Patrón de Astaxantina

TRABAJO DESARROLLADO EN EL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DR. RICARDO JORGE (INSA) EN EL ÁMBITO DEL

PROYECTO

PREPARACIÓN DE ENVASES ACTIVOS CON CAPACIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANA BASADOS EN ASTAXANTINA Y QUITOSANO.

Investigadores:

Ana Sanches Silva
Helena Soares Costa
1- Articulo de diseminación del Proyecto

El INSA en colaboración con todos los participantes ha escrito un artículo de diseminación del proyecto a ser publicado por el “Nutrition Bulletin” del British Nutrition Foundation.

2- Determinación del α-tocoferol por UPLC-UV.
Se ha desarrollado un método para determinación del α-tocoferol por Cromatografia Líquida de Ultra Resolución (UPLC) con detector de ultravioleta (UV).
El gradiente usado ha sido el siguiente:

0 min: 10% água y 90% acetonitrilo

1.5 min: 100% acetonitrilo

5 min: 100% acetonitrilo

Este método permite también la determinación del antioxidante BHT.
Los tiempos de retención típicos con este gradiente y usando la columna UPLC BEH (50 x 2.1 mm) con 1.7 μm de diámetro de partícula son 0.9 min para el BHT y 3.9 min para el α-tocoferol (ver Figura 1). La detección del α-tocoferol ha sido hecha a 295 nm.
La recta de calibración obtenido está apropiada para cuantificación del α-tocoferol (r² = 0.999) entre 1.022 y 102.2 μg/mL.
El extracto de camarón ha sido extraído de la siguiente forma: la muestra (0.12 g) ha sido extraída con 5 mL de solvente de extracción. Dos solventes han sido probados: metanol y acetonitrilo. Después de homogenizada la muestra durante 20 segundos en el vortex y 10 minutos con ultrasonidos, ha sido centrifugada durante 15 minutos a 3000 rpm. La fase superior ha sido filtrada por un filtro GHP de 0.2 μm y 10 μL han sido inyectados en el UPLC.
Las cantidades encontradas han sido las siguientes: 49.8 mg/100 g extracto para el ensayo hecho con metanol y 55.7 mg/100 g para la muestra extraída con acetonitrilo. Se ha hecho también una prueba con metanol en que la extracción decorría durante 18 h. La cantidad encontrada en este extracto ha sido de 50.5 mg/100 g muestra.

Estos resultados son la media de dos ensayos realizados en las mismas condiciones.

Los valores encontrados están de acuerdo con los encontrados en la bibliografia (López-Cervantes J, Sánchez-Machado DI, Ríos-Vázquez NJ. High-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of retinol, alpha-tocopherol, and cholesterol in shrimp waste hydrolysate. J Chromatogr A., 2006,10,1105(1-2):135-9)



Figura 1: Cromatograma de un extracto de desecho de camarón.
En esta determinación ha participado la doctoranda carolina Bueno Solano durante su visita al INSA.

3. Ensayos para el desarrollo de un método para determinar Astaxantina por UPLC-UV.
Varios ensayos han sido realizados para optimizar las mejores condiciones para determinar la astaxantina.
Las mejores condiciones han sido obtenidas con las siguientes condiciones:
Columna: UPLC BEH (50 x 2.1 mm) con 1.7 μm de diámetro de partícula

Temperatura de la columna: 20 ºC

Gradiente:

Fase móvil A- agua ultrapura

Fase móvil B- acetonitrilo:metanol (con acetato de amonio 0.05 M):diclorometano

Flujo: 0.5 mL/min

Gradiente:

Tiempo (min)	%A	%B
0	25	75
9.0	17	83
9.1	0	100
18.0	0	100
18.1	30	70
22.0	30	70

En la figura 2 se puede ver un patrón de astaxantina disuelta en metanol con BHT (0.01%) y en la figura 3 se puede ver el espectro de absorbancia obtenido entre 200 y 500 nm. Este método cromatografico permite no solo evaluar la existencia de astaxantina en el extracto pero también determinar la presencia de vitamina A, vitamina E y otros 6 carotenoides (zeaxantina, luteina, β-criptoxantina, licopeno, α- caroteno y β-caroteno.

Figura 2: Cromatograma de un patrón de astaxantina disuelta en metanol com BHT (0.01%).


Figura 3: Espectro de la astaxantina (pico con el tiempo de retención de 4.79 min de la figura anterior).
Se han analizado muestra de camarón comprado en un supermercado local. Se ha comprado camarón crudo congelado y camarón cocido refrigerado.
A los dos tipos de camarón se han quitado las cáscaras y estas han sido homogeneizadas en un ultra turrax. En seguida se han centrifugado en una centrifuga a 6000 rpm durante 20 minutos.

La fase superior ha sido separada. La del camarón crudo era ligeramente rosa y la del camarón cocido era más clara. 0.5 g de este ha sido extraído com 5 mL de metanol que contenía 0.01% BHT. A continuación se llevó al vortex (1 minuto) y ultrasonidos (10 minutos) y se ha centrifugado a 6000 rpm durante 15 minutos. La fase superior ha sido filtrado por un filtro GHP 0.2 μm y 10 μL han sido inyectado en el cromatografo.

En la figura 4 se puede ver un cromatograma del extracto de desecho de camarón crudo y en la figura 5 se puede ver un cromatograma del extracto de desecho de camarón crudo con astaxantina añadida. Se comprueba que se trata del pico que sale a 4.7 minutos.




Figura 4: Cromatograma de un extracto de desecho de camarón crudo.


Figura 5: Cromatograma de un extracto de desecho de camarón crudo con astaxantina añadida.
En la figura 6 se puede ver un cromatograma del extracto de desecho de camarón cocido. El pico de la astaxantina es considerablemente menor.


Figura 6: Cromatograma de un extracto de desecho de camarón cocido.

Se hizo tambien la extracción del desecho de camarón que hemos recibido. La extracción se ha hecho primero con 0.12 g de muestra y 5 mL de metanol, pero como no se pudo identificar la astaxantina se ha aumentado la cantidad de muestra hasta 1g. El cromatograma obtenido corresponde a la figura 7. Todo indica que la muestra ya podrá estar oxidada.

Figura 7: Cromatograma del extracto de desecho camarón recibido desde México.
Todo indica que está esta muestra está oxidada ya que no se pudo identificar la astaxantina. En futuras pruebas se deberá testar el método de extracto con un extracto más reciente.

En el trabajo futuro se desarrollará un método para cuantificar glucosamina en el desecho de camarón por UPLC.