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ETAT D'AVANCEMENT DU PROJET ET TRAVAIL RESTANT A RÉALISER

Pour l'approche in vitro, nous utilisons des cellules musculaires lisses bronchiques humaines en culture primaire, une lignée de cellules épithéliales alvéolaires humaines, représentatives des pneumocytes de type II (lignée A549), et une lignée de macrophages alvéolaires murins (lignée RAW 264.7). Pour l'approche in vivo, nous utilisons des souris de souche C57/ BL6.

Les cellules ont été exposées, pendant 3 à 24 heures, à du condensat de fumée de cigarette (10 µg/ml), avec et sans exposition concomitante à des particules diesel (10 µg/cm²). Cette concentration a déjà été utilisée au sein du laboratoire.

Le nombre d’expériences analysées est d’au moins 3 pour chaque technique utilisée.

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  La viabilité cellulaire a été évaluée par l'activité lactate-déshydrogénase (LDH) du milieu de culture, en parallèle à un test d'exclusion au bleu trypan L'exposition des différents types cellulaires n'entraîne, à aucun des temps étudiés, une augmentation significative de l'activité LDH dans le milieu de culture cellulaire. Les tests de viabilité par exclusion du bleu trypan confirment ces données.
  
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  Le stress oxydant a été mesuré d'une part par la détection de résidus 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE), marqueurs spécifiques de la peroxydation lipidique, et d'autre part par la mesure de l'oxydation d'une sonde de DichloroFluoresceine DiAcétate (DCFH-DA), qui émet de la fluorescence lorsqu'elle est en présence d'oxydants.
  

L’exposition des cellules épithéliales alvéolaires de la lignée A549 humaine au condensat de fumée de cigarette entraîne une augmentation dose-dépendante de la peroxydation lipidique, évaluée à travers la détection du 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE). Cet effet semble, cependant, être moins important que celui induit par l’exposition des cellules aux particules diesel. Il n’y a pas de synergie entre les 2 expositions. Cet effet des particules diesel est retrouvé en termes d'oxydation du DCFH-DA, notamment au niveau des cellules musculaires lisses des voies aériennes.

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  L'expression des métalloprotéases de la matrice (MMPs) et de leurs inhibiteurs (TIMPs) a été évaluée par RT-PCR, et leur activité par zymographie.
  

Après 6 heures d'exposition, les cellules A549 montrent une diminution de l'expression de la MMP-2 pour toutes les stimulations utilisées. La MMP-9, autre gélatinase, n'est exprimée que très faiblement par les cellules A549, et aucune modification de son expression n'a pu être décelée. En termes d'antiprotéases, les expressions de TIMP-1 et de TIMP-2 ne sont pas modifiées. Après 24 heures de stimulation, on note une légère augmentation de l'activité gélatinolytique attribuable à la MMP-2 en réponse au condensat de fumée ou aux particules diesel, cet effet étant additif lorsque les cellules sont stimulées par les deux en même temps.

En ce qui concerne les macrophages alvéolaires, dès 3 heures d'exposition, l'expression de l'ARN de la MMP-12, métalloélastase macrophagique, est légèrement augmentée en réponse au condensat de fumée de cigarette, et encore plus en réponse aux particules diesel. On n'observe pas de réponse synergique en présence des deux types de stimulants. L'expression de la MMP-9 n'est pas modifiée, ni celle de TIMP-2. En termes d'activité gélatinolytique, l'exposition pendant 24 heures des macrophages au condensat de fumée entraîne une augmentation de l'activité attribuable à la MMP-2. L'activité MMP-9 augmente quant à elle en réponse aux deux stimuli.

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  La mesure de la prolifération des cellules musculaires lisses des voies aériennes a été réalisée par incorporation de thymidine tritiée sur 24 heures.
  

La mesure de l'incorporation de thymidine tritiée par les cellules musculaires lisses bronchiques sur 24 heures montre que le condensat de fumée de cigarette entraîne un blocage de la prolifération de ces cellules. L'exposition aux particules diesel seules entraîne une légère augmentation de la prolifération, mais bloque la réponse hyperproliférative à un facteur de croissance, le PDGF. Ces effets passent par la voie des oxydants, puisque le prétraitement des cellules avec un antioxydant, la N-Acétyl Cystéine, corrige ces effets. L'exposition des cellules à la fois au condensat de fumée et aux particules diesel entraîne un blocage de la prolifération encore plus important que celui observé avec le condensat seul.