Periferik kandan dna izolasyonu
Yüklə 68,42 Kb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Beş tip beyaz kan hücreleri (akyuvar) ve lökositler (white blood cells (WBCs) veya leukocytes)
- Bazofiller ( basophils
- Figür 1. Kanın santrifüj sonu meydana getirdiği gradient.
- Lökositler (leukocytes)
- Figür 2. Lökositler Kan pulcukları (Platelets)
KOÜ TIP FAKÜLTESİTIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI DÖNEM I ÖĞRENCİ LABORATUVARI / 2 KANDAN DNA İZOLASYONU VE ELEKTROFOREZİ KESİMİ HARİTALANMASI VE BLOTLANMASI KANKan bir sıvı dokudur. Su içeriği fazla olan plazma, yedi tip hücre ve hücre fragmentlerinden meydana gelir.
Eğer bir kan örneği, pıhtılaşmayı önleyici kimyasallarla (EDTA gibi) muamele edilip santrifüj edilirse; Alyuvarlar tüpün dip kısmına, akyuvarlar ise kanın en üstte toplanan plazma kısmı ile alyuvarlar arasına yerleşir.
Figür 1. Kanın santrifüj sonu meydana getirdiği gradient.Eritrositler (erythrocytes)Kanda en çok bulunan hücre tipidir.
Lökositler (leukocytes)
LenfositlerPek çok lenfosit tipi vardır. Her birinin farklı bir işlevi olan lenfositlerden en yaygın olanları:
Figür 2. LökositlerKan pulcukları (Platelets)Kan pulcukları megakaryositler tarafından üretilen hücresel fragmentlerdir. Kan pıhtılaşmasında ve damar yaralanmalarında görev yapar. Plazma (Plasma)Kan hücrelerinin içersinde bulunduğu, açık sarı renkli sıvı yapıdır. Plazma hücrelerin ihtiyacı olan ve uzaklaştırılması gereken maddelerin taşınımında görev yapar.
DNA İZOLASYONU İnsan genomik DNA’sı 3x 109 nukleotid uzunluğundadır. Genomik DNA bütün nükleusu bulunan hücrelerde bulunur ve bu hücreler genomik DNA analizleri için kullanılabilir. Örneğin; prenatal tanı için amniyotik sıvıdaki fetal hücrelerden veya koryonik hücrelerde genomik DNA elde edilebilir. Erişkinlerde periferal kandaki lökositler en kolay ulaşılabilen DNA kaynağıdır. EDTA’lı tüplere alınan 10 ml kan yaklaşık olarak 108 beyaz kan hücresi içerir ve bu miktar hücreden elde edilecek genomik DNA pek çok genetik test için yeterlidir. DNA izolasyonu için pek çok metod vardır. Geleneksel izolasyon yöntemlerinin yanında pek çok firma tarafından üretilen DNA izolasyon kitleri DNA izolasyonunda kullanılmaktadır. Ayrıca mRNA kullanarak sentezlenen cDNA’da bir diğer DNA kaynağıdır. DNA degredasyona karşı dayanıklı bir polimerdir ve uygun saklama şartlarında uzun yıllar korunup tekrar tekrar analizlerde kullanılabilir. Tıbbi Biyoloji laboratuarında yaygın olarak kullanılan amonyum asetat yöntemi ile DNA izolasyonu aşağıda açıklanmıştır.
PCR Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir in vitro ve in vivo DNA amplifikasyon metodudur, reaksiyonlar farklı sıcaklıklardaki üç olayın sikluslar halinde tekrarına dayanmaktadır. PCR ile DNA fragmentleri çoğaltılabilir ve çok küçük örneklerden analizler için yeterli miktarlar elde edilebilir. Gerekli olan reaktifler: 1) kalıp olarak kullanılacak DNA (genomik DNA); 2) iki tane tek iplikli sentetik DNA oligonükleotidi (forward ve reverse primer), PCR yapılmak istenen gen dizisini belirler; 3) dört tip deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs); 4) yüksek ısıda çalışabilecek bir DNA polimeraz (Taq DNA pol.). PCR üç ana siklusun tekrarlarından meydana gelir:
Deneturasyon ve extension fazlarındaki ısılar değizmezken annealing (eşleşme) ısısı istenen DNA dizisinin AT/GC içeriğine göre değişir. Sikluslar yaklaşık 30 defa tekrar edilir. Yeni sentezlenen fragmentler bir sonraki siklusta kalıp görevi görürler böylelikle her siklusta çoğaltılmak istenen dizinin logaritmik (2n, n=30-35 döngü) bir artışı söz konusudur. PCR ile 150–3000 nükleotidlik diziler çoğaltılabilir. primerler 1 mM dNTP’s 2 mM 10 X Buffer (MBI) 1x MgCl 1.50 mM Taq(MBI) 1U DNA 100 ng 
Figür 3. PCR RFLP Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analizi restriksiyon endonükleazların çift iplikli DNA’yı spesifik tanıma bölgelerinden kesmesi temeline dayanmaktadır. Endonükleazlar bakteriler tarafından bakteriyofaj infeksiyonuna karşı savunma amacıyla üretilirler. Bu enzimler bakteriyofaj DNA’sını tanıyıp parçalarken bakterinin kendi DNA’sına zarar vermezler. Her bir restriksiyon endonükleaz spesifik palendromik kısa DNA dizisini tanır ve keser. PCR ile çoğaltılan DNA bölgesi restriksiyon enziminin kesimine tabi tutulur. Oluşan DNA fragmentleri jel elektroforezi ile fragment büyüklüklerine göre ayrılırlar. DNA mutasyonları enzimin kesme noktasını ortadan kaldırabilir veya yeni bir enzim kesme noktası oluşturabilir, böylelikle kesim sonucu oluşan fragment sayısını değiştirirler. Restriksiyon bölgeleri arasındaki insersiyon veya delesyon mutasyonları da fragment büyüklüklerini değiştirirler. Genomda kodlama yapan ve yapmayan bölgelerde restriksiyon enzim tanıma bölgelerinin dağılımı insanlar arasında farklıdır. Bu farklılıklar doğal genomik çeşitliliği yansıtır ve genellikle fenotipik bir sonucu olmayan RFLP’leri oluşturur. Bunun yanında RFLP analizleri genetik hastalıkların association ve linkage çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır. Hastalıkla ilişkilendirilen aday gendeki RFLP’ler, etkilenmiş bireyler ve kontroller arasındaki allel frekansları dikkate alınarak ilgili mutasyon ve genin hastalıkla ilişkisini ortaya koymada oldukça kullanışlı bilgi vermektedir. Kesim ürünlerinin poliakrilamid jel elektroforezi Hazırlanan jelin elektroforezi için dikey elektroforez cihazı kullanılır. Jelin kalınlığı 0.5 mm olarak ayarlanır. Yüzde sekizlik non denatüre PAGE stok solüsyonuna sırası ile % 10’luk APS stoğundan %1 hacim ve TEMED’den %0.1 hacim ilave edilip 0.5 mm’lik cam aralığına dökülür. Polimerizasyonun tamamlanması için en az 1/2 saat beklenir. Polimerizasyon sonrası camlar elektroforez cihazına yerleştirilir, 1X TBE içeren yürütme tamponu ilave edilip örnekler jel kuyucuklarına yüklenir. Yükleme tamponu içinde bulunan ve elektrik alanda hareket eden DNA brom fenol mavisi ve ksilen siyanol boyaları yardımıyla jel üzerinde takip edilir. 
Figür 4. Restriksiyon kesimi ve jel görüntüsü. GENETİK POLİMORFİZM Genetik terminolojisinde belirli bir kromozomal lokasyondaki (locus), belirli DNA dizilerinin farklı versiyonlarına allel adı verilir ve genetikçiler polimorfik terimini, populasyonda yaygın olarak iki veya daha çok alleli bulunan bir geni tanımlamada kullanırlar. Monomorfik gen, bir populasyonda ağırlıklı tek allel olarak bulunan gendir. Bir allelin populasyondaki yaygınlığı en az %99 oranında bulunuyorsa bu gen monomorfiktir. Diğer bir anlatımla, polimorfik gen iki veya daha fazla allele sahip olmalı ve bu alleller populasyonda %1’den fazla oranda bulunmalıdır. Bunlara karşılık populasyonda %1’den daha az gözlenen allele ise nadir varyantlar (rare variant) adı verilir. Bazı alleller, genler arasındaki veya intronlar içersindeki DNA dizilerindeki değişikliklerle oluşurlar, bu değişimlerin genin fonksiyonu üzerine bir etkisi yoktur, bu tip alleller sadece direkt DNA analizi ile belirlenebilirler. Kodlama yapan diziler içersindeki değişimler sonucu oluşan alleller farklı protein varyantlarının oluşumuna neden olup ciddi fenotipik bozukluklar, değişimler ortaya çıkarabilirler. Genetik hastalıklara sebebiyet veren çoğu mutasyon (hepsi değil) nadir varyantlardır ve bu alleller genetik diversitenin en belirgin formlarıdır. Doğadaki pek çok populasyonda, genlerin büyük bir yüzdesi polimorfiktir. Bununla birlikte, küçük populasyonlarda (örneğin; nesli tükenmekte olan) genetik varyasyonun çok düşük olması beklenir çünkü gen havuzu az sayıdaki bireylerden meydana gelmiştir. SNP SNP’ler DNA dizisindeki varyasyonlardır, genomdaki dizide meydana gelen tek nükleotidlik (A, T, G veya C) değişim sonucu meydana gelir. Örneğin bir SNP DNA dizisini AAGGCTAA’dan ATGGCTAA’ya çevirebilir. Bir varyasyonun SNP olarak kabul edilebilmesi için, populasyonda en az %1 oranında izlenebiliyor olması gerekmektedir. Her üç SNP’den ikisi sitozinin (C) timinle (T) yer değiştirmesinden oluşur. SNP’ler bir genin hem kodlama yapan hem de kodlama yapmayan bölgesinde bulunabilir. Pek çok SNP’nin hücresel fonksiyon üzerine bir etkisi yok iken, bir kısmının hastalıklarda etkisi olduğu gösterilmektedir. İnsan DNA dizisinin %99’dan daha fazlasının aynı populasyonda aynı olmasına rağmen, DNA dizilerindeki varyasyonların insanların hastalıklar, virus, bakteri, toksinler, kimyasallar gibi çevresel faktörlere, ilaçlara ve diğer terapilere nasıl cevap vereceği üzerine önemli etkileri vardır. Bunlar da SNP’lerin çalışılmasını biyomedikal araştırmalar veya tıbbi teşhisler açısından çok değerli yapmaktadır. SNP haritalarının, kanser, diyabet, vaskular hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve zekâ bozuklukları gibi pek çok karmaşık hastalıkla ilişkili genlerin belirlenmesine yardımcı olacaktır. SNP’ler evrimsel olarak mikrosatellit markerlarına göre daha stabildirler, daha düşük mutasyon oranına sahiptirler. Bir generasyondan diğerine değişimleri az olduğundan populasyon çalışmalarında kullanılmaları daha kolay ve bilgilendiricidir. Bunun yanında SNP’lerin sayılarının fazla oluşu hastalık ve allel korelasyonunun kurulmasında şans ve avantaj doğurmaktadır. SSCP (single strand conformation polymorphism) - PCR ile 200-800 bp’lik DNA dizisi çoğaltılır. - PCR ürünü formamid yükleme tamponu ile karıştırılıp 95C’de 5 dk denatüre edildikten hemen sonra buz üzerine alınarak soğutulur. - Denatüre haldeki PCR ürünleri vakit kaybetmeden poliakrilamid non-denatüre jele yüklenir. - Tek zincirli ürünler elektroforez ile birbirinden ayrılır. - Tek zincirli DNA’nın elektroforezdeki hareketi yapısal konformasyonuna bağlıdır. Tek bazlık fark bile konformasyonunu değiştirir ve elektroforezdeki hareketinde farklılık yaratır. - Elektroforez sonucunda jel gümüş nitrat boyası ile boyanır. 
Figür 5. SSCP analizi GENEL ANLAMDA JEL ELEKTROFOREZİ Elektroforetik teknikler makromoleküllerin karekterizasyonu ve saflık derecelerinin ölçülmesi amaçlı kullanılan temel tekniklerdendir. Tekniğin temel prensibi DNA, RNA ve protein moleküllerinin üzerinde taşıdıkları yükü kullanarak bu molekülleri elektrik alan içerisinde hareketlendirmektir. Bu hareketlenme ile birlikte moleküller büyüklüklerine göre jel üzerinde sıralanırlar. Büyük moleküller jel üzerinde yürümekte zorluk çekerken küçük moleküller daha hızlı ve rahat hareket edebilirler. Molekülün anoda mı (+ kutup) yoksa katoda mı (- kutup) doğru hareket edeceği molekül üzerindeki net yük ile belirlenir. DNA ve RNA molekülleri serbest fosfat gruplarından dolayı eksi yüklü moleküllerdir. Bu nedenle jel üzerinde katoddan anoda doğru hareketlenirler. Protein molekülleri üzerlerinde hem artı hem de eksi yükler taşıdıklarından dolayı üzerlerindeki net yük miktarı ortamın pH’ı değiştirilerek istenirse artı istenirse eksi hale getirilebilir. Mesela ortam pH’ının 5’den büyük olduğu durumlarda proteinler eksi yüklenirler ve jel üzerinde anoda doğru hareketlenirler.  
Elektroforez deneyleri tampon çözeltileri içerisinde yapılır. Bunun iki temel nedeni vardır. Birinci neden akımın geçişini sağlamak için ortamın elektrolit miktarını artırmak ikinci nedense ortamın pH’ında meydana gelebilecek radikal değişimlere izin vermemektir. Elektroforez deneylerinde elektrik alan üç farklı şekilde oluşturulabilinir. En sık kullanılan metod da (DNA, RNA elektroforezinde) ortama verilen voltaj sabitlenerek akımın (amper) ve gücün (watt) değişimine izin verilir. [Amper X Volt = Watt]. Protein elektroforezinde ise tercih edilen akımın sabitlenip voltun ve gücün değişimine izin verilmesidir. Yüksek derecede akım ve voltaj gerektiren deneylerde ise güç sabitlenip akım ve voltajın değişimine izin verilir. Bu işlevi gerçekleştirecek aletler piyasada bulunmaktadır.
Agaroz lineer bir polimer olup D-galaktoz ile L-galaktoz molekullerinin ardı sıra glikosidik bağlarla birleşmesi sonucu oluşmuştur. Agaroz zincirleri helix ikincil yapıları sayesinde çapları 20 ile 30 nm arasında değişen superkoyıllar oluştururlar. Bu superkoyıllar jelatin şeklindeki yapılara dönüşerek 50 nm ile 200 nm arasında boşluklar ihtiva eden polimere dönüşürler. Piyasada satılan agaroz polimerlerinin yaklaşık 880 adet galaktozdan oluştuğu bilinmektedir. Ancak agaroz saf bir madde değildir. İçerisinde başka polisakkaritler de ihtiva eder. Düşük kalitede bir agaroz içerisinde değişik tuzlar ve iyonları da bulmak mümkündür. Agaroz içerisindeki bu safsızlıklar agarozun erime sıcaklığını ve DNA moleküllerini ayırma kapasitesini etkiler. Bu problemler nedeni ile moleküler biyoloji deneylerinde özel hazırlanmış agaroz kullanılır. DNA nın agaroz üzerinde migrasyonu Aşağıda özetleyeceğimiz faktörler DNA nın agaroz üzerindeki yürüme hızını belirler.
Jel-Yükleme tamponları Bu tamponlar DNA örnekleri jel üzerine yüklenmeden önce DNA örnekleri ile belirli oranlarda karıştırılırlar. DNA örneğinin yoğunluğu bu sayede artırılarak jel üzerindeki kuyucuklar içerisine homojen olarak çökmesi sağlanır. Ayrıca yükleme tamponu içerisinde bulunan brom fenol mavisi de (BFB) DNA örneklerinin yürüme sırasında hangi noktaya kadar ilerleyebilecekleri hakkında bilgi verir. BFB 0.5x TBE içerisinde yürütülen bir jel üzerinde 300 bp lik bir DNA parçası ile aynı hızda hareket eder. Eğer ksilen zayanol renk olarak kullanılacak olunursa, bu renk belirteci 4 kb lik bir DNA molekülü ile aynı hızda ilerler. METOD
DNA nın Agaroz üzerinde görüntülenmesi
DNA moleküllerini boyamanın en uygun metodu, en ucuz ve en kolay olan etidium bromid metodudur. Etidium bromid üçlü planer bir kimyasal grup içeren madde olup DNA nın baz kısımları ile etkleşir. (Her 2.5 bp DNA molekülü / etidium bromid). Heliksin içerisine giren EtBr molekülleri heliks aksisine dik bir pozisyon alarak üst ve alt kısımlardaki baz çifleri ile vanDerWaals bağları kurar. Bu etkileşim boyanın floresan özelliğinde bir artışa sebeb olur. Bu artış DNA konsantrasyonu ile doğru orantılı olduğundan jelin DNA içeren kısımları yoğun bir floresan özellik gösterir.
SYBR gold simetrik olmayan bi siyonid boyasıdır. Hem tek zincirli hem de çift zincirli DNA moleküllerini boyamada kullanılır. EtBr’e oranla çok daha duyarlı olan bu boya ile 20 pikogramdan daha az DNA miktarını gözlemek mümkündür. DNA nın jeller üzerinde fotoğraflanması Bu amaçla transluminatörler kullanılır. Transluminatörler 302 nm de UV ışığı yayarlar. DNA’ ya bağlanmış EtBr’ün floresan yoğunluğu aslında 254 nm de daha fazla olmasına rağmen 302 nm en çok kullanılan dalga boyudur. Bunun ana nedeni DNA üzerinde 254 nm de kırıkların oluşmasıdır. Günümüzde EtBr ile boyanmış DNA moleküllerinin görüntülerini kaydetmek mümkündür. Kullanılan entegre sistemlerde bir ışık kaynağı, bir dijital kamera ve termal yazıcıdan ibarettir. Daha karmaşık sistemlerde jel resimleri direk bilgisayar üzerinden görüntülenebilir. DNA’nın restriksiyon endonukleaz enzimleri ile kesimi Genel Bilgi R  estriksiyon endonukleazlar çifte sarmal DNA moleküllerini 4 ile 8 baz çifti arasında spesifik bölgeleri tanıyarak kesen enzimlerdir. Bu güne değin 3 tip restriksiyon endonükleaz enzimi bulunmuştur. Tip I ve Tıp III endonucleaz enzimleri üzerinde hem restriksiyon aktivitesi hemde metilasyon aktivitesi bulunur. Tip I enzimleri DNA’yı tanıdıkları bölgeden yaklaşık 1000 baz çifti yukarısında neredeyse gelişigüzel keserken, tip III enzimlerinde bu sayı 24 ile 26 baz çifti civarındadır. Tıp II restriksiyon enzimleri ise diğer iki enzim tipinden ayrı olarak DNA’yı tanıdıkları bölgenin tam üzerinden seçici olarak keserler. Bu özelliklerinden dolayı Tip II restriksiyon endonukleazlar moleküler biyoloji ve biyotekno- loji laboratuarlarında sık kullanılırlar. Yaklaşık 2500 den fazla tip II restriksiyon enzimi bilinmektedir. Tablo da sık kullanılan bu enzimlerden bazıları ve bu enzimlerin DNA üzerinde tanıdıkları bölgeler ve hangi
organizmalar- dan izole edildikleri verilmiştir. 
Tıp II restriksiyon enzimleri DNA üzerinde palandromik DNA dizilerini tanırlar. Palandromik bir dizi her iki yönden okunduğunda aynı baz sıralamasını verir. Tıp II restriksiyon enzimleri DNA’yı kestikten sonra DNA üzerinde oluşan uçlar çoğu zaman yapışkan (stiky) uçlardır. Ancak bazı restriksiyon enzimleri yapışkan uçlar yerine kör (blunt) uçlar oluştururlar. METOD Genomik DNA moleküllerinin MboII ile kesimi MboII restriksiyon enzimi DNA üzerinde GATC dizisini tanıyarak keser. GATC dizisi DNA üzerinde sıkça rastlandığından MboII ile kesilmiş bir DNA molekülü bir çok bölgesinden parçalara ayrılacaktır. Aşağıda tarif edilen deneyde insan genomik DNA’sının Mbo II ile kesimi verilmiştir. 3.0 mikrolitre genomic DNA (3 mikrogram kadar) 1.0 mikrolitre MboII tampon çözeltisi 0.5 mikrolitre Mbo II enzimi 5.5 mikrolitre dd. Su Karışımı 37 derecede 15 dakika inkube edildikten sonra agaroz jel üzerinde yürütülerek analiz edilir.
DNA üzerinde bulunan özel baz dizileri uygun problar (kısa spesifik DNA parçaları) kullanıldığında görüntülenebilir veya DNA üzerindeki herhangi bir genin pozisyonu tespit edilebilir. Bu amaçla DNA molekülleri öncelikle agaroz üzerinden membranlara transfer edilmelidir. Piyasada iki tip membran kullanılmaktadır (Naylon ve Nitroselüloz). Bu membranların bazıları pozitif yükle donanmış iken bazıları nötraldirler. Pozitif yüklü membranlara DNA’nın transferi ve membran üzerine fiksasyonu nispeten kolaydır. METOD Jel elektroforezini takiben çifte sarmal DNA yapısını bozmak için jel 0.5 M NaOH içerisinde tutulur. Daha sonra jel nitroselüloz membran üzerine yatırılıp, membran üzerine kalın bir kağıt havlu tabakası ve uygun bir ağırlık ilave edilir. Bu yolla jel içerisindeki sıvı kapileri güç ile jel üzerinden membrane doğru akma eğilimine zorlanır. Akan sıvı ile birlikte DNA molekülleri de 
membran üzerine aktarılır. Membran kurutulduktan sonra DNA molekülleri membran üzerine 80 derecede ısıtlarak veya UV ışıma ile sabitlenir. Bu noktadan sonra DNA molekülleri uygun bir DNA probu ile hibridize edilip tanımlanacak haldedir. Northern blotlaması Southern blotlaması ile prensipte aynı olup en önemli farkı DNA molekülleri yerine RNA moleküllerinin membran üzerine transferini içerir. Western blotlaması Bu blotlama metodunda proteinler PVDF veya nitroseluloz membrana transfer edilirler. Proteinlerin acrilamid jel üzerinden membrana transferi özel bir tampon içerisinde elektrik akımı verilerek yapılır. Bu sebeple western transfer işleminde özel tasarlanmış aletlere ihtiyaç vardır. Yüklə 68,42 Kb. Dostları ilə paylaş:
|
