Lékařská fakulta, Masarykova Univerzita

Příloha VI. Nanotechnologie

Nanotechnologie je hraniční obor na pomezí fyziky pevných látek, organické chemie, biochemie i anorganické chemie nahlížený z mechanistického pohledu a zabývající se konstrukcí (slovo syntéza lze příliš nevystihuje situaci) komplexních molekul daných fyzikálních vlastností. V dnešní době je potenciál nanočástic v medicíně v principu dvojí. V prvním případě dokáží nanočástice daných vlastností vytvářet samoorganizací in vivo 3D struktury v poškozené tkáni (Smith 2005, Smith 2007). Povrch těchto nanočástic může být upraven tak, aby po něm migrovaly specifické buňky – fibroblasty, buňky glie, mohou stimulovat růst neuronů atd. Druhou oblastí je cílená dodávky léčiv a využití biologických vlastností nanočástic (například indukce komplementové odpovědi). V této oblasti jde v principu o konstrukci micel, tzv. polyplexů, z polymerů přírodních (poly-L-lyzin - PLL, chitosan) nebo artificiálních (uhlíkové fullereny, poly-dietyl-Emino-etyl metakrylát - pDEAEMA, poly-etylen-imin – PEI, nebo poly-etylenglykol PEG). Ty nesou uvnitř navázánu pomocí van der Waalsových sil, příp. koordinačně kovalentní vazbou v případě kovů, klíčovou molekulu (léčivo, DNA, siRNA/RNAi, miRNA, antisense molekuly nukleových kyselin, marker, atd.). Na svém vnějším povrchu pak mají navázánu „adresu“ – molekulu, která zaručí cílené doručení obsahu, případně zaručí správnou interakci s recipientní buňkou tak, aby nedošlo k endogenní lyzozomální destrukci obsahu, ale k jeho uvolnění do cytoplasmy, anebo ještě dále k cílenému dopravení až do jádra buňky. Touto adresní molekulou může být protilátka, ale také specifický ligand určitého receptoru. Vzhledem k relativně negativnému náboji vnějšku buněčné membrány může pozitivní náboj polyplexů usnadňovat adhezi.

Mechanismů, které uvolní správně lék do cytoplasmy je několik. Nejčastěji popisovaným způsobem je endocytóza, která ale musí obejit lyzozomální cestu (Kam 2006). Dalším mechanismem může být postupná degradace obalu nanočástice s tvorbou komplexů s dodávaným léčivem a procházení těchto malých nenabitých komplexů buněčnou membránou na principu difuze – jako například u poly-alkyl-kyanoakrylátu (de Verdière 1997). A konečně mohou vytvořit nanočástice jakýsi kanál v membráně, kterým se přepravovaná látka dostane do buňky. Tento mechanismus se předpokládá u fullerenů (Pantarotto 2004).

Přes všechny klady není použití nanočástic bez rizik. Je známá toxicita lipozomálních nanočástic. Ionické lipozomy jsou potentním aktivátorem komplementu. Také holé fullereny jsou ve vodě nerozpustné a vysoce toxické. Modifikací povrchu fullerenů navázáním různých ligandů lze dosáhnout nanočástic bez akutních toxických účinků v laboratorních podmínkách na lymfocytech nebo na zvířecím modelu. Nebyly však provedeny dosud žádné dlouhodobější toxikologické studie, které by posuzovaly možný efekt při léčebném použití fullerenů u lidí. Jejich endotracheální aplikace může způsobit tvorbu plicních granulomů. Intravaskulární výskyt fullerenů může vézt k intravaskulární agregaci destiček a vzniku trombů, jak bylo ukázáno na laboratorních zvířatech. Dnes nejčastějším způsobem, jak zvýšit biokompatibilitu a snížit toxicitu nanočástic je jejich PEGylace – tedy potažení polyetylenglykolem.

Oblasti využití NT v medicíně:

1. 
   Genová terapie, cílené směřování léků - výroba bezpečných vektorů zajišťující selektivní dodávky léčiv včetně genoterapie nabo RNAi do nádorových buněk. Lze je také použít k selektivní fyzikální terapii v kombinaci s magnetitem (Fe3O4) a MRI.
   
2. 
   Diagnostika - výroba makromolekul definovaných vlastností se selektivním vychytáváním v nádoru nesoucí kontrastní agens
   
3. 
   Specifické vlastnosti – jako například imunomodulace.
   
4. 
   Tvorba autoagregátů 3D struktur („lešení“) pro tkáňovou regeneraci po poraněních.
   

Cílená dodávka léčiva, diagnostika: Lze tak využít doručení kontrastních látek pro MRI (Sitharaman 2005), nebo fluorescenci (Bottini 2006). Případně pro scintigrafii v kombinaci s ¹¹¹In. Zobrazená tkáň závisí na druhu zvoleného ligandu nebo protilátky. V případě kolorektálního karcinomu lze použít obvykle CEA nebo 5T4 antigen. Podle dávky ¹¹¹In lze využít nanočástici nejen k diagnostice, ale i k selektivní radioterapii (Reilly 2007). Vzhledem k tomu, že karbonové nano-trubice mají tendenci pronikat do buňky a shromažďovat se kolem jaderné membrány, je efekt radioterapie cílené pomocí těchto nanočástic na DNA maximalizován (Pastorin 2006). Efekt tohoto přístupu byl prokázán laboratorně u akutní myeloidní leukémie (¹¹¹In -nanočástice s anti-CD34 protilátkou rituximabem)( Chen 2006), a také u EGFR+ mammárního karcinomu (¹¹¹In -nanočástice s EGF)( Reilly 2000). Bylo také prokázáno, že nanočástice na bázi PACA se přednostně vychytávají v retikulo-endotelovém systému a lze tak tuto léčbu mířit cíleně na jaterní metastázy, kde jsou tyto částice vychytávány Kuppferovými buňkami (Chiannilkulchai 1990).

Obejití rezistence na cytostatika : multidrug rezistence (MDR) mediovaná transmembránovou pumpou P-gp, která aktivně odčerpává cytostatika ven z buněk lze překonat několika způsoby. 1.) Na buněčné úrovni lze tento efekt překonat kompetitivními inhibitory jako je například verapamil. Nicméně v dávkách nutných pro potlačení MDR je jeho podání zatíženo řadou nežádoucích účinků. 2.) Přesycení systému P-gp nanočásticemi na bázi poly-alkyl-kyanoakrylátu (PACA) (Treupel 1991, Cuvier 1992, Nemati 1996, de Verdière 1997) významně zvyšuje intracelulární koncentraci cytostatik díky endocytóze. Alkyl-kyanoakrylát s doxorubicinem vytváří iontové komplexy, které pak procházejí membránou bez toho, aby byly zachyceny P-gp proteinem. 3.) Blokádou P-gp přidaným cyklosporinem-A do nanočástice.

Dalším mechanismem, kterým nanočástice pomáhají zvýšit efektivitu chemoterapie je ochrana protinádorových léků před rychlou biotransformací a zpomalení jejich clearance z těla (Couvreur 1980, Verdun 1990).

Dalším možným polem působnosti v léčbě nemocí je jejich role jako vektorů genové terapie. Přestože bylo do roku 2005 provedeno minimálně 1000 klinických studií využívající virové vektory ke genové terapii (www.wiley.co.uk/genmed/clinical/ ) regulační autority zpomalily rozvoj dalších studií vzhledem k prokázanému onkogennímu potenciálu virových vektorů a vysoké imunogenicitě (Sadelain 2004, Marshall 2002). Specificita takto podávané léčby také není nijak vysoká. Proto byly zkoušeny jiné metody cílené inkorporace DNA do buněk jako gene guns, elektroporace, sonoporace, nebo ozáření laserem. Klinické využití vyžadovalo u solidních nádorů nutnost chirurgické expozice tkáně a i tak nebyly tyto metody příliš efektivní, ani specifické. Micely tvořené kationickými lipidy také nevykazovaly vysokou efektivitu a navíc přinášely kumulativní významnou toxicitu a stimulaci zánětlivé odpovědi organismu (Hirko 2003, Zhang 2005). Lze očekávat, že komplexní micely – polyplexy poskytnuté nanotechnologiemi mohou výrazně zvýšit efektivitu a především specificitu transfekce buněk bez nežádoucí systémové zánětlivé reakce organismu, přestože interakce polyplexů s imunitním systémem nejsou triviální. V pasivní neadresné adhezi polyplexů na buněčné membrány hraje významnou roli heparansulfát. Pro zvýšení selektivity pro určité tkáně nebo buňky bylo využito několika strategií. Receptorem mediovaná internalizace polyplexů byla využita při dodávce nukleových kyselin do hepatocytů (Kunath 2003), tracheálních epitelií (Grosse 2004) a dendritických buněk (Diebold 1999) pomocí sacharidů. Nádorové tkáně pak byly cíleně vyhledávány pomocí receptorů pro folát (Gottschalk 2001, van Steenis 2003), integriny (Kunath-Merdan 2003) nebo transferin (Kircheis 2001). Bylo také dosaženo cílené dodávky nanočástic pomocí navázaných protilátek nebo jejich fragmentů (Merdan 2003). V současnosti je velmi slibná internalizace polyplexů, která se vyhýbá endolyzozomální degradaci, pomocí tzv. protein transduction domains (PTDs) (Zorko 2005), neboli specifických proteinových přenašečů na membránách.

Velmi zajímavou aplikací nanočástic je léčba založená na paramagnetických vlastnostech magnetitu – tedy oxidu železito-železnatého Fe₃O₄. Při konstrukci micely tak, že obsahuje adresu – v tomto případě protilátku proti CEA nebo jinému tumorspecifickému antigenu a uvnitř dostatečné množství magnetitu, lze následně po aplikaci detekovat tyto částice v těle pacienta. V případě, že se nacházejí v místě, kde je cílová tkáň, může déledobější aplikace proměnlivého magnetického pole (AMF) způsobovat tak významné tepelné ztráty v magnetitu, že dojde lokálně k prohřátí tkáně na teplotu kolen 45 st. C. Při této teplotě nedochází většinou k přímému poškození buněk. Nicméně dochází k indukci tzv. heat shock proteinů, které často vedou k apoptóze i u nádorových buněk a tím k významné redukci nádorové tkáně (Dobson 2007). Takto vytvořené nanočástice – tzv. SPION jsou již používány k MRI diagnostice. Klinická aplikace AMF indukované hypertermie pomocí SPION nebyla zatím provedena. Výsledky na zvířecím modelu jsou slibné, nicméně do kliniky zatím nepřenositelné.

Reakce organismu na nanočástice, Imunomodulace: Bohužel působení degradačních produktů kostry nanočástic není mimo fullerenů nezanedbatelné. Zdá se, že účinnost dodávky cytostatika do buněk je úměrná toxicitě samotného pláště. Překlenutí všech potíží, které jsou spojené s doručením klíčové molekuly přesně na místo určení bez vedlejších efektů je stále velmi složitá a intenzivně studovaná oblast jen s dílčími výsledky. Například pokud se překryje PACA ještě PEG, dojde ke snížení aktivace komplementového systému, snížení vychytávání játry a delšímu poločasu v plasmě. V tomto případě pak je největší koncentrace v CNS, přednostně v ependymálních buňkách chorioidálních plexů a specificky v gliomech (Calvo 2001, Brigger 2002) beze změny permeability hematoencefalické bariéry.

Nanočástice jako agregát různých makromolekulárních látek i menších ligandů jsou potenciálním cílem imunitní odpovědi organismu. Samostatně nejméně imunogenní je PEG. Nicméně tyto nanočástice jsou schopny vyvolat imunitní reakci proti ligandům navázaným na jejich povrchu, ke kterým by jinak imunitní reakce nevznikla (Pantarotto 2003). Může tedy docházet k blokování účinku například adresných protilátek navázaných na nanočástici nově v organismu tvořenými protilátkami proti těmto epitopům zvláště při opakovaném podání a zvláště, pokud ligandy navázané na nanočástici nejsou humánního původu.

Po intravenózní aplikací léků a diagnostických látek o velikosti nanočástic byly v relativně velkém počtu popsány reakce časné přecitlivělosti s projevy dechové tísně, tachykardie, popřípadě pouze s výsevem exantému. Bylo prokázáno, že většinou nesouvisí s přecitlivělostí prvního typu, tedy IgE mediovanou, ale souvisí s aktivací komplementového systému. Tato pseudoalergická reakce s někdy nazývá C-aktivation related pseudoalergy (CARPA) vytvořila novou podskupinu přecitlivělostí prvního typu. Ne všechny nanočástice ale způsobují CARPA pouze aktivací komplementu (lipozomální a micelární léčiva jako Doxil, Taxol, Ambisome, poloxamer 188 a 407). Spolupodíl IgE mediované reakce vykazuje působení například i.v. protaminu (Szebeni 2007).

Fullereny aktivují komplement klasickou cestou interakcí s C1q. Tato vazba je dána samotným fullerenem a ne jeho konstrukcí nebo nečistotami a oxidačními produkty vzniklými při výrobě. Naopak vazba fullerenů na plicní proteiny surfaktantu SP-A a SP-D je Ca2+ dependentní a závisí na množství příměsí a oxidačních produktů ve fullerenech (Salvador-Morales 2007). Chemickou modifikací fullerenů lze dosáhnout různého stupně aktivace komplementu klasickou cestou a tak připravit fulleren požadovaných biologických vlastností (může být žádoucí aktivovat komplement fullerenem navázaným na povrchu nádorové buňky)(Salvador-Morales 200). Ostatní nanočástice mohou aktivovat komplement jak klasickou cestou (lipozomální nanočástice) tak alternativní cestou (micely). Přestože je Doxil (Caelyx) PEG-ylovaný lipozomální Doxorubicin používán po řadu let se zvýšeným léčebným efektem u mnoha nádorů (Gabizon 2001), je zatížen až v ¼ případů časnou alergickou reakcí (Uziely 1995), která není IgE mediovaná, nesouvisí s předchozím podáním léku, a po odeznění akutní reakce je obvykle možno infuzi léku pomalejší rychlostí bezpečně dokončit. Navíc byla přerušena studie posuzující bezpečnost a efektivitu ^99mTc-HYNIC PEG lipozomů v diagnostice Crohnovy choroby právě pro vysoký výskyt této přecitlivělosti. Jako součást nanočástic odpovědná za tuto reakci byl identifikován samotný lipozom (ALZA 2000). Stimulace nespecifické imunitní odpovědi samotnou kostrou nanočástice by se mohlo ukázat jako výhodné při přípravě protinádorových vakcín. Je možné připravit pomocí nanočástic jednak DNA vakcíny, kde mohou nahradit méně účinný a specifický plazmidový vektor. Nanočástice mohou sloužit při konstrukci konvenčních protinádorových vakcín s navázaným silným stimulátorem nespecifické imunity a tumor-specifickým antigenem. Kromě toho mohou nanočástice interagovat s celou řadou dalších proteinů plasmy. Byla prokázána vazba karbonových nanočástic na HDL a fibrinogen, nicméně klinický dopad zatím není jasný. Působení nanočástic v organismu je zřejmě velmi komplexní, od interakce s imunitním systémem, přes interakci s cílovou buňkou až po toxicitu vlastního nosiče. I přes tyto dílčí problémy se však potenciální využití nanočástic v medicíně zdá velmi slibné. Umožňuje relativně jednoduchou syntézu nanočástic „na míru“ pacienta a choroby.
Dopad pro klinickou praxi: Je potřeba opatrnosti před aplikací nanočástic. Část přecitlivělostí lze odhalit standardními kožními testy u pacientů s rizikem IgE mediované přecitlivělosti. Ostatní testy zatím nejsou v klinice používány, nicméně jsou vyvinuty ELISA metody, které umožňují vytipovat pacienty s vysokým rizikem pseudoalergické reakce. Nejefektivnější screening je dán sledováním konečného komplexu komplementu (SC5b-9) (Szebeni 2002). Především u pacientů s IgE mediovanou odpovědí lze využít desenzibilizační léčby. Imunosuprese nebo farmakologická inhibice komplementu se neukázala příliš efektivní. Inhibice účinku sekundárních mediátorů zánětu indometacinem, nebo blokátory adenozinového receptoru se ukázala jako účinná na prasečím modelu CARPA.

V cytotoxické léčby cílené protilátkami nebo jinými tumor specifickými ligandy je určitá aktivace komplementu výhodná, o čemž svědčí i některé klinické studie prokazující vyšší účinnost nanomolekulárních léčiv tam, kde byla vyšší toxicita samotné kostry nanočástice.