Projeto de Pesquisa
Preparo do extrato etanólico (EEP)
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Preparo do extrato etanólico (EEP) Para o preparo do extrato etanólico das plantas seleciondas (EEP) serão pesados 100 gramas de plantas trituradas e transferidos para um frasco de vidro contendo 400 mL de etanol 80% (v/v). A extração será feita a 70ºC, em banho de água termostatizado, por 30 minutos, sob agitação constante. Em seguida, será realizada a filtração em papel de filtro e o Extrato Etanólico (EEP) será transferido para um frasco de vidro com tampa de rosca. O EEP obtido será utilizado no fracionamento. Fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico O fracionamento do EEP pela técnica de extração líquido-líquido será feito pela partição em série, em funil de separação, com os solventes hexano e clorofórmio. As frações hexânica (fr-Hex) e clorofórmica (fr-Clo) obtidas serão concentradas a 60ºC, em rotaevaporador, e submetidas às analises físico-químicas e microbiológicas.
A pré-purificação da fração clorofórmica será realizada utilizando-se a cromatografia em coluna seca, por meio de uma coluna de celulose de 20 cm de comprimento e três centímetros de diâmetro interno. A celulose será escolhida por ser flexível, resistente, inerte aos solventes utilizados e transparente à luz natural e ultravioleta. Primeiramente, a coluna será tratada com hexano, para remoção da camada oleosa de proteção. Em seguida, a extremidade inferior será fechada e empacotada, deixando-se o adsorvente cair de uma altura de 20 cm. Logo após será realizada uma pressão com os dedos para aumentar o empacotamento. A amostra será preparada pesando-se 1,0 g da fração clorofórmica concentrada, e após ser redissolvida em 5 mL de clorofórmio, será misturada imediatamente a 2,5 gramas de sílica-gel 60 (MERCK). Na sequência será feita a evaporação do solvente em rotaevaporador a 45ºC, para obtenção de uma mistura da fração clorofórmica e sílica em forma de pó fino. A amostra adsorvida à sílica será colocada no topo da coluna e, em seguida acrescentada a fase móvel, composta de 70% de clorofórmio e 30% de acetato de etila, até que a linha de frente atinja a base da coluna. Após o desenvolvimento, a coluna será avaliada sob luz natural e luz ultravioleta a 366 nm. Nas faixas onde aparecerem os adsorvatos separados, serão feitas delimitações que, em seguida, serão cortadas com 15 uma lâmina afiada. As fatias cortadas serão solubilizadas com metanol. As sub-frações serão então filtradas em papel de filtro e logo após será realizada a cromatografia em camada delgada. As placas serão reveladas com anisaldeído sulfúrico a quente. Purificação da sub-fração bioativa da fração clorofórmica Para a montagem da coluna, com base na metodologia descrita por Alencar (2002) com objetivo de realizar a purificação da sub-fração bioativa da fração clorofórmica será utilizado o gel lipofílico Sephadex LH-20. As sub-frações bioativas obtidas pelo fracionamento em coluna secas serão concentradas em rotaevaporador a 45ºC e, então preparadas soluções pela dissolução de 150 mg em 2 mL de metanol. Em seguida, serão aplicadas no topo da coluna de gel Sephadex LH-20 e após a total penetração da amostra no gel, serão eluídas com metanol. As sub-frações obtidas serão avaliadas por cromatografia em camada delgada, tendo anisaldeído sulfúrico a quente como revelador, e teste de bioautografia para a determinação das sub-frações bioativas destinadas ao isolamento dos compostos por CLAE-preparativa. Isolamento dos compostos com atividade antifúngica As sub-frações bioativas selecionadas previamente pela coluna de Sephadex LH-20 serão recromatografadas em um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) preparativa, utilizando-se uma coluna preparativa Shimadzu PREPODS (H) (250 x 20 mm), para o isolamento dos compostos bioativos. A fase móvel utilizada será 35% do solvente A (água) e 65% do solvente B (metanol). Os picos dos compostos eluídos serão recolhidos em um coletor automático de frações (FRC-10A, Shimadzu Co.), acoplado ao sistema de cromatografia. Análises físico-químicas do EEP, frações, sub-frações e compostos isolados Espectrofotometria na região ultravioleta-visível dos compostos isolados A determinação do espectro de absorção dos compostos isolados será realizada segundo o método descrito por Park et al. (2000), Ikegaki (2001) e Alencar (2002), com algumas modificações. Alíquotas de 25 μL dos compostos isolados serão diluídos em 30 mL de metanol P.A. e os espectros de absorção na região UV-visível serão determinados na faixa de comprimento de onda de 200 a 500 nm em espectrofotômetro UV-Mini 1240 (Shimadzu-Co). Cromatografia em Camada Delgada (CCD) As análises por cromatografia em camada delgada serão realizadas em cromatofolhas de silica gel 60 F254 (Merck Co.). Uma alíquota de 10 μL do EEP, frHex, fr-Clo e sub-frações na concentração de 2 mg/mL serão aplicadas na placa. O tempo de desenvolvimento dos cromatogramas será de aproximadamente 20 minutos, utilizando-se como fase móvel o sistema de solvente composto por acetato de etila: clorofórmio (3:7, v/v). As cromatoplacas serão visualizadas sob luz ultravioleta, no comprimento de onda de 366 nm, antes e após a revelação com anisaldeído sulfúrico, aquecido a 100ºC em estufa, por cinco minutos (OLDONI, 2007). Identificação química dos compostos isolados A identificação química dos compostos isolados será realizada por meio da técnica de Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Os espectros de RMN serão registrados em espectrômetro Brucker DPX 500 MHz, operando em 500 MHz para o 1H. Os espectros serão obtidos em CD3OD (álcool metílico deuterado) utilizando TMS (tetrametilsilano) como padrão interno. Os deslocamentos químicos serão obtidos em d (ppm) e as constantes de acoplamento (J) serão dadas em Hz. Atividade antifungica in vitro e in vivo do EEP, frações, sub-frações e compostos isolados. Teste de difusão em ágar do EEP e frações Será utilizado o teste de difusão em ágar, método descrito por Koo et al. (2000) e Duarte et al. (2003), onde os diferentes extratos serão incorporados separadamente em meio batata-dextrose-ágar (BDA) a 45°C (fundente) e vertida em placas de Petri. Discos de micélio dos fungos S. rolfsii, F. solani, F. oxysporum f. sp. phaseoli, M. phaseolina, S. sclerotiorum, com aproximadamente 6 mm de diâmetro, serão retirados de culturas com 15 dias e depositados no centro de uma placa de Petri contendo meio BDA, à qual serão adicionadas, individualmente, diferentes concentrações do extrato, frações e compostos isolados. As avaliações serão realizadas diariamente por meio de medição do diâmetro das colônias (média de duas medidas perpendiculares), até o total crescimento do tratamento-controle. As variáveis analisadas serão taxa de crescimento micelial (TCM) em milímetro, porcentagem da inibição do crescimento micelial, calculado pela fórmula de Abbott (1925): ICM(%) = (T-t)*100/T, onde T é a testemunha; t o tratamento e área abaixo da curva de crescimento micelial (AACCM), utilizando-se a fórmula: AACCM= ((yi + yi+1)/2.dti), onde yi e yi+1 são os valores de crescimento da colônia observados em duas avaliações consecutivas e dti, o intervalo entre as avaliações. Para efeito de análise, os dados originais da ICM serão transformados em arcsen raiz (x + 0,5/100) e submetidos à análise de variância, e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Com as médias dos dados brutos serão obtidas e selecionadas curvas de regressão, tendo as concentrações dos extratos como variáveis independentes. Modelos exponencial, logarítimo, quadrático e polinomial serão testados. Análise estatística Os dados serão submetidos à análise de variância e aos testes de separação de médias de Scott-Knott e Tukey (P=0,05) efetuados com o auxílio do programa SAEG (Sistema de Análise Estatística e Genética, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG) e SANEST (Sistema de Análise Estatística, Instituto Agronômica de Campinas), respectivamente. A análise de regressão será realizada com auxílio do programa STATISTICA’99 for Windows. Principais contribuições científicas/tecnológicas da proposta - Isolar e identificar metabólitos secundários de plantas endêmicas da caatinga, com potencial de atividade antifúngica in vivo e in vitro em fitopatógenos radiculares da cultura do feijão; - Incorporação de tecnologias de ponta em laboratórios do Nordeste; - Promover a cooperação entre centros de pesquisas científicas de diferentes estados do Brasil; - Formação de recursos humanos; - Gerar e difundir novas tecnologias em pesquisas de bioprospecção de compostos secundários de origem vegetal com potencial fungicidas; - Valorizar produtos bioativos de plantas da Caatinga. Orçamento detalhado (Equipamentos/materiais permanentes/passagens/diárias/ e materiais de consumo) - Equipamentos/materiais permanentes e Materiais de consumo Para realização dos experimentos voltados ao preparo de extratos vegetais, desde a extração até o processo de conservação dos mesmos, bem como para manutenção e realização de experimentos fitopatógicos, faz-se necessário aquisição dos equipamentos permanentes e materiais de consumo listados no orçamento, sem os quais seria impossível desenvolver tal pesquisa. - Passagens e diárias As passagens aéreas e/ou terrestres, bem como as diárias solicitadas, visam fortalecer a Equipe com a participação dos integrantes da mesma em eventos nacionais e internacionais relacionados à área de estudo do presente projeto.
Cronograma de atividades
Identificação dos demais participantes do projeto Equipe:
Proponente: Nome: Antonio Félix da Costa CPF: 126895804-20 Titulação: Doutor em Fitopatologia Área do conhecimento: Fitovirologia Instituto Agronômico de Pernambuco Av. General San Martin, 1371 Bongi CEP: 50761000 - Recife, PE, Brasil Caixa-postal: 1022 Telefone: +55 (81) 3184-7366 Fax: +55 (81) 3184-7260 Atividade no projeto: Supervisor do Projeto; Colaborador em Fitopatologia; Coleta de material vegetal (feijoeiro) doente em campo; Auxílio nas análises de atividade antimicrobiana in vitro, em casa de vegetação e em campo; Preparo de artigos científicos.
CPF: 041.714.744-93 Titulação: Doutora em Fitopatologia – UFRPE Área do conhecimento: Fungos de Solo; Controle Alternativo de doenças de plantas; Controle biológico Instituto Agronômico de Pernambuco Av. General San Martin, 1371 Bongi CEP: 50761000 - Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 3184-7366 Atividade no projeto: Pesquisadora responsável pelo desenvolvimento do Projeto, com experiência em execução de experimentos em Laboratório, Casa de Vegetação e Campo na área de Fitopatologia e Fitotecnia; Responsável pela condução de todos os experimentos, avaliações e análises dos resultados. Coleta de material vegetal, preparo dos extratos vegetais, análises cromatográficas, experimentos com fitopatógenos in vitro, casa de vegetação e em campo; Preparo de artigos científicos. Nome: Luciana Gonçalves de Oliveira CPF: 028.219.934-98 Titulação: Doutora em Biologia de Fungos Área do conhecimento: Microbiologia; Taxonomia e sistemática de fungos; Controle biológico de fungos
Atividade no projeto: Coleta de material vegetal (feijoeiro) doente em campo; Auxílio em atividades em casa de vegetação, em campo e em laboratório; Preparo de artigos científicos. Nome: Mariele Porto Carneiro Leão CPF: 037.601.814-30 Titulação: Doutora em Biologia de Fungos Área do conhecimento: Microbiologia; micologia; biologia molecular Pós-Doutorado - Instituto Agronômico de Pernambuco Av. General San Martin, 1371 Bongi CEP: 50761000 - Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 3184-7266 Atividade no projeto: Auxílio em atividades em casa de vegetação, em campo e em laboratório; identificação molecular dos fitopatógenos; Preparo de artigos científicos. Nome: Katiane da Rosa Gomes da Silva CPF: 945.273.690-91 Titulação: Doutora em Ciência e Tecnologia de Sementes Área do conhecimento: Análise de sementes; tecnologia de sementes Pós-Doutorado - Instituto Agronômico de Pernambuco Av. General San Martin, 1371 Bongi CEP: 50761000 - Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 3184-7366 Atividade no projeto: Coleta de material vegetal (feijoeiro) doente em campo; Auxílio em atividades em casa de vegetação, em campo e em laboratório; Preparo de artigos científicos. Nome: Cláudia Juliana Tabosa Lopes de Crasto CPF: 027.612.514-23 Titulação: Mestre em Biotecnologia de Produtos Bioativos Área do conhecimento: Microbiologia; biotecnologia; biologia molecular Centro de Ciências Biológicas/CCB/ Departamento de Bioquímica Laboratório de Biologia Molecular Rua: Nelson Chaves, s/n, Cidade Universitária CEP: 50670-420 – Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 2126-8354 Atividade no projeto: Auxílio em atividades em casa de vegetação, em campo e em laboratório; identificação molecular dos fitopatógenos. Nome: Carlos Henrique Madeiros Castelletti CPF: 021.071.174-46 Titulação: Doutor em Biotecnologia Área do conhecimento: Bioinformática Instituto Agronômico de Pernambuco Av. General San Martin, 1371 Bongi CEP: 50761000 - Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 3184-7276 Atividade no projeto: Análise molecular dos fitopatógenos Nome: Amaro de Castro Lira Neto CPF 028.387.214-45 Titulação: Doutor em Ciências Biológicas Área do conhecimento: Citogenética; Genética molecular de plantas; Diversidade e Conservação Biológica Instituto Agronômico de Pernambuco Av. General San Martin, 1371 Bongi CEP: 50761000 - Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 3184-7372 Atividade no projeto: Análise molecular dos fitopatógenos Nome: Márcia Vanusa da Silva CPF: 612.771.344-72 Titulação: Doutora em Biologia Molecular Área do conhecimento: Biologia molecular; Bioquímica vegetal Professora Adjunta I Universidade Federal de Pernambuco - UFPE Centro de Ciências Biológicas/CCB/ Departamento de Bioquímica Laboratório de Biologia Molecular Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária CEP: 50670-901 – Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 2126-8540 ramal 231 Atividade no projeto: Coleta de material vegetal para preparo dos extratos; Responsável pela Análise cromatográfica dos extratos; Preparo de artigos científicos. Nome: Wolfgang Harand CPF: 015.396.674-21 Titulação: Doutor em Fitoquímica Área do conhecimento: Fitoquímica; Extratos vegetais Instituto Nacional do Semiárido - INSA Grupo Biodiversidade Laboratórios de Fitoquímica Av. Francisco Lopes de Almeida, S/N, Serrotão CEP: 58429-970 - Campina Grande, PB, Brasil Telefone: +55 (83) 3315-6400 Atividade no projeto: Responsável pela Análise cromatográfica dos extratos; Preparo de artigos científicos.
CPF: 022.879.019-06 Titulação: Doutora em Biologia de Fungos Área do conhecimento: Microbiologia; micologia; diversidade de fungos em agroecossistemas Universidade Federal de Pernambuco - UFPE Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia Av. Professor Nelson Chaves, S/N, Cidade Universitária CEP: 50670-901- Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 2126-8483 Atividade no projeto: Auxílio em atividades de controle de fitopatógenos em laboratório; Preparo de artigos científicos. Nome: Rosineide da Silva Lopes CPF: 038.286.764-56 Titulação: Doutora em Ciências Biológicas Área do conhecimento: Micologia; controle biológico Universidade Federal de Pernambuco - UFPE Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia Av. Professor Nelson Chaves, S/N, Cidade Universitária CEP: 50670-901- Recife, PE, Brasil Telefone: +55 (81) 2126-8570 Atividade no projeto: Auxílio em atividades de controle de fitopatógenos em laboratório; Preparo de artigos científicos. Colaboradores e Parcerias já estabelecidas com Centros de Pesquisas - Universidade Federal de Pernambuco – UFPE - Centro de Tecnologias Alternativas do Nordeste – CETENE
O Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) é uma instituição de pesquisa agrícola, assistência técnica e extensão rural e de infra-estrutura hídrica, com atuação em todo o Estado de Pernambuco, contando atualmente com um corpo de pesquisadores composto, basicamente, por cerca de 100 técnicos, dos quais mais de 85% são possuidores de cursos de mestrado e doutorado. Em sua sede, na cidade do Recife, encontra-se a maioria dos laboratórios da empresa que prestam serviços à sociedade, dos quais se destacam os Laboratórios de Controle Biológico e de Fitopatologia que darão suporte às pesquisas preconizadas neste projeto, em suas respectivas áreas. O IPA dispõe, também, de uma rede de 12 estações experimentais ao longo de todo o estado, capaz de dá suporte à condução de etapas de campo que venham a ser exigidas para o cumprimento dos objetivos estabelecidos no projeto. Centro de Ciências Biológicas/ Departamento de Bioquímica/UFPE Laboratório de Biologia Molecular Vegetal: dispõem de uma equipe altamente qualificada em genomas funcionais, além de laboratórios devidamente equipados para auxílio em qualquer fase da execução do projeto. Possui uma estrutura laboratorial com um sequenciador automático de DNA ABI 3100, e um nobreak de 3KVA, três computadores Pentium III, um freezer -80C, um refrigerador, um freezer -20C, um termociclador, uma centrífuga refrigerada para microplacas de 96 poços e eppendorf de 2 mL, uma microcentrífuga de bancada, uma capela de exaustão, duas estufas de secagem e esterelização, um termoshaker, um banho-maria, um medidor de pH, uma balança analítica, um espectofotômetro de luz UV, um deionizador, um microondas, um sistema de eletroforese horizontal, um agitador de tubos, um agitador magnético com aquecimento, um gerador automático de voltagem 10KVA, uma máquina de produção de gelo. Espectrofotômetro de varredura, banhos-maria, liofilizadores, estufas de esterilização e secagem, medidores de pH, destiladores e deionizadores de água, purificador de água milli Q, sonda multiparâmetros, bombas peristálticas e coletores de frações, máquina de gelo, centrífugas refrigeradas, câmaras frias, balanças analíticas, microscópio eletrônico, rotoevaporador, HPLC, Termociclador, autoclaves, sistemas para eletroforese vertical e horizontal, fluorímetro, Leitor de microplacas, entre outros. INSA: dispõe de uma infra-estrutura de laboratório de devidamente equipado com: uma extratora automática de solventes, dois evaporadores rotativos digitais, uma estação de vácuo com resistência química, um sistema de cromatografia preparativa de alto desempenho com separação por massa molecular, sete capelas de exaustão, Nobreak Force-line, 1Kva, MICROSCÓPIO TRINOCULAR, Agitador magnético com aquecimento, Agitador magnético sem aquecimento, Agitador de tubos tipo Vortex, Autoclave vertical, Balança eletrônica de precisão, Balança analítica 200g 0,0001, Câmara de fluxo laminar, Câmara climática para germinação e estudo de plantas/fotoperíodo/alter, Estufa com circulação e renovação de ar 600x500x500 mm, Destilador de água em inox tipo pilsen, 5.5L/h. Estimativa de Recursos Financeiros de outras Fontes que serão aportados pelos eventuais Agentes Públicos e Privados Parceiros Não há previsão de aporte de recursos financeiros de outros parceiros. Apenas a colaboração técnica da Universidade Federal Rural de Pernambuco - Unidade Acadêmica de Serra Talhada (UFRPE-UAST), da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e do Centro de Tecnologias Alternativas do Nordeste (CETENE), por meio dos seus pesquisadores mencionados. Referências Bibliográficas ABREU, A. de F. B.; BIAVA, M. Cultivo do feijão da primeira e segunda safras na região sul de Minas Gerais. Santo Antônio de Goiás: Embrapa Arroz e Feijão, 2005 (Sistema de Produção). AIDAR, H. Cultivo do feijoeiro comum: Características da cultura. Disponível em: Yüklə 332,63 Kb. Dostları ilə paylaş:
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