O‘zbekiston respublikasi oliy va o`rta maxsus ta`lim vazirligi

Yuqori darajadagi parallellik: koʻplab sekvenirlash reaksiyalari bir vaqtning oʻzida sodir boʻladi

Kichik oʻlchov: reaksiyalar juda kichik hajmda va hatto chiplarda amalga oshirilishi mumkin

Tezkor: reaksiyalar parallel sodir boʻlgani uchun natijalar darhol tayyor boʻladi

Arzon: genomni sekvenirlash Sanger boʻyicha sekvenirlashga nisbatan arzonga tushadi

Qisqa uzunlik: 505050 - 700700700 ta nukleotiddan iborat uzunlikda oʻqiladi Umuman olganda, keyingi avlod sekvenirlash juda katta miqdordagi kichik Sanger boʻyicha sekvenirlash reaksiyalarini parallel ravishda bajarishga oʻxshaydi. Ushbu parallellik va kichik hajmi tufayli katta miqdordagi DNKni Sanger boʻyicha sekvenirlashga qaraganda yangi avlod usullari bilan tezroq va arzonroq sekvenirlash mumkin. Misol uchun, 2001-yilda inson genomini sekvenirlash narxi \$100$100dollar sign, 100 \text{million}millionstart text, m, i, l, l, i, o, n, end text boʻlgan. 2015-yilda esa bor-yoʻgʻi \$1245$1245dollar sign, 1245 ni tashkil qilgan^22squared!

Nega sekvenirlashning tez va arzon boʻlishi muhim? Doimiy ravishda genomlarni sekvenirlash imkoniyati biologiya tadqiqotlari va biotibbiy dasturlar uchun yangi imkoniyatlarga yoʻl ochadi. Masalan, arzon narxlardagi sekvenirlash xususiylashtirilgan tibbiyotga ilk qadam, yaʼni inson ehtiyojiga qarab uning genomidagi gen variantlari tuzilishiga asoslangan holda tibbiy davolashga imkon yaratadi.

Bisulfit sekvenslash mexanizmi

DNK ekstrakti protsedurasi keng qo'llaniladi va ko'pincha genetik muhandislik va molekulyar genetik tadqiqotlarning boshlanish nuqtasidir. CTAB detarjenidan foydalangan holda DNKni ajratib olish usuli Merrey va Tompson (1980) uslubining modifikatsiyasi bo'lib, u katta miqdordagi materialni skrining qilishda analitik izolyatsiya qilishda va o'simlik materialidan genomik DNKni izolyatsiyalashda ishlatilishi mumkin. O'simliklar DNKini ajratish tartibi bir necha bosqichlardan iborat: hujayra lizisi, RNKning yo'q qilinishi, deprotizatsiya va organik moddalar (xloroform) yordamida DNK ekstraktsiyasi va etanol yoki izoprapanol yordamida nuklein kislotalarning oxirgi yog'inlari (DNK spirtli eritma bilan eritmada huzurida cho'ktiriladi) natriy ionlari, yoki lityum yoki ammoniyning yuqori konsentratsiyasi). Hujayra devorlarini yo'q qilish uchun o'simlik barglari bir-ikki daqiqagacha Eppendorf trubkasida DNK ekstrakti uchun CTAB Buferi ishtirokida sayqallangan shisha pestle bilan yaxshilab maydalanadi (1-ilovaga qarang). Tamponning bir qismi bo'lgan Tris eritmaning kerakli pH qiymatini ta'minlaydi (DNK pH qiymati 7,0 dan 8,5 gacha eng barqaror). EDTA magniy va kaltsiy ionlarini eritmadagi biriktirish uchun xelatlovchi vosita sifatida ishlatiladi.
Ekstraktsiya tamponida hujayra membranalarini samarali ravishda yo'q qiladigan katyonik yuvish vositasi bo'lgan CTAB mavjud va NaCl (1M) yuqori konsentratsiyasida nuklein kislotalar eriydi va eritmadan oqsillar va polisaxaridlar cho'ktiriladi. Xloroform bilan ekstraktsiyadan so'ng, polisabaridlar va oqsillar bilan STAB kompleksi interfazada va organik fazada paydo bo'ladi. Proteinlarni cho'ktirish va DNK-STAB kompleksini eritish uchun ekstraktsiya tamponiga 1,4 M NaCl qo'shiladi. Bundan tashqari, RNase A ekstraktsiya tamponiga ishlatilishidan oldin qo'shiladi.Hujayrali RNKni olib tashlash, PCR namunalarini kelgusida ishlatish uchun zarurdir. RNaseA 37 ° C da uyali RNKni samarali ravishda buzadi; shuning uchun xloroform bilan DNK ekstraktsiyasidan oldin namunalarni 37 ° C da oldindan inkubatsiya qilish maqsadga muvofiqdir. Eritmadan DNK olish uchun xloroform va izoamil spirt (24: 1) aralashmasi ishlatiladi. Isoamil spirti saqlash paytida xloroformning ko'piklanishini va oksidlanishini pasaytiradi. DNKning cho'kishi teng miqdordagi izopropil spirt bilan xona haroratida amalga oshiriladi. Polisaxaridlar va pigmentlarning DNK bilan yog'inlanishiga yo'l qo'ymaslik uchun DNKni cho'ktirish jarayoni tezda bajarilishi kerak. Qoldiq ekstraktsiya tamponi, izopropanol va xloroformni olib tashlash uchun DNK pelletini 70% etanol bilan yaxshilab yuvish kerak.
Protokol:

1. 
   100 mg yangi barglar yoki o'simliklarning ko'chatlari (yoki ammoniy sulfat asosida saqlash uchun RNAlater eritmasida saqlangan material, 1-ilovaga qarang) 1,5 ml Eppendorf trubkasida DNK ekstrakti uchun 500 ml CTAB buferi bilan maydalang, 1 ll qo'shing. RNase A (10 mg / ml), vorteks va 55-60 ° C da 30-60 daqiqa davomida inkübe qiling. Bundan tashqari, 37 ° C da 10-15 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, shunda RNase A genomik RNKni yo'q qiladi.
   
2. 
   Sinov naychasiga teng miqdordagi xloroform aralashmasidan (500-600 mkl) qo'shing: izoamil spirt (25: 1), yaxshilab girdoblang (iloji boricha DNKni oqsillardan ajratib olish muhimdir) va 14000 da santrifüj qiling rpm 5 min (organik va suvli fazalarni ajratish).
   
3. 
   Yuqori suvli fraktsiyani teng miqdordagi (600 µl) sovuq izopropanol (+ 4 ° C) va girdobni o'z ichiga olgan toza 1,5 ml naychaga o'tkazing (spirt eritmasidan DNKni yaxshilab aralashtirib cho'kadi).
   
4. 
   DNK 14000 rpmda 5 minut davomida santrifüj bilan cho'kadi; ustki qavatni ehtiyotkorlik bilan to'kib tashlang.
   
5. 
   DNK cho`kmasi bilan probirkaga 1 ml 70% etanol soling, cho`kmaning spirtda suzishini ta'minlash uchun yaxshilab girdoblang. Santrifüjni 5 minut davomida 14000 rpmda takrorlang; ustki qavatni ehtiyotkorlik bilan to'kib tashlang (cho'kma 70% etanolda yuvilgandan keyin kolba tubida kam saqlanadi).
   
6. 
   DNK cho'kmasini quritmang va darhol 200-500 ul 1xTE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 1mM EDTA) da 55 ° S da, vaqti-vaqti bilan aralashtirib, 10-20 daqiqa davomida eritib oling. Qoida tariqasida DNK cho'kmasi darhol 1xTE eritmasi yuzasiga suzadi va eriydi. DNKni -20 ° S haroratda saqlang (uzoq muddatli saqlash) yoki + 4 ° S (tez-tez ishlatib).
   
7. 
   VersaFluor fluorimetry yoki Smartspec Plus kyuvet spektrofotometri yordamida DNK kontsentratsiyasini aniqlang. NanoDrop® ND-1000 UV-Vis spektrofotometri yordamida DNK kontsentratsiyasini aniqlashni http://www.nanodrop.com saytida topish mumkin.
   
8. 
   Yangi mikrotubkalardagi DNK zahirasidagi eritmani 10 ng / mL
   

konsentratsiyasida suyultirib, 4 ° C da saqlang. DNK zaxirasini -20 ° C da saqlang. BioSan UV-Cleaner box-1200 PCR qutisiga yoki laminar oqim ostida steril sharoitda inkubatsiya aralashmasini tayyorlang. Reaktsiya aralashmasini tuzish uchun 0,6 ml Eppendorf naychalarini ishlating.
Reaktivlar:
1. "MilliyQ" deionizatsiyalangan suv;
2.10xb
25 mM MgCl2 o'z ichiga olgan PCR tampon (ishlab chiqaruvchi tomonidan Taq polimeraza bilan ta'minlangan);

3. 
   10 mM dNTPs eritmasi (deoksinukleotid trifosfatlar) (har bir dATP, dGTP, dCTP, dTTP ning 10 mM aralashmasi);
   
4. 
   RAPD primerlari;
   
5. 
   Taq-polimeraza eritmasi (ml uchun 5 birlik);
   
6. 
   Mineral moy (faqat "Tertsik MS-2 +" da kuchaytirish uchun);
   
7. 
   Shablon DNK namunasi (konsentratsiyasi 10 ng / ml);
   

PCR buferi (10x) quyidagi tarkibiy qismlarni o'z ichiga oladi: 100 mM Tris-HCl (pH 9.0); 500 mm KCl; 1% Triton X-100 va 25 mM MgCl2. Harorat ko'tarilganda Tris tamponining pH qiymati pasayishi (harorat koeffitsienti ~ -0,031 pH birliklari / ° C) va 72 ° C da ~ 7,5 ga teng bo'lishi sababli yuqori pH qiymati zarur. Taq polimerazasining optimal konsentratsiyasi reaksiya aralashmasining 20 ml ga 1 birlik ferment hisoblanadi. Triton X-100 - naycha yuzasida polimeraza adsorbsiyasini oldini oladi. MgCl2 ning ishchi kontsentratsiyasi oralig'i 1,5 dan 5,0 mm gacha. Mg2 + kontsentratsiyasining oshishi bilan kuchayish samaradorligi oshadi, ammo reaktsiyaning o'ziga xos xususiyati pasayishi mumkin. DNTP kontsentratsiyasining diapazoni 100 - 500 mM (200 mkM eng maqbul kontsentratsiya). PCR uchun RAPD primerining ishlatilgan konsentratsiyasi diapazoni: 0,2-1,0 µM.
Protokol:

1. 
   Master-Mix tayyorlang. Eksperimentni tashkil qilishda DNK va primerdan tashqari barcha kerakli komponentlarni o'z ichiga olgan PCR ("Master-mix") uchun umumiy reaksiya aralashmasini tayyorlash kerak. Buning uchun barcha namunalar va yana bir nechta namunalar uchun reaktsiya aralashmasining umumiy hajmini hisoblang. Masalan, 8 ta namunani kuchaytirish uchun 25 µl yakuniy hajm uchun 10 ta namuna uchun aralashma tayyorlang, u 250 µl (suvdan Taq polimerazigacha ketma-ketlikda) bo'ladi.
   
2. 
   Steril va imzolangan 0,5 ml naychaga PCR uchun 21 ml "Master-Mix" qo'shing;
   
3. 
   1xTE eritmasida 10 mkM konsentratsiyali primerlarni oldindan tayyorlash kerak. Buni qo'lda yoki jadvalda topish mumkin. 2: bitta reaktsiya uchun har bir primerning kerakli hajmi "Vpr =" ustunida; bundan tashqari, "Tm" ustunida ma'lum bir primer uchun talab qilinadigan tavlanish haroratini topishingiz mumkin.
   
4. 
   Har bir namuna uchun 0,6 µM yakuniy konsentratsiyasida 1,5 µL 10 µM
   

RAPD astar qo'shing;

5. 
   1 ta reaksiya uchun 0,8 mkl (2 akt. Birlik) tezligida Tag-polimeraza qo'shing;
   
6. 
   Probirkaga DNKning 2,5 ul (10ng / ul) namunasini qo'shing, reaksiya aralashmasidagi DNKning yakuniy konsentratsiyasi 1 ng / ul;
   
7. 
   Tertsik MC2 + kuchaytirgichida amplifikatsiyani o'tkazishda reaksiya aralashmasi ustiga 2 tomchi mineral moy soling, bu esa kuchaytirganda qizdirilganda aralashmani bug'lanishdan saqlaydi;
   
8. 
   Aralashmani muloyimlik bilan vortekslang;
   
9. 
   Tarkibni naychalarning pastki qismiga to'kib tashlang (2400 rpm da 5 soniya davomida santrifüj);
   
10. 
    Naychalarni termosikler qurilmasiga nosimmetrik yo'nalishda joylashtiring, jihoz qopqog'ini mahkam yoping;
    
11. 
    Kuchaytirish dasturini buyruqlar ketma-ketligi bilan boshlang: , ,
    , <25 µl>.
    
12. 
    Kuchaytirish tugagandan so'ng, buyrug'ini bajaring.
    

Har bir namuna uchun primerlar sonini va namunalar sonini kiritganingizda, reaktivlarning umumiy miqdori avtomatik ravishda hisoblab chiqiladi (barcha hajmlar ml bilan ko'rsatilgan). Chop etilgan jadval reaktsiya jarayoni va natijasini tavsiflovchi hujjat sifatida ishlatilishi mumkin. Kuchaytirishni quyidagi dasturga muvofiq Tertsik yoki MJ MiniCycler termosiklerida bajaring:

1. 
   Denaturatsiyadan oldin - 94 ° C, 4 min;
   
2. 
   O'ttiz beshta tsikl: 1) 95 ° C, 15 sek; 2) 37 ° C, 1 min; 3) 70 ° C, 2 min;
   
3. 
   Oxirgi cho'zish: 72 ° C, 5 min.
   

Amplifikatsiya tugagandan so'ng agarozli gelda DNKning elektroforezi. DNK agaroza gel elektroforezi
1. Kerakli miqdorda agarozni torting. Agaroza miqdori quyidagi formula bo'yicha hisoblanadi:
m = V * C / 100%, bu erda m - agarozaning grammdagi massasi, V - jelning mldagi hajmi, C - agarozaning foizda konsentratsiyasi.

2. 
   Agarozani 250 ml issiqlikka bardoshli shisha idishga soling va kerakli miqdordagi 1x TBE (yoki 1x STBE) bufer bilan to'ldiring.
   
3. 
   Kerakli etidiy bromid hajmini qo'shing (gelga qo'shilgan etidiy bromid hajmi gel miqdorining 1/10 qismiga teng (ml))). Qo'lqopli etidiy bromidi bilan ishlang, naychani ochishdan oldin uning tarkibini santrifüj bilan 3 soniya davomida muloyimlik bilan silkitib oling. 2400 rpmda.
   
4. 
   Jel qolipini tayyorlang va tayyorlangan qolipni gorizontal ravishda stol ustiga qo'ying. 5. Taroqni qolipning pastki qismidan taroq tishlariga qadar bo'lgan masofa 2 - 3 mm bo'lishi uchun teshiklarni joylashtiring, tashqi tishlar qolipning yon devorlariga tegmasligi kerak. Taroq qolipning uchlariga parallel bo'lishi kerak.
   

6. 
   Agarozni mikroto'lqinli pechda muntazam aralashtirish bilan to'liq eritmaguncha qizdiring. Qaynatgandan so'ng (katta pufakchalar paydo bo'lguncha kuting), kolbani olib tashlang va 55 ° - 60 ° C gacha soviting. Aralashga etidiy bromid qo'shing, yaxshilab aralashtiring va uni jel qolipiga quying. Taroqlarning holatini tekshiring va jelni 20-30 daqiqaga qoldiring.
   
7. 
   Amplifikatsiya aralashmasi bilan naychalarga 1 tomchi glitserin qo'shing, aralashmani yaxshilab vortekslang va naychalarni 5 sek. Santrifüj qiling. 2400 rpmda. Naychalarni mos ravishda joylashtiringnamunalarni qo'llash tartibi bilan. Jel to'liq qotib bo'lgandan keyin uni 1 baravar TBE tampon bilan to'ldiring va ehtiyotkorlik bilan taroqlarni tortib oling. Tamponni tashlang va alohida mikropipetka bilan jelga namunalarni (har biri 10 ul) va molekulyar og'irlik markerini (6 ul) qo'llang.
   
8. 
   Jelni elektroforez kamerasiga ehtiyotkorlik bilan joylashtiring, kamera qopqog'ini yoping, oqim manbasini yoqing va 5 V / sm elektroforez o'tkazing.
   
9. 
   Elektroforezni 2 soat davomida bajarish kerak, chiziqlar aniq ko'rinadiganligiga ishonch hosil qiling, tokni o'chiring, kamera qopqog'ini echib oling va jelni qolipdan oling (qo'lqop bilan ishlang).
   

Xulosa
Tibbiy genomikaning muvaffaqiyatli rivojlanishi mutatsiyalarning biologik va tibbiy ahamiyatini, genetik qayta tuzilishini, ularning sog'liq holati bilan bog'liqligini, kasallikdan oldin va turli patologiyalarni aniqlashga, diagnostika, profilaktika va terapiyaga yangi yondashuvlarni ishlab chiqishga imkon beradi. DNK va RNK molekulalarini (Ion torrenti, Illumina, RNK-seg) tez sekvensiya qilishning yangi usullarini, mikroarray texnologiyasini va bioinformatikani ishlab chiqish va tibbiy amaliyotga joriy etish tibbiyotning deyarli barcha sohalarida rivojlanishni ta'minlaydi. Hozirgi kunda AQSh va Evropada molekulyar genetik tadqiqotlarni, shu jumladan inson genomini to'liq sekvensiyalashni (masalan, 23 va Me, AQSh) tezkor va samarali bajaradigan yirik biomedikal kompaniyalar faoliyat yuritmoqda. Shu bilan birga, bunday tadqiqotlarni o'tkazish, natijalarni baholash va sharhlash uchun talablar ishlab chiqilmoqda. Rossiya, Ukraina va Belorussiya olimlari va amaliyotchilari ushbu yo'nalishda ish boshlashmoqda. Shu nuqtai nazardan, ushbu texnologiyalarning iste'molchilari jismoniy shaxslarning PGS narxining asta-sekin pasayishini kutmoqdalar (tez orada - 1000 dollar, keyin esa 300 va hatto 100), bu ko'plab keng tarqalgan muntazam laboratoriya tahlillari narxi bilan taqqoslanadi. Genomika bo'yicha tadqiqotlarning tijoratlashtirilishi yangi xizmat turini, yangi mulk huquqlarini (genlarning birlamchi tuzilishiga, yangi testlarga) bozor yaratadi, fundamental tadqiqotlar natijalarini amaliyotga tatbiq etishni tezlashtiradi. Sog'lom shaxslar va turli xil kasalliklarga chalingan bemorlarning PGS natijalarini bosqichma-bosqich to'plash milliy ma'lumotlar bazalarini shakllantirish, ma'lum bir patologiyaga xos bo'lgan genetik o'zgarishlarni tahlil qilish va aniqlash va ushbu natijalardan profilaktika va klinik maqsadlarda foydalanish imkonini beradi. Aholining genomiga oid yangi ma'lumotlar vaktsinalarni ishlab chiqish va immunizatsiyalashda genomga yo'naltirilgan yoki shaxsiylashtirilgan yondashuvlar tamoyillari uchun foydali bo'ladi. Intellektual nuqsonlari, ruhiy kasalliklari, autizm, tug'ma nuqsonlari, molekulyar genetik mexanizmlarni yaratish va ularning sabablari bo'lgan bolalar va kattalarning genom darajasida laboratoriya diagnostikasi yanada qulay va odatiy holga aylanadi. Farmakogenomika, yangi dori vositalari va qo'llanmalarini yaratish sohasida alohida yutuqlar kutilmoqda. Ba'zi dorilar bilan terapiyaga javob bermaydigan bemorlarda PGS genomlarining jadal rivojlanishi bu hodisani bartaraf etish sabablari va usullarini aniqlashga imkon beradi. Ko'pgina dori vositalaridan foydalanish samaradorligi hozirda taxminan 30-60% gacha baholanmoqda. PSG natijalarini giyohvand moddalarga haddan tashqari reaktsiyasi bo'lgan bemorlarda qo'llash qiziq tuyuladi