T. C. Erciyes üNİversitesi eczacilik faküLtesi

T

.C.

ERCİYES ÜNİVERSİTESİ

ECZACILIK FAKÜLTESİ

İNSÜLİNİN BİYOTEKNOLOJİK ÜRETİMİ

Hazırlayan

Tolga AYTAN

Danışman

Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK

Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı

Bitirme Ödevi

Mayıs 2011

KAYSERİ

“İnsülinin Biyoteknolojik Üretimi” adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir.

Tezi Hazırlayan Danışman

Tolga AYTAN Doç.Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK

Farmasötik Biyoteknoloji ABD Başkanı

Doç.Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK

ONAY :
Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı’nın ………....… tarih ve …………..…… sayılı kararı ile onaylanmıştır.

………. /……../ ………

Prof.Dr. Müberra KOŞAR

Dekan

TEŞEKKÜRLER

Bitirme ödevim boyunca bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım değerli hocam Doç.Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK ‘e Bitirme ödevimi hazırlamamda bana destek olan değerli hocam Berrak BAŞAK DUMLUPINAR ‘a Bitirme ödevimi hazırlamamda bana destek olan değerli arkadaşım Muhammed DOĞAN ‘a Öğrencilik yaşamım boyunca hiçbir emeklerini esirgemeden bana gösterdikleri sabır ve destek için aileme sonsuz teşekkür ederim.

İNSÜLİNİN BİYOTEKNOLOJİK ÜRETİMİ

ÖZET

Yirminci asrın harika ilacı ve hormonu olan insülinin keşfinin 84. yılındayız. İnsülin sadece şeker hastalarında kan şekeri düzenleyicisi değildir. Bunun yanı sıra; gelişme, büyüme ve yenilenme fonksiyonlarını da dolaylı yoldan etkileyici bir güce sahiptir. Üretilen ilk insülin preparatları hayvan pankreasından elde edilirken son 10 yıl içinde yarı sentetik yolla insan insülini elde edilmiş ve daha sonra genetik mühendisliği ile bakteriler ve mayalara insan insülin geni aşılanarak insan insülini üretmeleri sağlanmıştır. Günümüzde biyosentetik insan insülinleri rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmekte ve şeker hastalarınca yaygın olarak kullanılmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır. Rekombinant insan insülini Escherichia coli veya mayalarda proinsülin kodlayan genin klonlanması ile üretilmektedir. Proinsülin bu bakteri veya maya hücrelerinde üretildikten sonra saflaştırılır ve enzimatik işlemlere tabi tutularak insan insülini elde edilir.

Anahtar Kelimeler: İnsülin, Rekombinant DNA, Biyoteknoloji

BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF INSULIN

ABSTRACT

We are in the 84th year of discovery of insulin which is the wonderful medicine and hormone of 20th century. Insulin is not a hormone that only regulates the blood glucose in diabetics. Besides this, it has a power of effecting the growth, development and renewing functions by indirect ways. The first produced insulin preparation were obtained from animal pancreas , but in the last decade, human insulin has been obtain by using semi synthetic ways and then by injecting human insulin gene into bacteria and yeast, it has been provided them to produce human insulin gene via genetic engineering. Today biosynthetic human insulin is produced by using recombinant DNA technology, and it is commonly used by diabetics. The recombinant DNA technology is the total of the techniques of the studies that aim to insert a gene, which has been insulated from a living thing by any way, into an appropriate host and then provide it to be reproduced there and sometimes to be expressed there. The recombinant human insulin is produced by cloning the gene that codes the Escherichia coli or proinsulin in yeast. After proinsulin is produced in this bacteria or yeast cells, it is purified and then by subjecting it into enzymatic processes, human insulin is obtained.

Key Words: Insulin, Recombinant DNA, Biotechnology

İÇİNDEKİLER

KABUL ONAY i

TEŞEKKÜR ii

ÖZET iii

ABSTRACT iv

İÇİNDEKİLER v

KISALTMALAR vii

ŞEKİLLER VE TABLOLAR DİZİNİ viii

1.GİRİŞ VE AMAÇ 1

2.BİYOTEKNOLOJİ 2

2.1.Biyoteknoloji nedir 3

2.2.Biyoteknolojik tanımlamalar 3

2.2.1.Modern Biyoteknoloji 3

2.2.2.Moleküler Biyoloji 4

2.2.3.Bitkisel Biyoteknoloji 4

2.2.4.Biyogüvenlik 4

2.2.5.Gen Teknolojisi 4

2.2.6.Biyolojik Çeşitlilik 4

2.2.7.Rekombinant DNA (Deoksiribonükleik Asit) 4

2.2.8.Rekombinant DNA Teknolojisi 4

2.3. Farmasötik biyoteknolojinin tarihsel gelişimi 5

2.4 Biyoteknolojik ilaç çeşitleri 7

3.REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ 8

3.1. Gen izolasyonu 11

3.2. Uygun gen faşıma aracı (Vektör) 11

3.3. Genin hücreye sokulması 13

3.4. Geni içeren hücrenin seçimi 13

4.İNSÜLİN 14

4.1.İnsülin nedir 14

4.2.İnsülinin tarihçesi 15

4.3.İnsülinin yapısı kimyası ve biyokimyası 16

4.4.İnsülin sentezinin doğası ve amacı 17

4.5.İnsülin üretimi 19

4.6.İnsan insülini sentezinin basamakları 20

4.7.Rekombinant DNA teknolojisi ile insülin üretimi 20

4.7.1.Vektör (Gram Negatif E. coli) 22

4.7.2.Genetik Mühendislerinin Araç Kutusu İçindekiler 23

4.7.3.Humulin Üretimi 24

4.8.Genetik Olarak İşlenen Rekombinant İnsan İnsülininin Biyolojik İçerikleri 27

4.9.İnsülin üretimi için biyoteknolojik tesisler 27

4.9.1.Yeşil Alan Üzerinde Bağımsız Bir Tesis 28

4.9.2.Zorlu Üretim Süreci 30

4.9.3.Proses Görüntüleme ve Dökümantasyon 31

5.TARTIŞMA VE SONUÇ 35

6. KAYNAKLAR 38

ÖZGEÇMİŞ 41

KISALTMALAR

EPA : Plazminojen aktivatör

EPO :Eritropoitein

HAT : Hipoksantin, Aminopterin ve Timin

HVAC : Isıtma- Havalandırma- Klima tesisatı

G-CSF :Granulosit koloni stimule edici faktör

GMP : İyi İmalat Uygulamaları

IGF1 :Growth factor 1

IGF2 :Growth factor 2

LIMS :Labaratuvar bilgi işletim sistemi

LKCA : Linde Tesisi İnşası

PCR :Polimeraz zincir reaksiyonu

TABLO VE ŞEKİL DİZİNİ

Tablo 1:Biyoteknolojik yöntemlerle üretilen ve Dünyada en çok satılan 12 terapötik protein türü ilaç 7

Şekil 1:Rekombinant DNA’ların üretilmesi 10

Şekil 2:cDNA eldesi 12

Şekil 3: İnsülin zinciri 16

Şekil 4: B insülin zinciri için gerekli özel nükleotid zinciri ile birlikte sarılmış DNA 16

Şekil 5: Diyabetik kişinin kan glikoz seviyesindeki yükselme ve alçalmalar (dalgalanmalar) sağlıklı bireyler ile karşılaştırılması 18

Şekil 6: Rekombinasyon (yeniden birleştirme) işlemine genel bir bakış 19

Şekil 7: İnsülinin B zincirinin kodlanması için gerekli olan ve açığa çıkan nükleotidler ile birlikte DNA 11. kromozomunun çözülme ipliği 20

Şekil 8: Açığa çıkan DNA iplikçiği 21

Şekil 9: (m)RNA iplikçiği 21

Şekil 10: Ribozomdaki tercüme işlemi 21

Şekil 11: Taşıyıcı RNA molekülleri kodonların bağlandığı özel amino asit 22

Şekil 12: E. coli hücresi içine insülin tanıtılması 22

Şekil 13: Vektörlerin plazmidlerinin elektron mikroskobu ile görünüşü 23

Şekil 14: İnsülin üretimi 24

Şekil 15: İnsan insülini yapısı. amino grup asit RNA’dan DNA’ya dönüşüm 24

Şekil 16: A ve B zincirlerinin E.coli plazmidleri içine yerleştirilmesi 25

Şekil 17: Mitosiz İşlemi 26

Şekil 18: A veya B zinciri ile birleşen beta-galaktosidaz 26

Şekil 19: İnsan İnsülini Molekülü 27

Şekil 20: Lantus Aventis at the Höchst Industrial Park. 28

Şekil 21: Propanol damıtma tesisi, fermentasyon binası ve tank deposunun görünümü 31

Şekil 22: Depolayıcı özelliğe sahip, genetiği değiştirilmiş insülin türevi üretimi için gerekli olan tesisin 3 boyutlu dizayn modeli ve yapısal planı 33

Şekil 23: Ana ürünlerin teste tabi tutulduğu kısım. 33

Şekil 24: Höchst Industrial Park’ta bulunan Aventis Lantus tesisinin güney doğusuna bir bakış 34

1.GİRİŞ VE AMAÇ

İnsülin, insüline bağlı Diabetes Mellitus'un tedavisi için gereklidir. Daha önceki yıllarda insülin sığır veya domuz pankreasından elde edilmekteydi. Fakat bu insülin insan insülininden kimyasal olarak farklılıklar taşıyordu. Şeker hastalarında bu insülinle tedavi sonrası antikorların oluşması, insülinin biyosentezinin rekombinant DNA teknolojisiyle eldesinin önemini daha da arttırmıştır (1).

Üretilen ilk insülin preparatları hayvan pankreasından elde edilirken (sığır, domuz ya da sığır/domuz karışımı) son 10 yıl içinde yarı sentetik yolla insan insülini elde edilmiş (Hayvanlardan elde edilen insülin biyolojik ve kimyasal reaksiyonlarla insanın ürettiği insülinle aynı hale getirilmiş) ve daha sonra genetik mühendisliği ile bakteriler ve mayalara insan insülin geni aşılanarak insan insülini üretmeleri sağlanmıştır. Günümüzde biyosentetik insan insülinleri rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmekte ve şeker hastalarınca yaygın olarak kullanılmaktadır (1,2).

1980’lere kadar, bütün insülinler inekler ve domuzlar gibi hayvanlardan elde ediliyordu. Bu ilacın bu formu hala çok kullanışlı olmasına rağmen, şimdi insan insülinin aynısını ekmek mayası gibi hücreleri kullanarak üretmek mümkün hale gelmiştir. Bunlar “biyosentetik” insülinler olarak adlandırılır (1,2).

İnsülinler en basit biçimde kısa, orta ve uzun etki süreli olmak üzere etki sürelerine göre sınıflandırılabilirse de unutulmaması gereken nokta enjekte edilen insülinin emilimi aynı kişide %25 oranında, kişiler arasında ise %50'ye varan oranda değişkenlik gösterebilir (3).

İdeal olan insülinine benzer insülinleri kullanmaktır. Elde edilme biçimine göre iki çeşit insan insülini vardır. Domuz insülininin insan insülinine benzeyecek şekilde değişime uğratılmasıyla elde edilen yarı sentetik insülinler ve insan vücudunun yaptığı insülinin yapısı ile aynı olacak şekilde genetik mühendislik teknikleri ile üretilen rekombinant (biyosentetik) insan insülini vücudumuzun ürettiği insülinine tamamıyla benzer olduğu için kullanıldığında vücudun bu insüline karşı tepki gösterme olasılığı hayvan insülinine göre çok daha azdır (1).

İnsan insülini insanlardan elde edilmez, insan vücudunun yaptığı insülin moleküler yapısı ile aynı olacak şekilde üretilir. En modern insülin tipidir ve laboratuvar koşullarında bazı kimyasal metodlar kullanılarak elde edilir. İnsan insülini vücudumuzun ürettiği insülinin tamamiyle aynısı olduğu için vücudun bu insüline karşı tepki gösterme olasılığı hayvan insülinlerine göre çok daha azdır (1,2).

2.BİYOTEKNOLOJİ

2.1.Biyoteknoloji nedir

Biyolojik süreçlerin insan yaşamında kullanımı insanlık tarihi kadar eski bir geçmişe dayanır. Bu anlamda geleneksel biyoteknoloji, insan toplulukları tarafından içerisindeki bilimsel mekanizma bilinmeden, yazılı tarihin başından bu yana ekmek yapımında, alkollü içeceklerin mayalandırılmasında, tarım bitkilerinin ve evcil hayvanların ıslahında yüzyıllardır uygulanmaktadır. Başlangıçta zanaatsal bir yaklaşımla kullanılan bu süreçlerin temel biyolojik bilimlerde 18. yüzyılda ortaya çıkan gelişmelere koşut olarak bilimsel ve teknolojik kontrolü devreye girmiştir. 1919 yılında Karl Ershy tarafından biyoteknoloji “biyolojik sistemlerin yardımıyla ham maddelerin yan ürünlere dönüştürüldüğü işlemlerdir” şeklinde tanımlamıştır. Moleküler biyoloji ve moleküler genetik bilimlerinde 1950’li yıllardan itibaren ortaya çıkan gelişmeler, 1970’li yıllarda biyoteknoloji alanında meyvesini vermeye başlamıştır. Buna bağlı olarak da moleküler düzeyde yapılan genetik manipülasyonlarla verimliliğin ve üretkenliğin arttırıldığı, yeni ürünlerin üretebildiği görülmüştür. Bu gelişmelere paralel olarak biyoteknolojinin tanımı değişikliğe uğrayarak; “biyolojik sistem ve canlı organizmaları veya türevlerini kullanarak, özel bir kullanıma yönelik olarak ürün veya işlemleri dönüşüme uğratmak üzere geliştirilen teknolojik uygulamalar” şeklinde tanımlanmaya başlanmıştır (4).

2.2.Biyoteknolojik tanımlamalar

2.2.1.Modern Biyoteknoloji: Geleneksel olmayan ve modern bilgi ve tekniklerin uygulanmasıdır. Bu tanımlama zaman zaman sadece genetik mühendisliğine dayanan tekniklerle gerçekleştirilen biyoteknolojiyi tanımlamakta da kullanılmaktadır (5).

2.2.2.Moleküler Biyoloji: Biyolojinin bir alt alanını kapsayan bu tanım, canlıların ve

biyolojik olguların moleküler düzeyde (çoğu kez DNA, RNA ve protein düzeyinde) tanımlanmasına yönelik bilgi ve teknikleri kapsamaktadır (5).

2.2.3.Bitkisel Biyoteknoloji: Tarımsal ürünlerin hali hazırda, üretim sürecinde maruz

kaldıkları çeşitli hastalık, zararlı ve yabancı ot problemlerinin verim üzerine bilinen olumsuz etkilerinin ortadan kaldırılması ile kalitelerinin yükseltilmesinde kullanılan, modern biyoteknoloji yöntemleri ile geliştirilmiş tohumların elde edilmesi ile uğraşan bilim dalıdır (5).

2.2.4.Biyogüvenlik: Modern biyoteknoloji tekniklerinin, uygulamalarının ve modern biyoteknoloji ürünlerinin insan sağlığı ve biyolojik çeşitlilik üzerinde oluşturabileceği olumsuz etkilerin belirlenmesi sürecini ve belirlenen risklerin meydana gelme olasılığının ortadan kaldırılması ya da meydana gelme durumunda oluşacak zararların kontrol altında tutulması için alınan tedbirleri kapsayan bir kavramdır (5).

2.2.5.Gen Teknolojisi: Bir canlı türüne başka bir canlı türünden gen aktarılması veya mevcut genetik yapıya müdahale edilmesi yoluyla yeni genetik özellikler kazandırılmasını sağlayan modern biyoteknoloji teknikleridir (5).

2.2.6.Biyolojik Çeşitlilik: Ekosistemlerin insanlığın gönenci için elzem olan yaşam destek sürecini sürdürebilme yeteneğinin ve sağlıklı çevrenin göstergesidir (5).

2.2.7.Rekombinant DNA (Deoksiribonükleik Asit): Yabancı DNA parçalarının eklenmesi, bazı DNA parçalarının çıkartılması ve benzeri yöntemlerle doğal diziliş sırası değiştirilmiş olan DNA’dır (5).

2.2.8.Rekombinant DNA Teknolojisi: Rekombinant DNA teknolojisi, çeşitli materyallerden genlerin izole edilmesi, genler üzerinde değişik manipülasyonların uygulanması, genlerin klonlanması ve daha sonra da araştırmalarda kullanılması gibi moleküler uygulamalar şeklinde tanımlanmaktadır. Bu teknolojinin kullanıldığı alanlardan bazıları; zararlılara karşı direnç sağlayan genlerin bitkilere transferi; bitkilere tuzluluk ve herbisitlere dayanıklılığı sağlayan genlerin transferi; bakterilere toksik atıkları temizleme özelliği kazandıran genlerin ilavesi; ürünlerin kalite ve veriminin artırılmasıdır (5).

2.3. Farmasötik biyoteknolojinin tarihsel gelişimi

Bu tanıma göre biyoteknolojinin tarihini, insa­noğlunun yerleşik düzene geçtiği on bin yıl önce­sine kadar götürmek mümkündür. Yabani bitki ve hayvanların evcilleştirilmesi, bunların melezlerinin oluşturulması ile insanın gereksinimlerin uygun yeni türlerin geliştirilmesi, bugünkü genetik olarak değiştirilmiş bitki ve hayvanların geliştirilmesine örnek olan uygulamalardır. Diğer taraftan, bitkisel ve hayvansal ürünlerin (üzüm, süt, et gibi) ferman­tasyon gibi tekniklerle şarap, yoğurt, peynir veya pastırmaya dönüştürülmesi de biyoteknolojinin ilk örnekleridir. Ürün geliştirmede biyolojinin kullanımını, 1866'da başlayan Mendel'in bezelye deneylerine kadar gö­türmek mümkündür. Mendel'in bu gözlemleri, mo­dern genetiğin temellerini oluşturmuştur. Modern biyoteknoloji ile ilgili belgelerde, bu teknolojinin başlama tarihi olarak 1979 kabul edilse de, rekombinant protein üretiminde bugün kullanılmakta olan fermantasyon teknolojisi ilk kez 1. Dünya Sava­şında, mısır şekeri fermantasyonunda ve patlayıcı amaçlı aseton üretmek için kullanılmıştır. Aynı fer­mantasyon teknolojisi daha sonra, 2. Dünya sava­şında, antibiyotik üretiminde kullanıldı ve böylece yüz binlerce insanın ölümü engellenebildi. 1869'da Friederich Miescher'in DNA'yı izole etmesi, 1928'de Alexander Flemming'in penisilini bulması, 1953'de James Watson, Francis Crick ve Rosalinda Franklin'in DNA'nın yapısını tanımlamaları, 1961 'de Marshall Nirenberg ve Gobind Khorana'nın genetik kodu çözmeleri, modern biyoteknoloji endüstrisine geçişte önemli kilometre taşlarını oluşturmuştur. 1970'ler de hücre bölünmesi ve protein yapısının anlaşılması, DNA kesici enzimleri ve polimerazları da içeren DNA replikasyon enzimlerin izolasyonuy­la başlayan Walter Gilbert'in ilk rekombinant DNA deneyleri, 1975'de ilk hibridomanın yapılması, 1976'da ilk biyotek firması olan Genentech'in kuru­luşu, 1982'de tanı amaçlı ilk monoklonal antikorun üretimi, yine aynı yılda insülinin ilk in­san terapötik proteini olarak üretilmesi, bu yoldaki en önemli gelişmeler olmuştur (6).

Modern biyoteknolojinin tedavi alanında uygula­nabilirliği 1980'lerde kesinlik kazanınca, bundan 20 yıl kadar önce, başlangıcında çoğu ABD'de olmak üzere, "start-up" biofarmasötik şirketleri kurulma­ya başladı. E.coli’de ilk gen nakli 1973 yılında Boyer ve Cohen tarafından gerçekleştirildi. Böylece modern biyoteknoloji bu iki yönteme dayalı olarak günümüzdeki gelişmiş düzeyine ulaşmıştır; zira, DNA zincirinin parçalara ayrılabilmesi ve çoğaltılarak mikroorganizmalara yerleştirilmesi olanaklı hale gelmiştir (7).

Bugün sayıları bir kaç yüzle ifade edilen bu şirketlerin çoğu girişimci moleküler biyologlar tarafından kuruldu. Dolayısı ile, bu küçük firmalar, biyoteknoloji arenasında kendilerine avantaj sağlayacak akademik ve teknik deneyime sahip olmalarına rağmen, ilaç üretim tecrübelerinin olmaması gibi önemli bir handikap taşımaktaydılar. Diğer taraftan, önde gelen farmasötik şirketleri ise, bu hızla büyü­yen çok önemli teknolojinin yüksek potansiyelini önceleri fark edemeyerek modern biyoteknoloji ala­nına girmekte yavaş davrandılar. Zamanla, bu ikili sorun, küçük biyoteknoloji firmalarının büyük ilaç firmaları ile kurduğu ittifaklar yoluyla aşıldı. Örneğin, Genentech biyoteknoloji firması rekombinant insan insülinini geliştirdi. Eli Lilly bu ilacı Humulin® marka adı ile piyasaya sürdü. Son zamanlarda ise başarılı küçük biyoteknoloji firmaları, büyük ilaç firmaları ta­rafından, çok yüksek fiyatlarla satın alınmaktadır (6).

1980’li yıllarda, laboratuvar koşullarında DNA parçalarının kopyalarının üretilmesini sağlayan PCR yöntemi geliştirilmiştir. Günümüzde ilaç olarak kullanılan terapötik protein­lerin neredeyse tamamı, ya memeli hayvan hücresinde, ya E.coli'’de ya da Saccharomyces cerevisiae maya türünde üretilmek­tedir. Ancak, başka sistemler de terapötik protein üretimi için denenmektedir. Modern biyoteknoloji firmalarının başlattığı bu yeni akım, 20 yıl gibi kısa bir sürede 50'den fazla farklı terapötik proteinin hastaların kullanımına sunulmasını sağlamıştır. 1982'de insan insülininin E.coli'de üretilmesinden sonra, sayıları her yıl hızla artan bu ilaçlardan Protropin (1985), Intron A (1986-1992), Alferon N (1989), Activase (1990), Recoınbinate (1992), Epogen (1993), Procrit (1993), Orthoclon (1993), Betasemn (1993), Kogenate (1993), Cerezyme (1994), Nutropin (1994), Neupogen (1994) örnek olarak verilebilir. Toplam ilaç türlerinin binle­re ulaştığı bir ilaç endüstrisinde, 50 yeni molekülün anlamının sınırlı olabileceği gibi bir kanıya kapılma­dan önce, bu 50 kadar ilacın, kısa bir süre içinde yılda 30 milyar dolarlık bir paya sahip olduklarını hatırlamak gerekir. Tablo 1'de terapötik prote­inler içinde satış rakamları açısından en önde yer alanların bir listesi sunulmaktadır (6,8).

Tablo 1:Biyoteknolojik yöntemlerle üretilen ve Dünyada en çok satılan 12 terapötik protein türü ilaç



2.4 Biyoteknolojik ilaç çeşitleri

Biyoteknoloji, geliştirme veya ürüne dönüştürme aşamasında canlı organizmaların kullanıldığı bir teknoloji alanını ifade ettiği için, bugün geleneksel ilaç­lar haline gelmiş olan hayvan kaynaklı (androjenler, östrojenler, kortikosteroidler vb.), bitkisel kaynaklı (atropin, morfin, kardiyak glikosidler, aspirin vb.) ve mikrobiyolojik kaynaklı ilaçlar (antibiyotikler vb.) biyoteknolojik ilaçlar kapsamında tanımlanmaktadır. Ancak, günümüzün biyoteknolojisi, yani modern biyoteknoloji, geleneksel biyoteknolojiden farklı bir konumdadır. Modern biyoteknolojiye dayanan yeni ilaçlar kısaca "biyofarmasötikler" olarak tanımlanabilir. Biyofarmasötikler ise iki ana sınıfta incelenebilir: küçük moleküllerden oluşan "kimyasal ilaçlar" ve daha büyük moleküllerden oluşan "terapötik protein­ler" dir (6).

3.REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

Moleküler genetik araştırma tekniklerinin gelişmesi araştırıcılara farklı kaynaklardan yani organizmalardan gelen DNA moleküllerinin in vitro'da birleştirilebilme olanağı sağlamıştır. Farklı kaynaklardan gelen moleküllerin birleştirilmesi ile oluşan DNA moleküllerine rekombinant DNA denir ve kısaca rDNA olarak yazılır. Doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan, çoğunlukla farklı biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin, genetik mühendislik teknolojisiyle kesilmesine ve elde edilen farklı DNA parçalarının birleştirilmesi işlemlerini kapsayan bir teknolojidir. Rekombinant DNA üzerinde restriksiyon endonükleaz analizleri, DNA dizileme ve yönlendirilmiş mutasyon gibi genetik analiz ve manipulasyonlar gerçekleştirilebilir. Bütün bu işlemleri yapmak için kullanılan tekniklerin tamamına rekombinant DNA teknolojisi denir. Bu teknik genetik mühendisliği olarak da adlandırılır. Bu alanda yapılan işlemler, kısaca genlerin herhangi bir organizmadan alınarak üretilmesi ve üretilen genlerin gerek temel, gerekse uygulamalı araştırmalar için kullanılması olarak özetlenebilir. Bu teknoloji bugün temel bilimler, tıp, endüstri, hayvancılık, ziraat, çevre mühendisliği gibi alanlarda yaygın bir biçimde kullanılmaya başlamıştır (9).

Bu teknolojinin bilimsel temeli olan çeşitlenme (rekombinasyon) genetik bir olaydır ve doğada canlılar arasında görülen çeşitliliğin önemli nedenlerinden birini oluşturur. Rekombinasyon; farklı genotipteki bireyler arasında eşleşmeler söz konusu olduğunda, anne babaya ait kalıtsal özelliklerin dölde değişik gruplanmalar halinde bir araya gelmesine yol açan olaylar dizisidir. Bu olay moleküler düzeyde, farklı nükleotid dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri arasındaki parça alış­verişi sonucunda meydana gelen yeni gruplamalardır. Bunun için DNA molekülleri arasında kırılmalar meydana gelir ve kırılma bölgelerinde DNA molekülleri arasında parça alışverişi oluşur. Sonuçta orijinal durumdaki DNA moleküllerine tam olarak benzemeyen ve onlara ait nükleotid dizilerini kısmen taşıyan rekombinant DNA molekülleri oluşur (9,10).

Homolog çeşitlenme (rekombinasyon), eşeyli üremeyle genelde mayoz bölünmedeki kromozomal parça değişimi sonucunda meydana gelir. Bakte­rilerde çeşitlenme farklı işleyişlerle, transformasyon konjugasyon ve trandüksiyon olaylarıyla görülür. Bu olayların hepsinin temeli DNA molekülleri arasında homoloji olmasına dayanmaktadır. Bu yüzden doğada çeşitlenme, aynı türe ait bireyler arasında ya da çok yakın türler arasında kısıtlıdır. Farklı türler arasında var olan çeşitli düzeydeki eşleşme engelleri farklı türlere ait bireyler arasında genetik bilgi aktarımına, dolayısıyla da rekombinasyona olanak sağlamamaktadır. Rekombinant DNA teknolojisinin tanımı ve kapsamı çeşitli toplumlara ya da bilim insanlarına göre farklılıklar göstermektedir. Bununla birlikte, bu değişik tanımlar arasında hepsindeki ortak yönleri birleştiren oldukça geniş ve günümüzün modern ölçütlerine uygun bir tanım şu şekilde yapılabilir: Rekombinant DNA teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır (11).

Belirli bir amaç için doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan bu teknolojiyle, in vitro şartlarda genetik materyalde planlı değişiklikler yapılabilmekte, istenilen genlerin istenilen canlıya sokularak, doğal biçimde bulunmadığı bu konakta çoğaltılması ve istenilen ürünü vermesi için nakledilen genin ifadesi sağlanabilmektedir. Bu teknolojiyle, prokaryotik ve ökaryotik gruplara ait türlerin kendi aralarında olduğu kadar, gruplar arasında da gen aktarımları yapmak ve çeşitlilikler meydana getirmek mümkün olmaktadır. Transgenik hayvanlar kendi genomunda başka bir organizmaya ait rekombinant bir geni taşıyan hayvanlar olarak tanımlanmaktadır (10,11).