Laboratoriya mashg‘uloti mavzu: Unayotgan urug’ tarkibidagi amilaza fermentini aniqlash Mashg'ulot shakli: «Sanoat farmatsiyasi» va «Biotexnologiya»

LABORATORIYA MASHG‘ULOTI
Mavzu: Unayotgan urug’ tarkibidagi amilaza fermentini aniqlash
Mashg'ulot shakli: «Sanoat farmatsiyasi» va «Biotexnologiya» yo‘nalishi talabalari uchun laboratoriya mashg‘uloti.
Mashg'ulot uslubi: «Blits o‘yin» texnologiyasi
Mashg‘ulot maqsadi: α – amilaza fermenti haqida ma’lumot berish.Undirilgan bug‘doydan α – amilaza ajratib olish.α – amilazani faolligini SF – 26 da 595 nm to‘lqin uzunlikda optik zichligini aniqlash.
Mavzuning ahamiyati: Undirilgan donni (arpa, bug‘doy) ekstraksiyalab, olingan α – amilazani faolligini formula orqali aniqlashni o‘rgatish.


Ishning nazariy qismi

Fermentlar (enzimlar)- hilma-hil biokimyoviy va kimyoviy reaksiyalarni amalga oshiruvchi oqsil tabiatiga ega bo‘lgan biokatalizatorlardir. Fermentlar manbai hayvon to‘qimalari, o‘simliklar hujayralari va mikroorganizmlar bo‘lishi mumkin.Fermentativ reaktsiyalarni tezligi odatdagi kimyoviy reaktsiyalarga qaraganda 10-14 marotaba tezroq kechishi aniqlangan.Kimyoviy reaktsiyalarni xuddi shunday samara bilan kechishi uchun 600-700º C va 200-300 atm. bosim zarur bo’lishi ham aniqlangan.Fermentlar o’ziga xos bo’lgan spetsifiklikka va faollikka ega. Bu esa fermentlarni, bizga ma'lum bo’lgan boshqa kimyoviy birikmalardan ajratib turadi.

Ferment yoki enzim katalitik oqsildir. Xujayra oqsillarining kariyb 90 % ni fermentlar tashkil qiladi, lekin bazi struktura oqsillari, masalan, miofibrillyar qiskarish xususiyatiga ega bo‘lgan aktin va miozin ham reaksiyalarda katalizatorlik qiladi. Tirik organizmlar tarkibida juda ko‘p turli - tuman fermentlar bo‘lib, ular xujayra shirasi va xujayra organoidlarida (yadro, mitoxondriy, xloroplast, endoplazmatik to‘rda) mujassamlashgan. O‘simliklarning turli qismlaridagi fermentlar miqdori har hil bo‘ladi. Fermentlar unayottan urug‘da va donda ayniqsa ko‘p bo‘ladi, shuning uchun ularni ajratib olishda kulay manba bo‘lib hisoblanadi. Masalan, soya urug‘ida mochevinani parchalaydigan ureaza fermenta, kartoshka tuganagida kraxmal sintezlanishida ishtirok etadigan fosforilaza fermengi ko‘p uchraydi fermentlar kam boshqa oqsillar kabi, isitilganda kimyoviy omillar va boshqa tasir ostada denaturatsiyaga uchraydi, fermentlar xam oqsillar kabi, molekulasida juda ko‘p musbat va manfiy zaryad tashuvchi gruppalarga, tabiiy holda malum izoelektrik nuqtaga ega, elektr maydonida harakatlanadi. Fermentlar tasiri maksimal bo‘lgan pH optimumi va temperatura optimumi bor. Ammo ularning eng ajoyib xossasi spetsifikligidir. Ana shu xossasi bilan fermentlar boshqa katalizatorlardan keskin farq qiladi. Ular bitta yoki juda yaqin bir nechta birikmalarning stereizomerlariga nisbatan mutloq farqli reaksiyalarni katalizlaydi. Fermentativ reaksiyalarning spetsifikligini ko‘pdan beri qulf - kalit, modeli shaklida tasvirlanadi. Bu modelga ko‘ra, ferment o‘xshash faqat aniq shaklga ega kalitga ( substratga) mos keladi.
Hozirgi tushunchalarga kura, eski qulf-kalit munosabati birmuncha takomillashtirilib indutsirlangan qulf - kalit modeli sifatiga aylanadi.

Uning ma‘nosi shuki, qulf substrat bilan bog‘langandan keyin unining konformatsiyasini o‘zgartirib kalitga mukammal mos keladigan shaklga o‘tadi.

Fermentativ reaksiya davomida avvalo ferment ( E ) substrat ( S ) o‘zaro kontaktga kirib enzim - substrat kompleksi ( ES ) ni hosil qiladi. Fermentning substratni bog‘laydigan va uning kimyoviy o‘zgarishini taminlaydigan chegarali qismi faol markaz deb ataladi. Bu markazning o‘zida substratni vaqtincha bog‘lab turadigan bo‘lagi bog‘lovchi qism, molekulaning kimyoviy o‘zgarishda ishtirok etadigan guruhlari katalitik qismini tashkil qiladi. Faol markaz ferment molekulasidagi ayrim aminokislotalarning yon shoxlaridagi radikallar ishtirokida shakllanadi. Bu aminokislotalar oqsil zanjirining bir - biridan uzoq qismlarida joylashgan bo‘lishi mumkin, lekin molekulaning konformatsiyasida ular o‘zaro yaqinlashgan. Faol markaz reaksiyaga qatnashadigan koferment ishtirokida va ferment — substrat kompleksi hosil bo‘lish jarayonida batamom shakllanadi.
Oddiy oqsillardan, yani faqat aminokislotalardan tashkil topgan fermentlar bir komponentli fermentlar deyiladi. Masalan, ribonukleaza, tripsin. Murakkab oqsillardan tashkil topgan bo‘lsa, yani ularning tarkibida aminokislotalardan tashqari boshqa birikmalar xam uchrasa, ular ikki komponentli fermentlar deb ataladi. Oksidlanish - qaytarilish reaksiyalarida ishtirok etuvchi fermentlar ikki komponentli fermentlardir. Kofaktor deb ataladigan qo‘shimcha molekula oqsil bilan ancha mustaxkam birikkan bo‘lsa, tahlil qilinganda u polipeptid zanjirdan ajralmaydi, ferment molekulasining bog‘langan qismi prostetik gruppa deb ataladi.
Ikki komponentoy fermentning oqsil qismi apoferment, osonlik bilan undan ajraladigan dissotsiyalanadigan kichik molekulyar qo‘shimchasi koferment deb ataladi. Apoferment oqsil bo‘lgani uchun u yuqori molekulyar, qizitilganda buziladigan termolyabil, dializlanmaydigan komponent, koferment esa kichik molekulyar yuqori xaroratga chidamli - termostabil va dializlanadigan komponentdir. Apoferment koferment bilan birikkan takdirdagina aktiv tula ferment - xoloferment hosil bo‘ladi.
Koferment fermentning aktiv markazida substratning kimyoviy o‘zgarishini taminlaydigan katalitik qismning asosiy elementidir. Kofermentlarning ko‘pchiligi vitaminlar va ularning bir oz o‘zgargan, ko‘pincha fosforlangan shakllari, turli nukleotidlardan iborat.Ferment molekulasida aktiv markazdan tashqari aplosterik markaz ham mavjud ekanligi aniqlangan.Bu markaz ferment molekulasining malum bir qismi bo‘lib, u aloxida aksari past molekulyar effektor yoki modifikator deb ataladigan, substratdan boshqa, unga uxshamagan moddalarni biriktiradi.
Effektorning allosterik markazga birikishi fermentning uchlamchi va aksariyat to‘rtlamchi strukturasini, binobarin, aktiv markazining konformatsiyasini o‘zgartirib, fermentativ xususiyatining kuchayishi yoki pasayishiga sabab bo‘ladi.
Fermentlar bir kator o‘ziga xos xususiyatlarga ega. Bularga fermentlarning termolabilligi, spetsifikligi, muxit pH i ning o‘zgarishga nisbatan sezuvchanligi, aktivator va ingibitorlarning tasiriga moyillish kiradi. Fermentlarning tasiri va ularning aktivligi reaksiyada ishtirok etayotgan moddaning kamayishiga yoki hosil bulayotgan moddaning ortib borishga qarab belgilanadi. Odatda fermentativ preparat sifatida o‘simlik to‘qimalarining shiralaridan foydaniladi, Bunday shiralarda fermentlar erigan holda bo‘ladi. Xozirga qadar malum bo‘lgan fermentlar 6 sinfga bo‘linadi:

1. 
   Oksidoreduktazalar - oksidlanish va qaytarilish reakdiyalarini katalizlaydi.
   

2. Transferazalar - malum kimyoviy gruppalarni bir birikmadan ikkinchi birikmaga ko‘chirilishini taminlaydi.

3. Gidrolazalar - murakkab organik birikmalarning suv yordamida parchalanish reakdiyalarini katalizlaydi.
4. Liazalar - substratdan suv ishtiroksiz malum gruppalarning ajralishshsh katalizlaydi. Bu fermentlar faolligi tufayli yo qushbog‘ hosil bo‘ladi yoki malum gruppalarning kush bog‘larga birikishi taminlanadi.
5. Izomerazalar - har xil organik birikmalarning izomer l anish reakdiyalarini katalizlaydi.
6. Ligazalar ( yoki sintetazalar ) - ATF yoki shunga o‘xshash nukleozid trifosfatlar energiyasini xisobiga oddiy molekulalardan murakkab birikmalar hosil bo‘lish reaksiyalarini katalizlaydi.
Amilaza fermenti gidrolazalar sinfiga mansub bo‘lib,inson organizmida uglevodlarning fermentativ gidrolizini amalga oshiradi. Amilaza so‘lakning tarkibida, oshqozon osti bezining suyuqligida, qonning tarkibida, jigarda, miyada bo‘ladi. Sanoatda amilazaning manbai bo‘lib, undirilgan don o‘simtalari, achitqilar va mog‘or zamburug‘ining mitseliylari xizmat qiladi.Undirilgan bug‘doy tarkibidagi α-amilaza fermentini ajratib olish va faolligini aniqlash muhim amaliy ahamiyatga ega.Kraxmalning fermentativ gidrolizi amilaza ishtirokida amalga oshadi. Amilaza so‘lakning tarkibida, oshqozon osti bezining suyuqligida, qonning tarkibida, jigarda, miyada bo‘ladi. Sanoatda amilazaning manbai bo‘lib, undirilgan don o‘simtalari, achitqilar va mog‘or zamburug‘ining mitseliylari xizmat qiladi.
Amilazaning α- va β- turi ma’lum. Bular bir-biridan ta’sir qilish mexanizmi bilan farq qiladi. α-amilaza ta’sirida kraxmalning fermentativ gidrolizi dekstrinlar bosqichigacha davom etadi. Bunda maltoza kam miqdorda hosil bo‘ladi. Bundan keyin β-amilaza ta’sirida, asosan maltoza hosil bo‘ladi.
Maltoza maltaza fermenti ta’sirida ikki molekula α-D-glyukozagacha parchalanadi. Bundan tashqari kraxmalga glyukoamilaza fermenti ta’sir etishi mumkin. Bu ferment kraxmalni glyukozagacha parchalanishini katalizlaydi.
Fermentlar oqsil tabiatli moddalar bo‘lgani sababli, ular temperaturaga juda ta’sirchan bo‘ladi. Fermentlar uchun optimal temperatura 37-38°C ni tashkil qiladi. Temperaturaning oz miqdorda ko‘tarilishi, (40-45°C gacha) fermentlarning aktivligini oshiradi. Lekin keyingi qizdirish, ya’ni 50°C dan yuqori bo‘lgan temperatura, fermentning aktivligini yo‘qolishiga sababbo‘ladi. Buning sababi, fermentning oqsil qismi yuqori temperaturada denaturatsiyaga uchrashidir. Past temperaturada esa ferment o‘z aktivligini yo‘qotmaydi, lekin shu temperaturada aktivligi kamayishi mumkin. Agar temperatura ferment uchun optimal holgacha ko‘tarilsa, fermentning aktivligi yana tiklanadi.Har bir ferment ma’lum pH muhitida optimal aktivlikka ega bo‘ladi. Masalan, pepsin uchun pH 1,5-2,0 ga teng, amilaza uchun 6,8 -7,0, tripsin uchun 7,8, oshqozon osti bezining lipazasi uchun 7,0-7,8 ga teng bo‘ladi.Tajribalar shuni ko‘rsatadiki, har hil substratdan ajratib olingan va bir hil reaksiyani katalizlaydigan fermentlar o‘zining optimal faolligini pH ning har hil ko‘rsatgichlarida namoyon qiladi. Masalan, shakarqamichda uchraydigan saharazaning optimal ta’sir qilish pH ko‘rsatgichi 6,2 ga teng, achitqilardan ajratib olingan saharazaning optimal pH i 4,6-6,0 ga teng. So‘lak amilazasining optimal pH i 6,8-7,0 ga teng bo‘lsa, unayotgan bug‘doy amilazasining pH i 4,4—4,5 ga teng bo‘ladi.
Ferment faolligiga aktivatorlar va ingibitorlar sezilarli ta’sir ko‘rsatadi. Bular metallarning ionlari yoki organik moddalar, ba’zan esa murakkab birikmalar bo‘lishi mumkin. Aktivatorlar ko‘pgina mikroelementlar va suvda eruvchi vitaminlar bo‘lishi mumkin.Metallar aktivator sifatida ba’zi hollarda fermentlar bilan mustaxkam birikmaydi, ikkinchi hollarda metall fermentning organik strukturasi ichiga kirib, haqiqiy metalloenzimlarni hosil qilishi mumkin.
Ferment faolligini pasaytiruvchi moddalar spetsifik harakterga ega bo‘lib, ularning ta’sir qilish mohiyati qaytar va qaytmas bo‘lishi mumkin. O‘z navbatida qaytar ta’sir ko‘rsatuvchi ingibitorlar konkurent va konkurent bo‘lmagan ingibitorlarga bo‘linadi. Nokurent ingibitorlar substrat bilan birikib, fermentning aktivlik markaziga birlashadi. Masalan, malonat suksinatdegidrogenaza fermentining konkurent ingibitori hisoblanadi. EDTA va og‘ir metallar (Si , Ng , Ag va boshqalar) konkurent bo‘lmagan ingibitorlar bo‘lib, iodatsetamid, diizopropilftorfosfat (DFF) esa qaytmas ingibitor hisoblanadi.Spetsifik ingibitorlar qatoriga quyidagi birikmalar kiradi, antibiotiklar, gerbitsidlar, insektitsidlar va boshqalar.
Ichakning epitelial xujayralari faqatgina monosaxaridlarni so‘rish xususiyatiga egadir. Shuning uchun xazm qilish jarayoni uglevodlardagi oligo- yoki polisaxarid tuzilishga ega bo‘lgan glikozid bog‘larni fermentativ gidrolizlanishi bilan bog‘liq bo‘ladi
(1 – rasm).