11
Biokimyəvi eksperimentlər fiziologiyada olduğu kimi, həm tam orqanizm
səviyyəsində, həm də orqanizmdən təcrid edilmiş orqan və ya toxuma üzərində
aparıla bilər.
Bununla birlikdə, biokimyəvi təcrübələri orqan, toxuma və hü-
ceyrə preparatları, həmçinin maya göbələkcikləri, bakteriyalar və viruslar
üzərində aparmaq olar.
Biokimyəvi eksperiment canlı orqanizm üzərində aparıldığına görə, tədqi-
qat üçün hər hansı bioloji material götürülərkən, orqanizmə zərər vurmamaq
məqsədilə maksimal surətdə əsirgəyici üsullardan istifadə edilir, bəzən isə bio-
loji molekulları fiziki-kimyəvi analiz üsulları vasitəsilə
tədqiq etmək üçün bir
sıra əlavə hazırlıq tədbirləri görülür. Doğrudur, eksperimental tədqiqat zamanı
bir sıra hallarda bioloji material təcrübə aparılan heyvan öldürüldükdən sonra
da götürülə bilər. Lakin belə hallarda heyvanı öldürmək və bioloji material
götürmək üçün ciddi müəyyənləşdirilmiş üsullardan istifadə edilir ki, öyrənilən
biokimyəvi göstəricilər əlavə təsirlər nəticəsində dəyişikliyə uğramasın.
Biokimyəvi tədqiqat məqsədilə orqanizmin bioloji mayelərindən (qan,
limfa, hüceyrəarası maye, sidik və s.), bütöv orqanizmdən, təcrid edilmiş orqan
və toxumalardan, toxuma kəsiklərindən, orqanların homogenatlarından, eks-
traktından, hüceyrə orqanoidlərindən, maya göbələkciklərindən,
bakteriya-
lardan və digər bioloji materialdan istifadə edilir.
Bütöv heyvan orqanizmləri
üzərində aparılan biokimyəvi tədqiqat-
lardan bioloji kimyanın inkişafının erkən mərhələlərində nisbətən geniş istifadə
edilirdi. Belə tədqiqatlar müxtəlif qida amillərinin orqanizm üçün əhəmiy-
yətinin aydınlaşdırılmasında böyük əhəmiyyətə malik olmuşdur. Bu üsulla
qidalanmanın xarakterini (qidanın tərkibini) dəyişməklə aparılan təcrübələr
əvəzedilməz qida amilləri haqqında mülahizələrin meydana çıxmasına səbəb
olmuş, vitaminlərin və bir sıra aminturşuların bioloji əhəmiyyəti aşkara çıxarıl-
mışdır. “Əvəzedilməz qida amilləri”“ adı altında elə birləşmələr nəzərdə tutulur
ki, onlar maddələr mübadiləsinin, inkişaf və çoxalma proseslərinin tənzimində
müəyyən əhəmiyyətə malik olduqları halda, orqanizmdə
sintez edilmir və
yalnız qidanın tərkibindən mənimsənilir. Vitaminlər və aminturşuların bir
qrupu məhz belə amillərə aiddir.
Təcrid edilmiş orqanlar
üzərində aparılan təcrübələrin biokimyanın
inkişafında böyük rolu olmuşdur. Bu məqsədlə orqanizmdən ayrılan bu və ya
digər orqan (məsələn, qaraciyər) xüsusi qidalı mühitdə saxlanılır və onun
damarlarından fasiləsiz surətdə müəyyən maye (qan, plazma, süni məhlullar)
keçirilir (bu prosesə
perfuziya
deyilir). Perfuziya edilən mayeyə tədqiq ediləcək
maddə əlavə etməklə, bu maddənin tədqiqat aparılan orqanda hansı dəyişikliyə
uğradığı müəyyənləşdirilir.
Tədqiqat üçün
toxuma kəsikləri
elə hazırlanmalıdır ki, onların qalınlığı ən
minimal səviyyədə olsun. Bu məqsədlə xüsusi ultramikrotomlar vasitəsilə
qalınlığı hətta bir hüceyrənin ölçülərindən artıq olmayan kəsiklər hazırlanır və
tərkibinə görə orqanizmin daxili mühitinin mayelərinə yaxın olan maye
mühitdə saxlanılır. Bu mayeyə biokimyəvi çevrilmələrinin öyrənilməsi plan-
laşdırılan maddə əlavə edilir və müəyyən müddət bədən temperaturuna müva-
fiq şəraitdə saxlanılır (buna
inkubasiya
deyilir). Bu şəraitdə aparılan histokim-
yəvi tədqiqatın maddələr mübadiləsinin bir sıra mərhələlərinin öyrənilməsində
12
böyük əhəmiyyəti olmuşdur.
Hüceyrədaxili mayenin və hüceyrə orqanoidlərinin
tərkibinin biokimyəvi
analizi zamanı xüsusi hazırlıq tədbirləri tələb olunur. Çünki, hüceyrələr və
hüceyrə orqanoidləri membran vasitəsilə əhatə edildiyindən, onların daxili
mühitindəki maddələr analiz üçün qabaqcadan azad edilməlidir. Hüceyrə
membranları müxtəlif kimyəvi birləşmələri müxtəlif sürətlə keçirir; bəzi
maddələr isə ümumiyyətlə membranlardan keçə bilmir (bunlara ilk növbədə
hidrofob xassəli maddələr aiddir).
Buna görə, hüceyrədaxili mühitdə olan
maddələri ayırmaq üçün toxumaları doğrayıb xırda hissəciklər şəklinə saldıq-
dan sonra müəyyən tərkibli maye ilə qarışdırıb, homogen kütlə halına düşənə
qədər əzirlər. Bu proses
homogenizasiya
adlanır. Homogenizasiya etmək
məqsədilə çox vaxt Potter homogenizatorundan istifadə edilir. Bu cihaz dibi
sferik şəkildə olan qalın divarlı sınaq şüşəsindən və onun daxili diametrinə
uyğun gələn porşendən ibarətdir. Porşen xüsusi elektrik mühərriki vasitəsilə öz
oxu ətrafında fırladılır; içərisində toxuma kəsikləri olan sınaq şüşəsi yuxarı və
aşağı hərəkət etdirilir. Bu zaman tədricən toxuma kəsikləri əzilir,
hüceyrələr
parçalanıb dağılır, hüceyrə orqanoidləri isə tamlığını saxlayır. Bu üsulla əldə
edilən homogenat bioloji fəallığını saxlayır.
Homogenləşdirmə zamanı istifadə edilən mayenin tərkibi elə olmalıdır ki,
tədqiq ediləcək maddənin tərkibinin və bioloji fəallığının dəyişməsinə səbəb
olmasın. Təsvir edilən üsulla əldə edilən homogenat sentrifuqalaşdırma yolu ilə
fraksiyalara ayrılır. Bu zaman sentrifuqanın üst hissəsində sitozol mayesi, aşağı
təbəqədə isə hüceyrə orqanoidləri toplanır. Sitozol fermentləri və digər bioloji
molekullar maye təbəqənin tərkibində tədqiq edilir. Bu maye müvafiq orqan və
ya toxumanın ekstraktı adlanır.
Biokimyəvi tədqiqatda hər hansı bir hüceyrə orqanoidinin öyrənilməsi
nəzərdə tutulduqda həmin orqanoid mümkün qədər təmiz halda əldə edil-
məlidir. Bu məqsədlə orqan və toxuma homogenatını sentrifuqadan keçir-
dikdən sonra, alınan çöküntünü fraksiyalara ayırırlar.
Hüceyrə orqanoidlərini fraksiyalara ayırmaq üçün
homogenizasiya
,
ekstraksiya
və
sentrifuqalaşdırma
proseslərindən istifadə edilir.
Orqanoidlərin ekstraksiyası
elə şəraitdə aparılmalıdır ki, onlar zədələn
-
məsin. Buna görə, ekstraksiya prosesi yüksək temperatur şəraitində aparılma-
malı, bundan ötrü istifadə edilən məhlulun pH-ı
və osmos təzyiqi isə hücey-
rədaxili mühitin eyni göstəricilərinə bərabər olmalıdır. Çox vaxt tədqiq
ediləcək fermentlərin fəallığını mühafizə etmək məqsədilə, ekstraksiya prosesi
0-4
o
C temperaturda həyata keçirilir. Orqanoidlərin ekstraksiyası üçün çox
istifadə edilən məhlullardan birinin tərkibinə fizioloji qatılıqlara müvafiq gələn
miqdarda kalium və maqnezium ionları ilə birlikdə 0,25 M saxaroza daxildir;
bu məhlulun pH-ı 0,5 M qatılıqlı xlorid turşulu tris-bufer (tris-hidroksimetil-
aminometanhidroxlorid) məhlulu əlavə edilməklə, 7,4-ə çatdırılır; bundan
fərqli olaraq, lipidlərin ekstraksiyası üçün üzvi həlledicilərdən istifadə edilir.
Bu məhlullarla qarışdırıldıqdan sonra homogenizasiya edilən toxuma kütləsi
ilk dəfə aşağı sürətlə sentrifuqalaşdırılır; alınan çöküntüdən
Dostları ilə paylaş: