Predgovor

---

Oznaka: 0098093

UTJECAJ TRANSDUKCIJE GENA/PROTEINA NA SIGNALNE PUTOVE TRANSFORMIRANIH STANICA

GENE OR PROTEIN TRANSDUCTION AND SIGNALLING PATHWAYS IN TRANSFORMED CELLS
Voditelj projekta: dr. sc. Krešimir Pavelić

Tel. ++385 1 4680 094   e-mail: [e-mail]

Suradnici
Siniša Bratulić, dipl. ing. molekularne biologije, znanstveni novak u suradničkom zvanju asistenta
Koraljka Gall-Trošelj, doktorica med. znanosti, znanstvena suradnica (konzultantica)
Mirica Grdiša, doktorica kem. znanosti, viša znanstvena suradnica
Silva Hećimović, doktorica biotehničkih znanosti, znanstvena suradnica
Koraljka Husnjak, doktorica biol. znanosti, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju više asistentice
Sanja Kapitanović, doktorica med. znanosti, viša znanstvena suradnica (konzultantica)
Sandra Kraljević, magistrica biol. znanosti, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice
Marko Marjanović, dipl. ing. molekularne biologije, znanstveni novak u suradničkom zvanju asistenta
Jasminka Pavelić, doktorica biol. znanosti, znanstvena savjetnica (konzultantica)
Krešimir Pavelić, doktor med. znanosti, znanstveni savjetnik
Miroslav Poznić, dipl. ing. molekularne biologije, znanstveni novak u suradničkom zvanju asistenta
Matea Radačić-Aumiler, magistrica med. znanosti, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice

Mirela Sedić, magistrica kem. znanosti, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice

Vedrana Škaro, dipl. ing. molekularne biologije, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice
Lidija Šuman, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica
Andrea Tomljenović, doktorica biol. znanosti, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju više asistentice

Vanjski suradnici
Toni Kolak, doktor med. znanosti, viši asistent, Klinička bolnica Dubrava, Zagreb

Program rada i rezultati na projektu:

Provedena su istraživanja utjecaja ekstracelularnog p27 proteina na proliferaciju i apoptozu humanih tumorskih stanica. Pokusi su provedeni primjenom transdukcije proteina - nove metode za unos proteina u stanice. Ispitivanja su provedena s tri forme TAT fuzijskog proteina p27: TAT-p27 divlji tip, TAT-Mp27, točkasta mutacija u regiji odgovornoj za vezanje na cyc/cdk kompleks te TAT-N'p27, otcjepljena regija na C-terminalnom kraju. Rezultati su pokazali da transducirani proteini utječu na proliferaciju tumorskih stanica u kulturi, ovisno o koncentraciji te tipu stanica i proteinu. Također utječu na promjenu ekspresije proteina odgovornih za regulaciju staničnog ciklusa. Postoje pokazatelji da ekstracelularni p27 inducira apoptozu u ispitivanim tumorskim staničnim linijama.

Suradnja s nekoliko istaknutih grupa istraživača u području organske sinteze rezultirala je testiranjem više od 200 novosintetiziranih spojeva na potencijalno protutumorsko djelovanje. Među tim spojevima su derivati benzo-karboksianilida, benzo-kinolona, hidroksiurea, kao i novi amidino-supstituirani naftofuran-metzil-karboksilati. Za najaktivnije spojeve određivan je detaljni mehanizam djelovanja, pr čemu je potvrđeno da su neki spojevi klasični interkalatori.

Započeta su istraživanja molekularne i stanične biologije Alzheimerove bolesti. Glavni cilj istraživanja je utvrditi molekularni mehanizam djelovanja kolesterola na nastanak Alzheimerove bolesti. Pri tom smo pratili učinak smanjene/povišene razine kolesterola na procesiranje prekursora proteina amiloid-β (APP) i sintezu peptida amiloid-β (Aβ), koji se smatra glavnim uzročnikom Alzheimerove bolesti. Ova istraživanja su potaknuta nedavnim nalazom da osobe koje uzimaju statine, lijekove za sniženje razine kolesterola, imaju manju prevalenciju Alzheimerove bolesti te da je i u drugih oboljenja s poremećajem metabolizma kolesterola (hiperkolesterolemija, bolesti nakupljanja lipida) zamijećena povećana razina peptide Aβ. Naši rezultati su pokazali da razina kolesterola modulira sintezu peptida Aβ kao i sintezu signalne molekule proteina APP – AICD (od engl. APP intracellular diomain). S obzirom da oba ova produkta nastaju cijepanjem proteina APP enzimom γ-sekretaza, naša daljnja istraživanja će biti usmjerena pronalaženju utjecaja razine kolesterola na aktivnost ovog enzimskog kompleksa te njegov smještaj u stanici. Ova ispitivanja će rasvijetliti mehanizam djelovanja kolesterola na nastanak Alzheimerove bolesti kao i na funkciju proteina APP.

Research programme and results:

The influence of extracellular p27 on proliferation and apoptosis was perform. Protein transduction method - a new technology for introduction of proteins into the cells was used. In these investigation a different forme of TAT-p27 fusion proteins were used: TAT-p27 wilde type, TAT-Mp27, point mutation in the region responsible for binding with cyc/cdk complex, and TAT-N'p27, truncated protein on C-terminal end. The results were shown that all transduced proteins affect the proliferation of examined tumor cell line, depending on the concentration and the type of cells and the protein. It was noticed some changes in the expression of cell cycle regulatory proteins. There was also indication that extracellular p27 induced apoptosis in examined cell lines. 

Over 200 newly synthesized compounds were screend in vitro for potential antitumor activity and the possible mechanisms of action were ascertained for the most effective ones, sduch as cyano- and isopropylamidino-substituted derivatives of benzo-carboxanilides and benzo—quinolones, derivatives of hydroxyurea and hydantoins, as well as a novel amidino-substituted naphthofuran-methyl-carbocylate, which was confirmed to be a classical intercalator. The most active/selective compounds have been further evaluated.

In the year 2005. Dr. Silva Katušić Hećimović has begun the research on molecular and cell biological aspects of Alzheimer’s disease within the Division of Molecular Medicine at the RBI, after her three-year training at the Alzheimer’s Disease Research Centre in St. Louis, USA. The goal of her research is to elucidate the molecular mechanism(s) of cholesterol action on Alzheimer’s disease. In particular, we investigated the effect of cholesterol depletion/loading on the processing of the amyloid-β precursor protein (APP) and the synthesis of amyloid-β peptide (Aβ) that is considered to be the primary trigger of Alzheimer’s disease. Recent studies have shown that patients treated with statins, cholesterol lowering drugs, have decreased prevalence of Alzheimer’s disease and that diseases with altered cholesterol metabolism (such as hypercholesterolemia, lipid storage diseases) have increased levels of Aβ. Our results have shown that cholesterol levels modulate the levels of Aβ as well as the levels of the APP-signaling molecule – AICD (APP IntraCellular Domain). Since both products are generated by the γ-secretase cleavage of APP, our further research is directed towards elucidating the effect of cholesterol on the γ-secretase activity and/or its subcellular localization. These studies will generate better understanding of the role of cholesterol on the pathogenesis of Alzheimer’s disease as well as understanding of normal APP function. In the year 2005. the proposed research has been funded by the NIH-Fogarty International Research Collaboration Award, USA.