O‘zbekiston respublikasi oliy va o`rta maxsus ta`lim vazirligi

Sanger boʻyicha sekvenirlash: zanjir terminatsiyasi usuli
DNKning 900900900 asos juftiga ega boʻlgan qismi asosan Sanger boʻyicha sekvenirlash yoki zanjir terminatsiya deb nomlanuvchi usullar yordamida sekvenirlanadi. Sanger boʻyicha sekvenirlash 1977-yilda britaniyalik olim Fred Sanger tomonidan kashf qilingan. Inson genomi loyihasida Sanger boʻyicha sekvenirlash inson DNKsining nisbatan kichik fragmentlari ketma-ketligini aniqlash uchun ishlatiladi. (Ushbu fragmentlar 900900900 aj dan kam boʻlmasligi kerak edi, lekin tadqiqotchilar koʻp marotaba Sanger usulini qoʻllash yordamida har bir fragmentni oʻrganish imkoniga ega boʻldi.) Fragmentlar DNKning kattaroq qismlari va butun xromosomaga birlashish uchun ketma-ket tizilib, bir-birining ustiga joylashadi. Garchi hozir genom tezkor va arzon usullar yordamida sekvenirlanayotgan boʻlsa ham, Sanger boʻyicha sekvenirlashDNKniklonlashyokipolimerazazanjirreaksiyasi(PZR) orqali hosil qilingan DNKning alohida fragmentlarini sekvenirlash uchun qoʻllanadi.
Sanger boʻyicha sekvenirlashda ishlatiladigan ingrediyentlar
Sanger boʻyicha sekvenirlashda DNK nishon qismining nusxasi koʻp marotaba olinadi. Buning uchun kerakli ingrediyentlar inson organizmidagiDNKreplikatsiyasiyoki DNKni in vitro koʻpaytiruvchi polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) uchun kerak boʻladigan ingrediyentlar bilan oʻxshash. Bular quyidagilar:

• 
  DNK polimeraza fermenti
  
• 
  Praymer. DNKning bir zanjirli kichik qismi boʻlib, andoza DNKga bogʻlanadi va
  

polimeraza uchun “boshlab beruvchi” vazifasini bajaradi.

• 
  Toʻrtta DNK nukleotidlari (dATF, dTTF, dSTF, dGTF)
  
• 
  Ketma-ketligi aniqlanishi kerak boʻlgan andoza DNK
  

Lekin Sanger boʻyicha sekvenirlash reaksiyasi uchun oʻziga xos (yagona) ingrediyent ham kerak boʻladi:

• 
  Dideoksi yoki zanjir terminatsiyalovchisi – har biri har xil rangli boʻyoq bilan boʻyalib nishonlangan toʻrtta nukleotid (ddATF, ddTTF, ddSTF, ddGTF)
  

1-rasm: “Butun-genomnisekvenirlash: OpenStax College, Biology (CC BY4.0)._
Dideoksi nukleotidlar doimiy yoki deoksi nukleotidlarga oʻxshash, lekin bitta farqi – uglevod halqasidagi 3’ uglerodda gidroksil guruhning yoʻqligi. Doimiy nukleotidda 3’ gidroksil guruh mavjud zanjirga yangi nukleotidlarni biriktirish uchun “ilgich” vazifasini bajaradi. Zanjirga dideoksi nukleotidi birikkach, boʻsh gidroksil guruhi qolmaydi va yangi nukleotidlar birikmaydi. Zanjir dideoksi nukleotid bilan tugaydi, asos turiga qarab (A, T, S yoki G) boʻyoqning maʼlum bir rangi bilan boʻyaladi. [Boʻyoq qayerga biriktiriladi?]
Sanger boʻyicha sekvenirlash usuli
Sekvenirlanishi kerak boʻlgan DNK namunasi probirkada praymer, DNK polimeraza va nukleotidlar (dATF, dTTF, dGTF va dSTF) bilan aralashtiriladi. Toʻrtta boʻyalib nishonlangan zanjir terminatsiyalovchi dideoksi nukleotidlar ham qoʻshiladi, lekin oddiy nukleotidlarga qaraganda kamroq miqdorda. Dastlab andoza DNKni denaturatsiyalash (zanjirlarini ajratish) uchun aralashma qizdiriladi, keyin esa praymer bir zanjirli andozaga bogʻlanishi uchun sovitiladi. Praymer bogʻlangach, harorat yana oshiriladi, bu DNK polimerazaga praymerdan boshlab yangi DNK zanjiri sintezlashi uchun sharoit yaratadi. DNK polimeraza zanjirga nukleotid biriktirishni boshlaydi, bu holat normal nukleotid oʻrniga dideoksi nukleotidni zanjirga biriktirguncha davom etadi. Shu nuqtada boshqa nukleotidlar qoʻshilmaydi, shuning uchun zanjir dideoksi nukleotid bilan tugaydi. Bu jarayon bir nechta sikl davom etadi. Sikl tugagandan soʻng kamida bitta reaksiya davomida nishon DNKning har biriga dideoksi nukleotidi qoʻshilishi deyarli kafolatlanadi. Reaksiya oxirida, probirkada har birining tarkibida boshlangʻich DNKdagi nukleotidlarga ega boʻlgan turli uzunlikdagi fragmentlar boʻladi (quyidagi rasmga qarang). Fragmentlarning oxirgi uchlari soʻnggi nukleotidni koʻrsatuvchi boʻyoqlar bilan yorliqlangan.

2-Rasm “Sangerboʻyichasekvenirlash”, Estevezj (CCBY-SA3.0). (CCBY-SA 3.0) ruxsatnomasi asosida takomillashtirildi.
Reaksiya tugagach fragmentlar oʻzida gel saqlagan uzun va ingichka nay boʻylab harakatlana boshlaydi, bu jarayon kapillyar gel elektroforezi deb nomlanadi. Qisqa fragmentlar geldagi poralar orqali tez harakatlanadi, uzunlari esa sekinroq harakatlanadi. Har bir fragment probirka oxiridagi “finish” chizigʻini bosib oʻtgandan soʻng, boʻyoqni aniqlashga yordam beruvchi lazer nuri bilan yoritiladi. Eng kichik fragment (praymerdan keyin bitta nukleotid bilan tugaydigan) finish chizigʻini birinchi bosib oʻtadi, ikkinchi boʻlib undan kattarogʻi (praymerdan keyin ikkita nukleotid bilan tugaydigan) bosib oʻtadi va shu tariqa davom etadi. Shunday qilib, boʻyoq ranglari birin-ketin detektor (aniqlagich)ga yozib olinadi, boshlangʻich DNK boʻlagining ketma-ketligi maʼlum vaqt ichida tiklanadi. Detektor tomonidan yozib olingan maʼlumotlar yuqoridagi xromatogrammada koʻrsatilganidek, fluoressent nurlarining yuqori nuqtaga chiqishini oʻz ichiga oladi. Xromatogrammadagi DNK ketma-ketliklari shu yuqori nuqtalar orqali oʻqiladi.
Foydalanish va cheklovlar
Sanger boʻyicha sekvenirlash nisbatan uzun (900900900 tagacha asos juftlariga ega boʻlgan) DNK zanjirlari ketma-ketligini aniqlashda yaxshi natija beradi. U odatda DNKningbakteriyaplazmidlariyokiPZRda nusxasi olingan alohida DNK boʻlaklarini sekvenirlash uchun ishlatiladi. Shu bilan birga, Sanger boʻyicha sekvenirlash katta hajmdagi loyihalar, masalan, butun genomni yoki metagenomni (mikroblar jamoasining “kollektiv genomini”) sekvenirlash uchun qimmat va samarasiz hisoblanadi. Bu kabi vazifalar uchun yangi, keng miqyosli sekvenirlash usullari tezkor va arzonroq. Bu nom xit boʻlgan qoʻshiq nomiga oʻxshab eshitilishi mumkin, lekin aslida ham shunday nomlanadi! Soʻnggi DNK sekvenirlash usullarining nomi umumiy qilib yangi avlod sekvenirlash deb nomlanadi. Turli xil texnologiyalardan foydalanadigan har xil yangi avlod sekvenirlash usullari mavjud. Biroq ularni Sanger boʻyicha sekvenirlashdan ajratib turadigan bir qator xususiyatlar mavjud:

•