Cultivarea bacteriilor in microbiologia clinica are drept scop:
Cultivarea bacteriilor in microbiologia clinica are drept scop:
izolarea bacteriilor din prelevatele patologice
identificarea bacteriilor
testari pentru initierea si monitorizarea terapiei antimicrobiene.
Prelevatele patologice odata receptionate si triate calitativ, microbiologul trebuie sa hotarasca:
Prelevatele patologice odata receptionate si triate calitativ, microbiologul trebuie sa hotarasca:
mediile de cultura si metodele indicate pentru izolare
atmosfera, temperatura si intervalul de timp, necesare pentru izolarea tuturor microorganismelor cu semnificatie clinica din prelevatul examinat
izolatele cu semnificatie clinica, algoritmul si stadiul pana la care conduce identificarea acestora
izolatele cu semnificatie clinica, algoritmul si stadiul pana la care conduce identificarea acestora
daca antibiograma este indicata si care din rezultatele ei se impun communicate.
Mediile de cultura sunt folosite pentru cultivarea bacteriilor.
Mediile de cultura sunt folosite pentru cultivarea bacteriilor.
Ele se comercializeaza ca atare, sub forma liofilizata, gelificata sau gata turnate in placi Petri sau pot fi manufacturate in multe laboratoare.
Ingredientul de baza al mediilor de cultura este geloza sau agar – agar.
agar-agarul (numit și geloză) este un produs organic, hidro - coloidal ce se întâlnește într-o serie de alge marine – alge rosii (agarofite), din care este extras cu ajutorul apei fierbinți.
agar-agarul (numit și geloză) este un produs organic, hidro - coloidal ce se întâlnește într-o serie de alge marine – alge rosii (agarofite), din care este extras cu ajutorul apei fierbinți.
se prezintă sub formă de fâșii semitransparente de culoare cafenie-gălbuie.
conține: 70–80% polizaharide, 10–20% apă și 1,5–4% substanțe minerale.
conține: 70–80% polizaharide, 10–20% apă și 1,5–4% substanțe minerale.
este format din resturi galactozidice esterificate la C6 cu o grupare sulfonică.
are o putere de gelificare foarte mare.
Agarul este folosit la prepararea mediilor de cultura pentru ca asigura suprafata solida pe care cresc bacteriile si fungii.
Cresterea bacteriilor nu distruge structura gelului deoarece cele mai multe bacterii sunt incapabile sa utilizeze agarul pentru metabolism.
Agarul este comercializat sub forma de pulbere, care in amestec cu apa si incalzit la 100 °C ramane lichid, iar pe masura ce se raceste la 40 °C se gelifica.
Agarul este comercializat sub forma de pulbere, care in amestec cu apa si incalzit la 100 °C ramane lichid, iar pe masura ce se raceste la 40 °C se gelifica.
Mediul cu agar este un mediu relativ inert.
Alte ingrediente, nutrienti, factori de crestere, indicatori de pH sunt adaugati in mediul cu agaroza.
MEDII DE CULTURA CLASIFICARE
Din punct de vedere a starii de agregare:
medii lichide
medii solide
medii semisolide
MEDII DE CULTURA CLASIFICARE
Medii lichide – bulioane
Au utilizare restransa:
izolarea din prelevate necontaminate (ex. sange, exsudate din seroase, aspiratii din colectii purulente profunde, biopsii tisulare prin ac
MEDII DE CULTURA Medii lichide
Izolarea in medii lichide:
Avantaje:
cea mai sensibila metoda de izolare in vitro (cultura poate fi initiata de un numar redus de bacterii, volumul prelevatului insamantat poate fi crescut)
neutralizeaza prin dilutie factori antimicrobieni din prelevatul examinat
MEDII DE CULTURA CLASIFICARE
Mediile solide pot fi:
neselective
diferentiale
selective
MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE
Medii neselective:
agarul imbogatit cu 5% sange de berbec – mediul neselectiv cel mai folosit pentru insamantarea prelevatelor necontaminate si a unora din cele contaminate
Ex.: - exsudate din caile respiratorii si din
cavitatile conecte
- exsudat conjunctival
- puroi
MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE
Medii diferentiale – contin substratul pentru o anumita enzima sau citotoxina bacteriana si un indicator de pH
Ex.: - geloza – sange: diferentiaza bacteriile hemolitice de cele nehemolitice
- medii lactozate, cu variati indicatori de pH, diferentiaza enterobacteriile care fermenteaza lactoza (lactozo – pozitive) de cele care nu fermenteaza lactoza (lactozo – negative)
MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE
Medii selective – contin substante care inhiba dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor.
Exista o diversitate de medii selective.
MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE
Pentru izolarea enterobacteriaceelor din prelevate contaminate exista medii cu trei niveluri de selectivitate:
slab selective: - mediul Mac Conkey (agenti inhibitori: saruri biliare si cristal violet)
- mediul EMB (Levin) (agenti inhibitori: eozina Y si albastru de metilen)
Inhiba bacteriile Gram (+).
MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE
moderat selective: - mediul Salmonella – Shigella
- mediul ADCL (Agar Dezoxicholat Citrat Lactoza)
- mediul Hektoen
- mediul XLD
- mediul Istrati – Meitert
Agenti inhibitori: saruri biliare si verde briliant
Inhiba bacteriile Gram (+) si o parte din bacilii Gram (-) comensali.
MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE
medii inalt selective: - mediu Wilson – Blair
Agent inhibitor: verde briliant
Inhiba o gama larga de bacterii pentru a facilita
izolarea salmonelelor.
MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE
Agarul – sange poate fi facut selectiv pentru izolarea unor patogeni pretentiosi nutritiv prin adaos de antibiotice:
colimicina si acidul nalidixic: inhiba dezvoltarea
bacitracina: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (+) si
favorizeaza izolarea hemofililor
kanamicina si vancomicina: favorizeaza izolarea
bacililor Gram (-) anaerobi
etc.
MEDII DE CULTURA
MEDII DE IMBOGATIRE: - medii lichide, care prin anumite substante inhibitoare prelungesc faza de lag a bacteriilor de contaminare, fara a intarzia insa intrarea anumitor patogeni in faza exponentiala.
Ex.: bulion cu selenit acid de Na.: preincubarea materiilor fecale 18 h. la 37°C in acest mediu, favorizeaza izolarea salmonelelor.
INCUBAREA CULTURILOR
- temperatura:
37°C – majoritatea bacteriilor
20 - 30°C – unele bacterii (Yersinia
enterocolitica, Y. pseudotuberculosis,
Listeria monocytogenes)
42°C – altele: Campylobacter jejuni /
coli
Se foloseste pentru incubare termostatul.
INCUBAREA CULTURILOR
Atmosfera:
in prezenta O2 – bacterii aerobe si facultativ anaerobe
in mediu cu 5 – 10 % CO2 – bacterii carboxifile
in mediu cu O2 (5 – 7 %), CO2 (8 – 10%), N2 (85%) – bacterii microaerofile
INCUBAREA CULTURILOR
in mediu anaerob:
Procedee chimice:
bulioane cu ingrediente reducatoare (acid thioglicolic sau thioglicolat de Na.
tehnica OTT: incinta etansa in care O2 este indepartat prin reactia cu pirogalolul in mediu alcalin.
Procedee biologice:
procedeul Tarozzi: utilizeaza tuburi cu bulion nutritiv in care agent reducator sunt fragmente de organe proaspete de animal prelevate aseptic (ficat, rinichi)
Irizatii ale suprafetei unor colonii: pot fi surprinse anumite unghiuri de iluminare
Culoarea coloniilor:
alba
galbena
aurie
neagra,
in functie de varietatea pigmentilor produsi sau a
virajului de culoare a unor indicatori introdusi in
mediu.
CARACTERE DE CULTURA
Modificari ale mediului din jurul coloniilor: pot fi produse de citotoxine, enzime sau pigmenti difuzibili.
Hemoliza pe agar – sange
Reactii pe medii diferentiale zaharate
Reactii pe mediul cu galbenus de ou
Pigmentogeneza
CARACTERE DE CULTURA Hemoliza pe agar - sange
alfa: zona de inverzire a mediului cu numeroase hematii intacte din cauza hemolizei partiale
beta: zona complet clara, incolora, din cauza hemolizei complete
alfa – prim: halou de hemoliza incompleta cu inverzire, imediat inconjurat cu o zona de hemoliza clara, completa
gamma: absenta hemolizei
cald – rece: zona clara de hemoliza completa (aparuta dupa incubare la 37°C) inconjurata cu o zona de hemoliza mai putin clara, dar fara modificare de culoare a mediului (aparuta dupa incubarea in continuare la frigider)
CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii diferentiale zaharate
Virajul de culoare a mediului
Culoarea coloniilor in functie de indicatorii de pH
Fermentarea / Nefermentarea substratului
CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii cu galbenus de ou
Lecitinaza: precipitat opac in jurul coloniilor
Lipaza: film circular cu irizatie perlata in imediata vecinatate a coloniilor
Proteoliza: clarificarea mediului din jurul coloniilor
CARACTERE DE CULTURA Pigmentogeneza
Pigmenti hidrosolubili difuzeaza si coloreaza progresiv mediul:
fluoresceina
piocianina
melanina
CARACTERE DE CULTURA Mirosul degajat de cultura
Pseudomonas aeruginosa: aroma asemanatoare florilor de iasomie
