FBP) de către l, 6 - difosfataldolaza (7) şi defosforilarea sa de către 1,6- difosfatfructoza (S). Reacţiile regeneratoare ce urmeaza recicleaza Xu5P, care reacţionează din nou cu formaldehida. Rezultatul final al căii de oxidare a metanolului este generarea a 1-3 molecule de GAP utilizabile de către biomasă. 3.4.4. Asimilarea metanolului Calea de asimilaţie are ca produs intermediar-cheie dihidroxi-acetona. Calea metabolică diferă de cea de la bacterii, la care se întâlneşte cea a ribulozo-monofosfatului şi a serinei. Calea xilulozo-monofosfatului sau a dihidroxiacetonei, specifică drojdiilor metilotrofe, presupune fixarea formaldehidei, rezultată din oxidarea metanolului, în calea xilulozo-5-fosfatului, formarea dihidroxiacetonei şi a gliceraldehid-3-fosfatului şi regenerarea xilulozo – 5 – fosfatului (Figura 2) [38]. 3.4.4.1. Calea xilulozo-monofosfatului Această cale presupune fixarea formaldehidei de către xilulozo-5-fosfat cu ajutorul unei transketolaze şi plasarea dihidroxiacetonei ca produs intermediar cheie în asimilarea metanolului. Calea metabolică propusă implică în principal trei enzimc esenţiale: o enzimă ce asigură fixarea formaldehidei, dihidroxiacetonkinaza şi fructozo-1, 6-bifosfataza. Dihidroxiacetonsintaza este o transcetolază ce asigură transferul fragmentului glicoaldehidic de la xilulozo-5-foasfat la formaldehidă ducând la formarea gliceraldehid-3-fosfatului şi a dihidroxiacetonei. Greutatea moleculară a enzimei este de 190.000 D şi aceasta este compusă din patru unităţi identice. Dihidroxiacetona este fosforilată de o kinază specifică. Din reacţie rezultă dihidroxiacetonfosfatul, necesar regenerării xilulozo-5-fosfatului enzima fosforilată şi D, L-gliceraldehida dar cu viteză mult mai redusă. Dihidroxiacetonkinaza este de asemenea, implicată în metabolismul glicerolului. În acest caz. glicerolul este întâi oxidat la dihidroxiacetonă. Rezultă de aici, că dihidroxiacetona este intermediarul central în asimilarea atât a metanolului, cât şi a glicerolului [20]. 3.4.4.2. Energetica Măsura energeticii unor căi metabolice se exprimă în numărul de molecule de ATP rezultate şi consumate. Oxidarea metanolului la CO2 este un sistem care produce ATP. Calea de sinteză a produşilor celulari pornind de la metanol, este în schimb consumatoare de energie, adică de ATP. Oxidarea metanolului generează prin intermediul formiat-dehidrogenazei două molecule de NADH, care pot servi la sinteza ATP. Este posibil ca NADH dehidrogenaza să fie localizată la nivelul membranei externe a mitocondriei. Este oricum exclus ca din aceste procese să rezulte mai mult de două molecule de ATP. În calea xilulozo- monofosfatului se consumă 3 molecule de ATP pentru a forma o moleculă de gliceraldehid-3-fosfat în fostorilarea dihidroxiacetonei, regenerand 3 molecule de xilulozo-5-fosfat. ATP consumat poate fi recuperat prin oxidarea gliceralciehid 3-fofatului [4, 7]. 3.5. Metabolismul diauxic al drojdiilor metilotrofe Drojdiile metilotrofe sunt capabile să metabolizeze metanolul ca singură sursă de carbon şi energie, fie o varietate de substraturi mixte: metanol-glucoză, metanol-xiloză, metanol-glicerol [18, 21]. Metabolizarea metanolului începe în peroxizomi, unde este oxidat la formaldehidă via metanol-oxidază, cu producere concomitentă de apă oxigenată. Efectele dăunătoare ale unor concentraţii crescute de H2O2, sunt anulate de valorile ridicate ale activităţii metanol-catalazei în peroxizomi [19]. Glucoza este metabolizată de către drojdiile metilotrofe prin dirijarea unei părţi în procesul de glicoliză, pe când cealaltă parte trece întâi prin ciclul oxidativ al pentozofosfatului [17]. In culturile chemostat, cu limitare de carbon, drojdiile metilotrofe pot asimila ambele substraturi simultan. În timp ce glucoza este metabolizată prin glicoliză sau prin ciclul pentozofosfatului, producând unităţi C3 pentru dezasimilaţie şi asimilaţie, carbonul din metanol este asimilat prin ciclul xilulozo-monofosfatului, în direcţie contrară [19]. 3.5.1. Creşterea pe amestecuri C1 (metanol) – C6 (glucoză) Performanţele economice ale proceselor biotehnologice sunt: eficacitatea utilizării componentelor mediului de cultură, productivitatea şi calitatea produselor. Utilizarea unor substraturi mixte în producţia de biomasă proteică, vizează mărirea vitezei de creştere a microorganismului în scopul producerii unei cantităţi cât mai mari de biomasă sau produse [20]. În timpul creşterii pe amestecuri de C1 – C6, viteza specifică de consum a metanolului creşte linear cu viteza de creştere celulară, până când aceasta este afectată, în metabolismul celulelor, de trecerea de la utilizarea unui substrat mixt la utilizarea unui singur substrat. Cercetările efectuate de Egli [17], arată că atunci când amestecurile C1 – C6 conţin mai mult de 60 % C1, concentraţia celulară maximă atinsă este cel puţin egală cu concentraţia celulară obţinută la utilizarea numai a metanolului ca sursă de carhon şi energie. La creşterea drojdiilor metilotrofe pe amestecuri conţinând 49.6 % C1 sau mai puţin, întreruperea utilizării metanolului şi trecerea pe utilizarea exclusivă a glucozei are loc, înainte ca viteza dc creştere celulară să ajungă la valoarea,0.4 h-1. La viteze de diluţie mici are loc consumarea cu precădere a componentei C1, iar la rate de diluţie de peste 0,25 h-1 are loc consumarea cu prioritate a componentei C6. La rate de diluţie de 0,15 - 0,20 h-1, se consumă simultan ambele surse de carbon [19]. Concentraţia substratului este menţinută constantă, 4 g×l-1 metanol:1 g×l-1 glucoză (Figura 3). 
Figura 3. Densităţi celulare de Hansenula polymorpha în timpul tranziţiei de la cultivare batch la cultivare chcmostat, la o dilutie D = 0,2 h-1 (conccntraţia substratului este menţinută constantă la valoarea 4 g×l-1 metanol : 1 g-l-1 glucoză). 
Figura 4. A – Modificări impuse ale ratei de diluţie în timpul cultivării de H. Polymorpha (concentraţia substratului este menţinută constantă la valoarea 4 g×l-1 : 1 g×l-1 glucoză, temperatură 370C, pH 6,5; B – răspunsul în concentraţia celulară de drojdie. 3.6. Izolarea unor mutante de Hansenula polymorpha cu capacitate ridicată de biosinteză a alcooloxidazei Izolarea unor astfel de mutante prezintă un real interes biotehnologic, în special pentru eficienţa ridicată în producerea biomasei proteice. Izolarea mutantelor s-a realizat în trei etape succesive. Prima etapă constă în creşterea celulelor de Hansenula polymorpha, după tratamentul mutagen, timp de 24 de ore pe mediu cu metanol. În acest interval de timp celulele au acumulat alcooloxidază. Coloniile astfel crescute au fost transferate apoi prin „replica – plating”, pe mediu cu glucoză şi lăsate să se dezvolte timp de 16 ore. După acest interval de timp, coloniile crescute pe mediu cu glucoză au fost transferate pe hârtie de filtru şi celulele au fost permeabilizate cu clorură de alchil-demetil-benzil amoniu. În a doua etapă, s-a aplicat asupra celulelor de drojdie amestecul de soluţie pentru testarea activităţii alcooloxidazei. Au fost reţinute acele mutante care, după 16 ore de creştere pe mediu cu glucoză, mai prezentau activitate alcooloxidazică, respectiv Hansenula polymorpha 15 şi 15 – 50. Ultima etapă a izolării mutantelor a avut ca scop obţinerea unor mutante rezistente la glucozamină. Glucozamina este un analog neasimilabil al glucozei. Aceasta mimează glucoza, fără a putea fi utilizată ca sursă de carbon de către celulă. Ca urmare, într-un mediu ce conţine metanol şi glucozamină, vor creşte doar acele mutante ce au capacitatea de a biosintetiza alcooloxidaza şi de a consuma metanolul în prezenţa glucozaminei, deci şi în prezenţa glucozei. Astfel au fost selecţionate mutantele Hansenula polymorpha 3 şi 6. În prima etapă viabilitatea după mutageneză a fost de 0,03%, în etapa a doua de 0,1%, iar în a treia etapă de 0,05%.
Yüklə 0,54 Mb. Dostları ilə paylaş:
|
HCHO + H2O2 (alcooloxidază)
HCHO + 2H2O (catalază)
HOCH2 – S – G
HCHO – S – G + NADH + H+
CHO + GSH + NAD+ HCO – S – G + NADH + H+
HCOOH + GSH
HCCOH + NADH + H+