Predgovor

---

Oznaka: 0098101

OKSIDATIVNI STRES I ZLOĆUDNE BOLESTI

OXIDATIVE STRESS AND MALIGNANT DISEASES
Voditelj projekta: dr. sc. Neven Žarković

Tel. ++385 1 4571234   e-mail: [e-mail]

Suradnici
Ana Čipak, dipl. ing. molekularne biologije, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice
Marija Poljak-Blaži, doktorica biol. znanosti, znanstvena savjetnica
Suzana Borović, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica
Filip Rabuzin, dipl. ing. biotehnologije, znanstveni novak u suradničkom zvanju asistenta
Neven Žarković, doktor med. znanosti, znanstveni savjetnik
Morana Živković, dipl. ing. molekularne biologije, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice

Tehnički suradnici
Nevenka Hiršl, kemijska tehničarka
Tea Vuković, medicinski laboratorijski inž.

Vanjski suradnici
Toni Hanich, doktor med. znanosti, Opća bolnica Našice, Našice
Rudolf-Jörg Schaur, sveučilišni profesor u mirovini, Karl-Franzens Universität Graz,Austrija
Zoran Ćala, doktor med. znanosti, Opća bolnica "Sveti Duh", Zagreb
Suzana Kukulj, doktorica med. znanosti, asistentica, Klinika za plućne bolesti Jordanovac, Zagreb
Ivo Soldo, doktor med. znanosti, Opća bolnica "Sveti Duh", Zagreb
Igor Stipančić, doktor med. znanosti, Klinička bolnica Dubrava, Zagreb
Program rada i rezultati na projektu:

U razdoblju 2004.-2005. analizirana je složenost interakcija željeza i imunološkog sustava korištenjem feri sorbitol citratnog kompleksa. Pokazano je imunostimulacijsko djelovanje ovog antianemijskog pripravka. Utvrdili smo da je jedan od molekularnih mehanizama djelovanja navedenog preparata željeza u makrofazima i stanicama slezene štakora posredovan aktivacijom transkripcijskog faktora NF-kB, koji sudjeluje u aktivaciji imunološkog odgovora. U kliničkoj studiji provedenoj na bolesnicima s ishemijskim, odnosno hemorgijskim inzultom mozga pokazali smo da se ovakva ozljeda mozga očituje i kao sustavni oksidacijski stres. Pri tome je uočena razlika između bolesnika s ishemijskim i bolesnika s hemoragijskim inzultom koja se manifestirala razlikom u razini serumskih peroksida. U drugoj smo kliničkoj studiji u bolesnika sa sepsom određivali razinu tzv. srčanog hormona proANP(1-98) u plazmi kao mogućeg pokazatelja akutnog zatajenja bubrega. Pokazalo se da je proANP(1-98) superioran u predviđanju nastanka akutnog zatajenja bubrega u odnosu na poznate biljege, kao što su klirens kreatinina ili sama diureza. Cistatin C, novi pokazatelj glomerularne filtracije se, međutim, nije pokazao kao pouzdan pokazatelj zatajenja bubrega u naših bolesnika. Tijekom 2004. sudjelovali smo s nekoliko radova i pozvanim predavanjem na Drugom međunarodnom kongresu o hidroksinonenalu (HNE) u Berlinu, a kao priznanje našem radu u ovom području pozvani smo za sudjelovanje u izradi tematskog broja časopisa BioFactors, posvećenog HNEu. Tijekom 2004. u našoj je skupini izrađen i diplomski rad pod nazivom “Primjena transgenog kvasca (Saccharomyces cerevisiae) kao modela za istraživanje oksidacijskog stresa” (studentica Tanja Matijević), kojim smo uveli izvorni model za izučavanje oksidacijskog stresa. Ovo je istraživanje provedeno u suradnji s kolegama iz Graca. Drugi diplomski rad pod nazivom “Metabolizam 4-hidroksinonenala u HOS stanicama“ (studentica Lenka Glavina) temelji se na HPLC analizi HNEa u uzorcima stanica. Ovim je uvedena nova metoda za izučavanja oksidacijskog stresa, a tako i novo područje istraživanja koje nam otvara mogućnosti izučavanja metaboličkih različitosti i usporedbe osjetljivosti različitih stanica na oksidacijski stres s njihovom metaboličkom aktivnošću. Tijekom 2005. godine dovršili smo niz istraživanja koja su nedavno objavljena ili su u tisku. Posebno se ističu rezultati dugotrajnih kliničkih studija kojima smo izučavali molekularne mehanizma oksidacijskog stresa. Tako smo utvrdili da je metabolizam željeza bitan u razvoju karcinoma debelog crijeva i može ukazati na sposobnost metastaziranja ovih zloćudnih tumora. Također smo i po prvi puta opisali povezanost produkta lipidne peroksidacije aldehida akroleina s karcinogenezom debelog crijeva, pri čemu treba naglasiti da je tako ujedno i po prvi puta opisana povezanost distribucije produkata lipidne peroksidacije s tranzicijom benignih tumora u maligne. Ovi rezultati su odraz suradnje s kolegama iz Nagoye. Također smo opisali i izvorna opažanja povezanosti distribucije HNEa sa zloćudnim tumorima mozga u ljudi, pri čemu je bitno naglasiti da je pojavnost HNEa ovisna o stupnju malignosti glijalnih tumora. Opažena povezanost HNEa i progresije glioblastoma je ukazala na mogućnost tumorigenog učinka HNEa koji u tkivo tumora dolazi iz krvotoka, a ne iz samog tkiva tumora, odnosno mozga. Istraživanje molekularnih mehanizama oksidacijskog stresa i lipidne peroksidacije smo dopunili izvornim opažanjima pro-apoptotičnih učinaka HNEa u stanicama ljudskog osteosarkoma, te ovisnost osjetljivosti ovih stanica na učinke HNEa ovisno o njihovoj diferencijaciji. Vrlo važnim smatramo i izvorni pristup izučavanju molekularnih mehanizama adaptacije na oksidacijski stres za što smo uspostavili jedinicu za rad s kvascem (Saccharomyces cerevisiae) i uspostavili intenzivnu suradnju s kolegama iz Graca i iz Sydneya. Koristeći originalan model transgenog kvasca želimo utvrditi ulogu HNEa kao signalne molekule u staničnoj adaptaciji na oksidacijski stres.

Prvi rezultati ovog međunarodnog istraživanja upravo su u tisku u prestižnom časopisu Free Radical Biology & Medicine, koji je vodeći časopis u ovom području znanosti. Zbog potrebe istraživanja razvili smo i originalni postupak imuno-elektronskomikroskopke detekcije HNE-histidinskih konjugata koji smo koristili za dokazivanje subcelularne distribucije HNEa. Ovaj pristup smo dopunili uvođenjem metode kemiluminescencije leukocita, kojom određujemo oksidacijsku aktivnost upalnih stanica, kao temeljne celularne komponente oksidacijskog stresa. Istraživanje celularnih mehanizama oksidacijskog stresa smo proveli i na modelu regeneracije jetre, izučavajući interakciju upalnih stanica i HNE-om oštećenih jetrenih stanica. Opisali smo da upalne stanice potiču oporavak HNEom oštećenih stanica i time naveli mogućnost drugačijih mehanizama regulacije regeneracije jetre u kojoj HNE kao molekularni posrednik oksidacijskog stresa, može ne samo oštetiti stanice, već i potaknuti njihov oporavak djelujući kao regulator rasta i kao čimbenik koji potiče pozitivan učinak upalnih stanica. Naposljetku, treba reći da je proveden i niz eksperimenata kojima smo testirali potencijalno protuoksidacijske učinke prirodnih i sintetskih tvari, a objavljivanje ovih rezultata očekujemo u 2006. godini, jednako kao i nastavak istraživanja u kojem ćemo primijeniti i nove izvorne metode za praćenje biljega lipidne peroksidaicje i oksidacijskog stresa, koje smo razvili tijekom 2005. godine, za što je presudan doprinos naših mladih istraživača i suradnje s kolegama iz zemlje i inozemstva.

Zaključak: Rezultati ostvareni u prošlom projektnom razdoblju ispunili su očekivanja. Potvrdili smo pretpostavljeni značaj HNEa i srodnih produkata lipidne peroksidacije kao bitnih (pato)fizioloških regulatora rasta stanica. Naš projekt je bio atraktivan za mlade istraživače iz zemlje i inozemstva (Londona), koji su nam se priključili, a postignuti rezultati su omogućili daljnji rast našeg međunarodnog ugleda i dosizanje vodeće uloge u ovom području u našoj akademskoj zajednici. Stoga namjeravamo i u sljedećem razdoblju nastaviti s istraživanjima u području molekularnih i celularnih mehanizama oksidacijskog stresa i lipidne peroksidacije u onkologiji.

Research programme and results:

Interaction complexity analysis between iron and immunology system has been made in period of 2004-2005 by using ferric-sorbitol-citrate complex. Immunostimulation impact has been shown for this anti-anemic substance. One of molecular mechanisms of action has been determined in rat cell line of macrophages and spleen through activation of NF-kB transcription factor that is involved in activation of immunological response. Clinical study carried out on patients with ischemic stroke or intracerebral hemorrhage elucidate that this type of brain injury manifest as systemic oxidative stress. During study it has been seen difference in level of serum peroxides between patients with ischemic stroke or intracerebral hemorrhage. In other clinical study, level of heart hormone proANP(1-98) has been determined in patients with sepsis as possible indicator of kidney failure. It has been shown that proANP(1-98) is outstanding as predictor of acute kidney failure in patients. Participation to Second Meeting of the Hydroxynonenal (HNE) in Berlin during 2004 has been made with research articles and invited lectures. Acknowledgement to our work in this research area is invitation for contribution to thematic volume of BioFactors journal dedicated to HNE. Diploma work has been made in our workgroup named “Application of transgenic yeast (Saccharomyces cervisiae) as model for oxidation stress investigation” by student Tanja MatijevićThis work has been introduction of original model for study oxidation stress and has been done in collaboration with fellow from Graz. Second diploma work named “Metabolism of 4-hydroxynonenal in HOS cell line” by student Lenka Glavina have basis on HPLC analysis of HNE in samples. This work was introduction of new method for oxidation stress study, and by this introduction of new research area with new possibilities of metabolic divergence investigation and different cell lines sensibility comparison in the meaning of their metabolic activity on oxidative stress. During 2005 we have finished number of investigations that have been recently published or in press. Especially are highlighted results of long lasting clinical studies that have had been used in molecular mechanisms of oxidative stress investigation. These studies have affirmed importance of both iron metabolism in colon carcinoma development and it role in indication of the capacity to metastasize in this malignant tumors. Also, by first time we have been described both a relationship of acrolein aldehyde a lipid peroxidation products with colon cancerogenesis and a relationship of lipid peroxide products distribution with transformation benign to malignant tumors. These results reflect cooperation with fellow from Nagoye. We also have described original observations on relationship between HNE distribution and human brain malignant tumors, with emphasis on correlation between HNE distribution and malignantly degree of Glial tumors. Noticed relationship between HNE and glioblastoma progression has indicated on possible tumorigenic HNE impact that will came in tumor tissue from bloodstream and not from tumor tissue at self, e.g. from brain. Oxidative stress molecular mechanisms and lipid peroxidation research has been updated with original observation of both pro-apoptotic HNE impact on human osteosarcoma cell lines and sensitivity relation of these cells on HNE effect in relation to differentiation stage. It is important our original approach to study molecular mechanisms of adaptation on oxidative stress why have been establish yeast (Saccharomyces cervisiae) facility and intensive cooperation with fellows from both Graz and Sydney. Original model of transgenic yeast has been used for indentifying role of HNE as signal molecule in cell adaptation on oxidative stress. First results of this international research are in press in prestige journal of Free Radical Biology & Medicine a leading journal in this area of science. For research requirement we have been developed original approach to immuno-electron microscopic detection of HNE-histidine conjugates that have been used for evidence HNE distribution on sub-cellular level. This approach has been supplemented by method introduction of leukocytes chemiluminescence used for determination of inflammation cells oxidative activity as basic cellular component of oxidative stress. Also, on model of liver regeneration we have been conduct research of oxidative stress cellular mechanisms by studding interaction of inflammation cells and hepatic cells damaged by HNE. We have been described that inflammation cells promote recovery of cells damaged by HNE and with this pointed out possibility of other regulation mechanisms of liver regeneration that include HNE as molecular intermediate of oxidation stress that can both damaged cells and initiate cell recovery as growth regulator and factor that have positive impact on inflammation cells stimulation. Finally, there should be told that series of experiments have been done in order to test potentially antioxidative impact of natural and synthetic compounds. During 2006 are expected both a publishing of these results and continuation of research that will include application of new original methods for marker of both lipid peroxidation and oxidative stress developed during year 2005 as result of our young researchers and fellow from country and abroad.

Conclusion: Results realized in past project cycle have been achieve expectations. Assumed significance of HNE and generic compounds of lipid peroxidation as important pathophysiological cell growth regulator has been confirmed. Our project has been attractive for young scientist from country and aboard, e.g. London that have been joined. Accomplished results ensure further growth of our international reputation and reaching a leading role in this area in our academic community. All this are reasons because in following period we intend to continue with research in area of molecular and cellular mechanisms of oxidative stress and lipid peroxidation in oncology.