Predgovor

---

Oznaka: 0098102

MOLEKULARNI MEHANIZMI IMUNOSUPRESIJE

MOLECULAR MECHANISMS OF IMMUNOSUPPRESSION
Voditeljica projekta: dr. sc. Renata Novak Kujundžić

Tel. ++385 1 4560 949   e-mail: [e-mail]

Suradnici
Katja Ester, dipl. ing. molekularne biologije, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice
Renata Novak Kujundžić, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica

Vanjski suradnici
William L. Ragland, doktor biol. znanosti, University of Georgia, Athens, GA, SAD
Vladimir Savić, doktor biol. znanosti, znanstveni suradnik, Veterinarski institut RH, Zagreb

Program rada i rezultati na projektu:

Tijekom 2005. godine smo nastavili sa istraživanjima uloge enzima indolamin-2, 3-dioksigenaza u nastanku imunosupresije. Istraživan je utjecaj de novo sinteze nikotinamid adenin dinukleotida (NAD) u kinureninskom putu razgradnje triptifana na transkripciju inducibilne sintaze dušičnog oksida (iNOS) i proizvodnju dušičnog oksida (NO) u staničnoj liniji pilećih makrofaga HD11, tretiranoj i netretiranoj rekombinantnim pilećim interferonom gama. Povećanje transkripcije gena iNOS i proizvodnje NO, nakon tretmana interferonom gama ovisi o funkcionalnosti kinureninskog puta. Inhibicija indolamin-2, 3 -dioksigenaze, ključnog enzima u katabolizmu triptofana, pomoću 1-metil-L-triptofana smanjila je transkripciju gena iNOS i proizvodnju NO. Dodatak kinurenina u medij stanica tretiranih sa 1-metil-L-triptofanom poništio je negativan učinak ovog inhibitora na transkripciju gena iNOS i proizvodnju NO. Inhibicija poli(ADP-riboza)polimeraze, enzima koji cijepa NAD na nikotinamid i ADP-ribozu te stvara polimere ADP-riboze, smanjila je transkripciju gena iNOS i proizvodnju NO u HD11 stanicama stimuliranim interferonom gama. Rezultati ukazuju na to da indukcija indolamin-2, 3-dioksigenaze pomoću interferona gama sprječava smanjenje razine NAD u stanicama i time povećava transkripciju gena iNOS i proizvodnju NO. Ovaj učinak je posljedica automodifikacije poli(ADP-riboza)polimeraze u prisutnosti NADa, koja promiče transkripciju time što mijenja strukturu kromatina i omogućava vezanje NF kappa B na iNOS promotor, koje nije moguće ukoliko se poli(ADP-riboza)polimeraza nalazi u stanici u nemodificiranom obliku, u kojem ulazi u direktnu vezu sa ovim transkripcijskim faktorom i time onemogućava njegovu aktivnost.

Research programme and results:

During the third year of our research we have continued to investigate the role of indoleamine-2, 3 -dioxygenase in immunosuppression. The influence of de novo synthesis of NAD in kynurenine pathway of tryptophan degradation on transcription of iNOS and NO production upon treatment with recombinant chicken interferon gamma was investigated in chicken macrophage cell line HD11. The increase in iNOS transcription and NO production, upon treatment with interferon gamma, is dependent on undisturbed flow through kynurenine pathway.  Inhibition of indoleamine-2, 3-dioxygenase by 1-methyl-L-tryptophan downregulated iNOS transcription and NO production. Addition of kynurenine to growth media of cells treated with 1-methyl-L-tryptophan abbolished the negative effect of this inhibitor on iNOS transcription and NO production. Inhibition of poly(ADP-ribose)polymerase, an enzyme that degrades NAD to nicotinamide and ADP-ribose and forms ADP-ribose polymers, downregulated iNOS transcription and NO production in cells treated with interferon gamma.  These results imply that induction of indoleamine-2, 3-dioxygenase by interferon gamma prevents depletion of NAD in HD11 cells and thus upregulates iNOS transcription and NO production. This effect is result of poly(ADP-ribose)polymerase automodification in abundance of NAD, which facilitates transcription by changing chromatin structure and allowing NF kappa B binding to iNOS promoter.  This binding is prevented in the presence of unmodified form of poly(ADP-ribose)polymerase which directly interacts with NF kappa B and prevents its transactivating activity.

---

Oznaka: 0098103

NEUROTRANSMITORI U STRESU I REGULACIJA GABA RECEPTORA IN VITRO

NEUROTRANSMITTERS IN STRESS AND REGULATION OF GABA RECEPTORS IN VITRO
Voditeljica projekta: dr. sc. Danka Peričić

Tel. ++385 1 4561-126   e-mail: [e-mail]

Suradnici
Milica Bjegović, doktorica med. znanosti, znanstvena suradnica

Maja Jazvinšćak Jembrek, magistrica biol. znanosti, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice

Danka Peričić, doktorica med. znanosti, znanstvena savjetnica
Dubravka Švob Štrac, magistrica biol. znanosti, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice
Josipa Vlainić, doktorica vet. medicine, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice

Tehnički suradnici
Zlatica Tonšetić, tehničarka

Vanjski suradnici
Branimir Živković, doktor med. znanosti, redoviti profesor, Syuthelabo Recherche Centre, Toulouse, Francuska

Program rada i rezultati na projektu:

Cilj istraživanja jest unaprijediti naše spoznaje o mehanizmima koji tijekom kronične primjene neuropsihoaktivnih lijekova koji djeluju putem GABA-A receptora, dovode do pojave tolerancije i ovisnosti. Najznačajniji lijekovi iz te skupine su benzodiazepini, koji su u širokoj primjeni kao anksiolitici, hipnotici, miorelaksansi i antiepileptici. Kako bismo bolje razumjeli adaptivne promjene GABA-A receptora tijekom kroničnog tretmana tim lijekovima, istražili smo svojstva rekombinantnih GABA-A receptora stabilno eksprimiranih u membranama HEK 293 stanica, poslije produljenog tretmana flumazenilom, antagonistom benzodiazepinskih veznih mjesta. Taj je lijek izazvao prilagodbu benzodiazepinskih veznih mjesta naviše (up-regulation). Učinak je bio potenciran GABA-om, a smanjen bikukulinom, kompetitivnim antagonistom veznog mjesta za GABA-u, na temelju čega se može pretpostaviti da je za spomenuti učinak flumazenila potrebno intaktno vezno mjesto za GABA-u. Izlaganje (48 sati) HEK 293 stanica koje stabilno eksprimiraju rekombinantne alfa1 beta2 gama2S GABA-A receptore (najzastupljeniji podtip GABA-A receptora u mozgu) flumazenilu povećalo je maksimalni broj [3H]TBOB-om obilježenih veznih mjesta za konvulzive, ali, kako se čini, nije utjecalo na funkcionalne veze između tih veznih mjesta i veznih mjesta za benzodiazepine. Rezultati pokazuju da kronični tretman flumazenilom povećava broj GABA-A receptora, ne remeteći njihovu funkciju. Spomenuti eksperimenti upućuju na pretpostavku da kronični tretman flumazenilom ne dovodi do tolerancije, a također, da bi kronična primjena flumazenila, suprotno onome što se mislilo ranije, bila kontraindicirana u liječenju poremećaja karakteriziranih povećanim GABAergičnim tonusom.

Cilj drugog dijela našeg istraživanja bio je evaluirati moguću ulogu lijekova koji mijenjaju serotonergični prijenos živčanih podražaja (lijekovi koji djeluju putem 5-HT1A i 5-HT2A receptora, selektivni inhibitori povratnog unosa serotonina) u kontroli moždane podražljivosti te u antikonvulzivnom djelovanju stresa. Ti se lijekovi učestalo koriste u liječenju anksioznosti i depresije. Rezultati pokazuju da stimulacija 5-HT1A receptora djeluje antikonvulzivno u stresiranih i kontrolnih životinja, dok stimulacija 5-HT 2A/2C receptora ne interferira s učinkom stresa na konvulzije izazvane antagonistom GABA-A receptora, pikrotoksinom. Nadalje, naši rezultati pokazuju da antidepresiv fluoksetin, primijenjen akutno ili ponavljano, pokazuje antikonvulzivno djelovanje protiv konvulzija koje se u miševa izloženih stresu, kao i u kontrolnih miševa, izazivaju primjenom pikrotoksina. Stres nije promijenio antikonvulzivno djelovanje fluoksetina. Posljednji su rezultati relevantni posebice u terapiji bolesnika s komorbiditetom depresije i epilepsije.


Research programme and results:

The aim of this study was to improve our knowledge of the mechanisms leading to tolerance and dependence following chronic treatment with neuropsychoactive drugs acting via GABA-A receptors. The most interesting drugs from this group are benzodiazepines, which are widely used as anxiolytics, hypnotics, myorelaxants and anticonvulsants. To better understand the adaptive changes of GABA-A receptors following chronic treatment with these drugs, we studied the properties of recombinant GABA-A receptors, stably expressed in the membranes of HEK 293 cells, following prolonged treatment with flumazenil, the antagonist of benzodiazepine binding sites. This drug up-regulated benzodiazepine binding sites. The effect was potentiated by GABA, and reduced by bicuculline, the competitive antagonist of GABA, suggesting that this effect of flumazenil requires an intact GABA binding site. Exposure (48 h) of HEK 293 cells stably expressing recombinant alpha1 beta2 gamma 2S GABA-A receptors, the most common type of GABA-A receptors found in the brain, to flumazenil enhanced also the maximum number of [3H]TBOB labelled binding sites for convulsants, but it did not appear to affect the functional coupling between these sites and benzodiazepine binding sites. The results indicate that chronic treatment with flumazenil enhances the number of GABA-A receptors, without disturbing their function. This suggested that chronic treatment with flumazenil is not supposed to produce tolerance, but also quite opposite than previously thought, that chronic treatment with this drug might not be indicated for treatment of disorders characterized by an enhanced GABAergic tone.

The aim of another part of our project was to evaluate the possible role of drugs affecting serotonergic transmission (drugs acting via 5-HT1A and 5-HT2A receptors, selective serotonin reuptake inhibitors) in the control of seizures and in the anticonvulsant effect of stress. These drugs are being widely used in the treatment of anxiety and depression. The results demonstrated that stimulation of 5-HT1A receptors exerts anticonvulsant actions in stressed and unstressed mice, while stimulation of 5-HT 2A/2C receptors does not interfere with the effect of stress on picrotoxin-induced convulsions. The results also showed that the antidepressant drug fluoxetine, given acutely or repeatedly, shows anticonvulsant properties against convulsions induced in unstressed and swim-stressed mice by antagonist of GABA-A receptors, picrotoxin. Stress failed to modify the anticonvulsant properties of fluoxetine. The latter results are relevant especially for the therapy of patients with comorbidity of depression and epilepsy.