T. C. Erzurum Teknik Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü temel genetik laboratuvari hazırlayan: Arş. Gör. Ayşenur yazici mikrobiyal Biyoteknoloji Anabilim Dalı

Sizin üçün oyun:

Google Play'də əldə edin


Yüklə 189.84 Kb.
tarix30.10.2017
ölçüsü189.84 Kb.




T.C.

Erzurum Teknik Üniversitesi

Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

TEMEL GENETİK LABORATUVARI

https://s-media-cache-ak0.pinimg.com/736x/09/32/76/0932768f294ad98485dd586cd98843af.jpg

Hazırlayan: Arş. Gör. Ayşenur YAZICI

Mikrobiyal Biyoteknoloji Anabilim Dalı

2017

İÇERİK

Dersler

Konu

Deney Kontrolü

Konu 1

Bölüm 1: Temel Genetik Laboratuvarında Uyulması Gereken Kurallar




Konu 2

Bölüm 1: Mendel Genetiğine Giriş ve Terminoloji

Bölüm 2: Model Organizmalar




Konu 3

Bölüm 1: İnsan Genetiği (Örneklerle Açıklama)

Bölüm 2: İnsan Kromozomları




Konu 4

Bölüm 1: Karyotip analizi




Konu 5

Bölüm 1: Pedigri Analizi




Konu 6

Bölüm 1: Barr Cisimciği Analizi




Konu 7

Bölüm 1: D. melanogaster Kültürleri




Konu 8

Bölüm 1: Politen Kromozom Boyaması





Konu 9

Bölüm 1: Bitki Köklerinin Kromozom Analizi





Konu 10

Bölüm 1: C. elegans Kültürleri








Not: Yeni konu eklenebilir veya çıkarılabilir.





http://www.chrismadden.co.uk/cartoons/science-cartoons/genetics-cartoons-dna-cartoons/gene-dna-spiral-printer-cartoon.gif

KONU 1:

TEMEL GENETİK LABORATUVARINDA UYULMASI GEREKEN KURALLAR

Tarih




Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümünde, Temel Genetik Laboratuvar dersinin ayrı bir önemi vardır. Bu laboratuvar dersi; Genel Biyoloji Laboratuvar dersinin temelinde ilerler ve insana ilişkin genetik temeller model organizmalar üzerinden anlatılır. Laboratuvar dersinin sonunda, temel genetik kavramları öğrenilerek, basit ve ileri düzeyde deney tasarlayabilme konusunda öğrenciler bilgilendirilir.

Dersin hedefleri kapsamında, dersi daha iyi anlayabilme ve kavrama açısından ayrıca, yaşanabilecek herhangi bir kaza ve yaralanmalara karşı mutlaka uyulması gereken güvenlik kuralları vardır. Bu kurallar;



  1. Önlük giyilmeli, gereken deneylerde eldiven, gözlük ve maske kullanılmalıdır. (Gerektiği zaman bir hafta önce, deney asistanı tarafından bildirilecektir.)

  2. Önlük, eldiven, gözlük ve maske öğrenci tarafından sağlanacaktır.

  3. Laboratuvara başlamadan önce yapılacak deneyler veya teorik bilgiler mutlaka okunmalı ve getirilmesi gereken araç-gereçler mutlaka getirilmelidir.

  4. Derste söylenilen bütün kurallara uyulması zorunludur.

  5. Laboratuvarda yemek, içmek ve gıda maddelerinin bulundurulması yasaktır.

  6. Deney sırasında masaların üzerinde sadece gerekli araç ve gereçler ile not almak için laboratuvar kılavuzu bulunmalıdır. Çanta ve kıyafet kesinlikle bulunmamalıdır.

  7. Çalışma esnasında saçlar uzun ise mutlaka toplanmalıdır.

  8. Mikroskop kullanımından önce mikroskop mutlaka silinmeli, kullanım bittikten sonra yeniden silinerek yerine kaldırılmalıdır.

  9. Kimyasal malzemelere kesinlikle eldivensiz dokunulmamalı ve koklanmamalıdır.

Her öğrenci kendisine laboratuvar çantası hazırlamalı ve derse gelirken yanında getirmelidir.




Lab Çantası

1

Lab Föyü

2

Lab Defteri

3

Önlük

4

Eldiven

5

Lam-Lamel

6

Mikroskop Silme Bezi

7

Makas, Bant

8

Pamuk, Peçete

9

Marker



KONU 2:

BÖLÜM 1: MENDEL GENETİĞİNE GİRİŞ VE TERMİNOLOJİ

Tarih




Gregor Mendel ”modern genetiğin babası“ olarak tanınır. Fakat O, ökaryotik hücrelerin içerisindeki nükleustan ve kromozomlardan habersizdi. Kurduğu deney sistemleri ile Mendel Genetiğin temellerini atmış bir bilim adamıdır.

http://2nznub4x5d61ra4q12fyu67t.wpengine.netdna-cdn.com/img/dnaunwrapped.jpg

Gen:……………………………………………………………………………………………………………………………………………..

Genom:…………………………………………………………………………………………………………………………………………

Genotip:……………………………………………………………………………………………………………………………………....

Fenotip:……………………………………………………………………………………………………………………………………….

Ploidi:……………………………………………………………………………………………………………………………………………

Kromozom:…………………………………………………………………………………………………………………………………..

Lokus:…………………………………………………………………………………………………………………………………………..

Heterokromatin:………………………………………………………………………………………………………………………..

Ökromatin: …………………………………………………………………………………………………………………………………

Allel: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………

Homozigot:………………………………………………………………………………………………………………………………….

Heterozigot:……………………………………………………………………………………………………………………………….

Monogenik Özellik:…………………………………………………………………………………………………………………….

Poligenik Özellik:……………………………………………………………………………………………………………………….

Mendel’in Bezelyelerle Yaptığı Deneyler

Mendel’in Yapmış olduğu deneylerin şeması aşağıda gösterilmiştir.



http://www.nature.com/scitable/content/ne0000/ne0000/ne0000/ne0000/113240368/54938_46.jpg

Mendel Neden Bezelyeyi Seçti?

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………



http://www.nature.com/scitable/content/ne0000/ne0000/ne0000/ne0000/113239830/6719_45.jpg

Mendel’in Prensipleri

1. Bağımsız Ayrışım Prensibi

2. Bağımsız Dağılım Prensibi

Monohibrit Çaprazlama

Bir gen çifti ile yapılan hibridizasyona monohibrit çaprazlama denir. AA x aa monohibrit çaprazlamasında, döller Aa heterozigot melezleridir. İki gen çifti ile ilgili melezlemeye dihibrit, üç gen çifti ile ilgili olana trihibrit çaprazlama denir.

Punnet Karesi 1;


aa

AA

























http://www.nature.com/scitable/content/ne0000/ne0000/ne0000/ne0000/113348213/38983_47.jpg

(http://www.nature.com/scitable/topicpage/gregor-mendel-and-the-principles-of-inheritance-593#)

Dihibrit Çaprazlama: İki farklı karakterin çaprazlanmasıdır.

Punnet Karesi 2;



AaBb

AaBb









































































…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

http://www.nature.com/scitable/content/ne0000/ne0000/ne0000/ne0000/119417478/59987_48.jpg

KONU 3:

BÖLÜM 2: MODEL ORGANİZMALAR

Tarih




http://1.bp.blogspot.com/-rhmyfqeh7re/uh3xdu6vhri/aaaaaaaak3u/5ejd0gejp9c/s1600/modelorganism-copy.png

Biyolojik ve genetik olayların açıklanmasında sıklıkla kullanılan canlılara model organizma denir. Genetik çalışmalarda, özellikle insan hastalıkları ve genetiği ile ilgili yapılan çalışmalar etik sorunlar taşıdığı için model organizmalar tercih edilmektedir.



Model Organizmaların Özellikleri

1. …………………………………………………………………………………….

2. ……………………………………………………………………………………

3. ……………………………………………………………………………………

4. ……………………………………………………………………………………

5. ……………………………………………………………………………………



Ödev: Bir tane model organizma belirleyip, tüm özelliklerini ve genetik çalışmalarda kullanım alanlarını içeren (1-2 sayfalık) bir ödev hazırlayınız.

KONU 4:

BÖLÜM 1: İnsan Genetiği (Örneklerle Açıklama)

Tarih






  1. İnsanda Kan Grupları Analizi

human blood types ile ilgili görsel sonucu

Kan Grupları; ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..



Uygulama 3.1: Ailenize ait bir kan grubu analizi yaparak bunu punnet karesinde gösteriniz.


  1. İnsanda Diğer Genetik Özellikler

Saç Rengi Genetiği: …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Göz Rengi Genetiği: …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

KONU 5:

Bölüm 2: İnsan Kromozomları

Tarih




İnsan 23 çift olmak üzere toplam 46 kromozom sayısına sahiptir. 22 kromozom otozomal, X ve Y ise cinsiyet kromozomlarıdır.


………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………


Şekil 3.2: Kromozomun yapısı

human chromosome ile ilgili görsel sonucu

Şekil 3.3: İnsan Kromozomları Karyotipi

Konu 6:

Bölüm 1: Karyotip Analizi

Tarih




Her bir insan hücresi döllenmiş tek bir yumurta hücresinden meydana gelir. Döllenmiş bu hücre gelişimin her aşamasına ait tüm genetik bilgiyi içerir. Bu genetik bilgi kromozomlarda bulunan DNA’da paketlenmiş durumdadır.

Kromozomların boyutu türden türe değişiklik göstermektedir. Örneğin, Drosophila melanogaster’in metafaz kromozomunun ortalama boyutu 3,5 m’dir. Kromozomların biçimi ise sentromerin yerine gore değişmektedir. Sentromeri ortada olan kromozomlar metasentrik, bir uca daha yakın olanlar submetasentrik, bir uca çok daha yakın olanlar akrosentrik, tam uçta olanlara ise telosentrik kromozom adı verilir.



http://www.nature.com/scitable/content/ne0000/ne0000/ne0000/ne0000/46127/full_1_0.jpg

Şekil 1: Sentromerin yerine göre kromozom sınıfları [1].

Bir bireyin tüm kromozomlarının sayıları, büyüklükleri ve şekilleri bakımından görünümlerine karyotip denir. Karyotipi oluşturan kromozomları göz önüne alınarak hazırlanan grafiklere ise ideogram denir [2].

Şekil ve büyüklüğü bakımından birbirinden ayırt edilemeyen kromozomları ayırmak için bantlama yöntemleri geliştirilmiştir. Serbest metafaz kromozomları, mitoz aşamasında bulunan hücrelerin kromozomlarından elde edilir. Mitoz sırasında hücrelere kolşemid gibi tübülin inhibitörleri verilir. Bu şekilde iğ iplikleri inhibe edilir ve metafaz kromozomları serbest kalır. Bantlama yöntemi de bu aşamadaki kromozom boyaması temeline dayanır. Kromozomlar Feulgen, Giemsa, Aseto-karmin gibi boyalarla boyandığında açık ve koyu enine bölgeler oluşur. Bu bölgelerin sayı ve dağılımları homolog olan kromozomlarda aynı iken, farklı kromozomlarda farklılık gösterir.

UYGULAMA 1

İsim:……………………………………………….

Numara:………………………………………….

İnsan İdeogramı

Sonuç:………………………


1





2





3





4




Konu 7:

Bölüm 1: Pedigri Analizi

Tarih




Pedigri soyağacı demektir. Bir ailenin atasal yapısını gösterir. Pedigri grafikleri genel olarak aile içerisinde genetik olarak karakterlerin kalıtımını gösterir. Bir karakterin fenotipte dominant, resesif veya cinsiyete bağlı olarak kalıtılıp kalıtılmadığını belirlemede yardımcıdır.

Pedigrilerde en az 3 generasyon gösterilmek zorundadır. Hastalıklar ve beirgin özellikler için çeşitli semboller vardır.





Şekil 3: Pedigride sıkça kullanılan semboller

Proband:………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….



Şekil 4: Pedigri çizim örneği.

UYGULAMA 2

İsim:


Numara:

Pedigri Çizimi

Sonuç:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………...

Konu 8:

Bölüm 1: Barr Cisimciği Analizi

Tarih




Dişilerde bir çift olarak bulunan X kromozomlarından (XX) birisi ökromatik yani aktif, diğeri ise heterokromatiktir yani inaktiftir. Heterokromatik olan bu X kromozomu bazik boyalarla çok koyu boyanır ve Barr Cisimciği olarak adlandırılır. Bu yapı, nukleus zarına bağlı ve nukleustan dışa doğru uzanan koyu boyalı yuvarlak çıkıntı Barr cisimciğidir.

c:\users\fujitsu\downloads\ayşenur barr body resmi.jpg

Şekil 4: 60X ışık mikroskobu görüntüsü

Dişi insanlardan alınan kan örnekleri ile hazırlanan yayma kan preparatları giemsa ile boyanır. Polinuklear lökositler bulunarak boğumlu nukleusları içerir. Nukleusa bağlı olarak dışarı doğru uzanan koyu boyalı yuvarlak çıkıntı Barr cisimciğidir.



barr body ile ilgili görsel sonucu

Şekil 5: Barr Cisimciği Görüntüsü

Barr Cisimciği Görüntüleme İçin Preparat Hazırlama

……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….



Aldığınız Mikroskop Görüntüsü;


Konu 9:

Bölüm 1: Drosophila melanogaster Kültürleri

Tarih




Drosophila melanogaster Biyolojisi ve Morfolojisi

Giriş

Drosophila melanogaster meyve sineği veya sirke sineği olarak da adlandırılan Diptera takımına ait bir böcek türüdür. Temel genetik ve Mendel genetiği çalışmalarında sıklıkla kullanılan bir model olması bakımından laboratuvar derslerimizde kullanacağımız organizmadır.

Drosophila melanogaster genetik çalışmaların en başlarından itibaren kullanılmıştır. İlk kez 1909 yılında sinek odası kurarak genetik çalışmalara hız kazandıran bilim insanı Thomas Hunt Morgan’dır.

Drosophila niçin laboratuarda model organizma olarak kullanılır?

  1. Laboratuvarda bakımı ve yetiştirilmesi oldukça kolaydır. Boyut olarak küçüktür.

  2. Çok fazla döl verebilen ve hızlı üreyen bir türdür. Dişileri çok verimlidir.

  3. Kısa yaşam döngüsüne sahiplerdir.

  4. Genom dizilimi tamamlanmıştır. Dünyada çok fazla bilim insanının çalışmasından dolayı bilgi birikimi fazladır.

image of drosophila melanogaster

Şekil 1: Drosophila melanogaster

(http://eol.org/pages/733739/overview)

  1. Drosophila melanogaster’in Yaşam Ortamı

Tropikal Batı Afrika’dan kökenlenen ve günümüzde çok yüksek ve soğuk bölgeler dışında dünyanın her yerine dağılmış bir türdür.

Laboratuvar ortamında ortalama 20- 25 ̊C sıcaklıkta ve % 60 nem oranında (İdeal yaşam ortamı) yaşar. Değişik sıcaklıklık koşullarında ise yaşam döngüsünün süresinde değişiklik meydana gelir. Düşük sıcaklıklarda (18- 22 ̊C) üremeleri ve gelişim süreçleri yavaşlar. Yüksek sıcaklıklarda ise (25-28 ̊C) çok hızlı ürerler.



  1. Drosophila melanogaster Yaşam Döngüsü

Drosophila tam metamorfoz geçirir ve yaşamını 4 aşamadan oluşturur.

Bunlar embriyo, larva, pupa ve yetişkin aşamalarıdır.



Embriyo:

Yumurtanın döllenmesinin ardından oluşan ilk aşama embriyodur. Drosophila yumurtası ortalama 0,5 mm boyutlarında, oval şekilli ve koriyon ile kaplıdır. Arterior kısmında sperm girişini sağlayan mikropil adında bir giriş kısmı vardır. Mikropilden çok sayıda sperm girişi olabilir. Dişi birey bu spermleri sperm saklama organında depolar. Bir sperm yumurtayı dölledikten sonra dişi genellikle hemen yumurtayı bırakır.

Yumurtanın sperm tarafından döllenmesi ile oluşan embriyonun gelişim aşamalarında anne etkili genler ve RNA molekülleri çok önemlidir. Bu moleküllerin etkisiyle arterior, posterior, dorsal ve ventral bölgelerde çeşitli yapılar oluşur. Embriyonun anterodorsal kısmından iki tane filament çıkar. Bu filamentler besiyerine tutunmayı ve oksijen alış verişini sağlar.

Embriyoda çok hızlı nukleus bölünmeleri gerçekleşir, fakat bu bölünmeleri sitoplazma bölünmesi takip edemez. Dolayısıyla tek bir hücre içerisinde çok sayıda nukleuslar oluşur. Bu şekilde embriyoda oluşan yapıya sinsityum denir.

Zigotik nükleusun 8 mitotik hücre bölünmesi ortalama 8 dakika içerisinde gerçekleşir ve 256 nukleus oluşur bu aşama sinsityal blastoderm aşamasıdır. Dokuzuncu nükleus bölünmesi sırasında nükleuslar periphere doğru hareket eder. 5 nükleus ise posterior kısma doğru hareket eder. Bu hücreler hücre zarları ile kaplanır ve yetişkin bireyin gametlerini oluşturacak olan kutup hücrelerini verir. Tüm bu aşamaları 4 mitoz bölünme daha yavaş bir şekilde takip eder. 13 hücre bölünmesinin sonunda hücresel blastoderm oluşur [4]. Ardından hücre zarları oluşmaya başlar.

https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:and9gcqh4fnfxg_vnmq3nnaa3y_ckeidtbengw5lhhl8h6rf6wyvprbthq

Şekil 2: Drosophila yumurtası

(http://eol.org/pages/733739/media)

http://www.morgellonsuk.org.uk/images/fly_eggs/drosophila_egg.jpg

Şekil 3: Drosophila Embriyosu. Dikkatlice bakıldığında toz şeklinde besiyeri üzerinde görülebilir.

(http://eol.org/pages/733739/media)

Larva:

Döllenmenin ardından oluşan embriyo normal şartlarda 1 gün sonra larva haline dönüşür. Larva döneminde Drosophila oldukça hareketlidir. Larva bu dönemde 3 defa deri değişim süreci geçirir. (İnstar) Bu deri değişim süreçleri, beyin bölgesinde yerleşmiş olan halka bezlerinin salgıladığı hormonlar sayesinde gerçekleşir [4]. Bu aşamada larvadaki dokular imaginal diski oluşturur. İmaginal disk yetişkin sineğin organlarını (bacak, kanat, göz.. vs.) veren yapıdır. Larval imaginal diskin hasar görmesi hücre ölümüne ve gelişimin durdurulmasına yol açar [5].



http://www.diptera.info/forum/attachments/ds_11233_34m.jpg

Şekil 4: Drosophila Larvası

(http://eol.org/pages/733739/media)

Sürekli hareket eden ve beslenen larva bir gün sonra ilk deri değişimini gösterir. Ve bu birinci instar evresidir. İkinci gün de larva beslendikçe büyür ve kitinli yapıda olan derisini yeniden değiştirir. Buda ikinci instar aşamasıdır. Larva gelişmesi ilerledikçe üçüncü instar döneminde de girerek daha yavaş hareket etmeye başlar ve deri yapısı kalınlaşır.



Pupa:

Larva döneminin 4. gününde hareketsiz ve kalın kitin tabakalı pupa yapısı oluşur. Bu yapıda gelişim ile ilgili önemli değişiklikler meydana gelir.



swd pupae

Şekil 5: Pupa evresi

(http://eol.org/pages/733739/media)

Yetişkin:

25 ̊C sıcaklıkta embriyo evresinden ortalama 10 gün içerisinde yetişkin Drosophilalar oluşur. 40- 50 gün kadar uygun koşullarda yaşayabilirler.



http://zlgc.seu.edu.cn/jpkc/2010jpkc/jykc2/content/jxzy/genetics/reference_d/art_library/color_art_library/d_04.jpg

Şekil 6: Drosophila Yaşam Döngüsü

(http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Drosophila_melanogaster/)



  1. Drosophila’da Eşey Ayrımı

Özel bir çaprazlama deneyi kurabilmek için, öncelikle erkek ve dişileri birbirinden ayırmamız gerekir.

http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci111b/drosophila/flies-adults.gif

Şekil 4: Erkek ve dişi Drosophila melanogaster

Erkek

1…………………………………………………………………..

2……………………………………………………………………

3……………………………………………………………………

4……………………………………………………………………

5……………………………………………………………………



Dişi

1…………………………………………………………………

2…………………………………………………………………

3…………………………………………………………………

4…………………………………………………………………

5…………………………………………………………………



Tablo 1 : Erkek ve dişi Drosophila melanogaster’in özellikleri

Dişi Drosophilalar yaşamları boyunca ortalama 3000 kadar döl verebilirler. Ayrıca sperm saklama organları vardır. Bu yüzden çaprazlama deneylerinde henüz hiç çiftleşmemiş olan dişi Drosophilaları seçmek gerekir. Pupa evresinden yeni çıkan bir dişi Drosophila olgunluğa erişmediği için ilk 8-12 saat çiftleşemez. Bu aşamada dişi bireylerle erkekleri eşey tarağına bakılarak ayırma işlemi yapılmalıdır.



  1. Drosophila Genom Yapısı

Berkeley Drosophila Genom Project’inin tamamlanmasının ardından Drosophila genomuna ait bilgiler elde edilmeye başlamıştır. Dört çift kromozoma sahip olan Drosophila melanogater’in genomu 180 Mb’dir. Genomunun %67’si spesifik sekans, %3’ü rRNA - 5S RNA, %21 tekrarlı bölgeler ve % 9’u transpozonlardan oluşmuştur. Tüm genomun yaklaşık üçte ikisi ökromatin, geri kalanı ise heterokromatindir. Ökromatin bölgenin %98’i protein kodlayan genlerden oluşmaktadır. Heterokromatin bölge ise basit tekrarlı dizilerden oluşur.

http://01.edu-cdn.com/files/static/mcgrawhillprofessional/9780071625036/chromosomes_03.gif

Şekil 4: Drosophila melanogaster’de diploid hücrenin diagramı

(http://www.education.com/study-help/article/chromosomes/)


Konu 10:

Bölüm 2: Drosophila melanogaster Besiyeri Hazırlama ve İlk Kültür

Tarih






  1. Drosophila çalışmalarında Gerekli Materyaller



  • Stereo mikroskop: Drosophilaların eşey ayrımında ve diğer morfolojik özelliklerini belirlemede kullanılan mikroskop çeşididir.

  • Işık mikroskobu: Drosophila kromozom analizi çalışmalarında kullanılır.

  • İnkübatör: Drosophilaların yaşayabileceği sıcaklığa ayarlı inkübatörler gereklidir.

  • Besiyeri ve sinek kapları

  • Falkon: Sinekleri yetiştireceğimiz tüplerdir.

  • Anestezik maddeler: Eşey ayrımı ve çaprazlama yapabilmek için sinekleri kısa süreli bayıltmalıyız. Bu amaçla anestezik maddeler kullanılır.

  • Besiyeri için gerekli maddeler

  • Yumuşak uçlu fırça

  • Eldiven

  • Beyaz A4 kağıtlar

  • Pamuk

  • Sargı Bezi



  1. Drosophila Deneylerinde Kullanılan Sinek Aktarma Yöntemleri



  1. Eterizasyon: Sinekleri bayıltma işlemidir. Eşey tayini ve çaprazlama deneyleri için sineklerin erkek ve dişi ayrımının yapılması gerekir. Bu amaçla sinekler bayıltılarak gerekli incelemeler ve virgin dişiler seçilir. Laboratuar ortamında bu işlem Eter kullanılarak yapılır.

Eter kullanımındaki temel prensip sinekleri bir süre (1-2 dk) kadar eter gazına maruz bırakma işlemidir. Bu sürenin 1-2 dk dan fazla olması sineklerin ölmesine neden olacaktır. Bu bakımdan sinekler besiyeri üzerine düşmeye başladığı anda eterli pamuk kültür ortamından uzaklaştırılmalıdır.

  1. Sinekleri bayıltmadan kültür ortamını değiştirme: Sinekler ışığa doğru yönelme eğilimindedir. Bu yüzden kültür ortamının tabanına düşürülen sinekler yeni kültür ortamına kolaylıkla aktarılabilir.



  1. Soğuk ortamda sinekleri bayıltma: Meyve sinekleri -20 °C de 5-10 dakika kadar bekletildiğinde uyuşma ve hareketsizleşme eğilimi gösterirler. Bu süre sonunda hareketsizleşen sinekler alınarak, buz üzerinde çalışma gerçekleştirilebilir ve kültür değişimi yapılabilir.



  1. Drosophilaların Besiyeri Kaynakları

Drosophilalar doğal ortamda fermente olmaya başlayan veya çürümüş olan meyvelerin üzerinde yaşarlar. Fakat çürümüş olan bu besinler Drosophilaların besin kaynağını oluşturmazlar. Bu besinler üzerinde yaşayan mayalar Drosophilaların temel besin kaynağıdır.

Laboratuarda hazırlayacağımız besiyeri içersinde sineklerin yaşamlarına engel olmayacak maya türleri tercih edilmelidir. Örneğin; S. cerevisiae ortamdaki oksijenin azalmasına sebep olduğu için besiyeri içerisinde tercih edilmez.

İyi bir besiyeri mayaların çoğalıp üreyebilmesi için gerekli miktarda şeker içermelidir.

Besiyeri ortamının küflenmemesi için besiyeri içerisine asit eklenmelidir. Çünkü Küfler asitli ortamda yaşayamazlar [6].



Deneyin Amacı

Model organizma olarak kullanılacak olan meyve sinekleri için kültür ortamı hazırlamak ve virgin dişi sinek elde edilmesi için ilk kültür ortamını hazırlamaktır.



Materyaller

  1. Distile su

  2. Agar

  3. Yeast Extract

  4. Şeker

  5. Propanoik asit

  6. Mısır Unu

  7. Süt şişesi

  8. Falkon tüpler

  9. Karıştırıcı

  10. Magnetik ısıtıcı

  11. Beher

  12. Tartı

  13. Tartım kabı

Method

  1. 600 ml distile su (dH2O) kaynatılır.

  2. Kaynayan suya 3,5 g Agar ve 2 g Yeast Extract eklenir.

  3. Topaklanma olmayacak şekilde aralıklarla karıştırılır.

  4. Homojen halde görülen bu karışıma 50g Mısır unu ve 50 g Şeker eklenir.

  5. Homojen dağılmasına dikkat edilerek 15 dakika boyunca kaynatılır.

  6. Kaynatma işlemi bittikten sonra besiyeri ortalama 5 dakika kadar soğutmaya alınır.

  7. Donmamasına dikkat edilerek son olarak içerisine 3,5 ml Propanoik asit eklenir ve karıştırılır.

  8. Hazırlanan besiyeri sıcakken besiyeri kaplarına koyulur. Besiyeri kaplarının kapağı steril pamuklarla kapatılır.

  9. Besiyeri şişesinin kenarlarındaki buharlar gittikten sonra, aynı genotipteki 10 dişi ve 10 erkek sinek kültür şişesine uygun bayıltma yöntemi kullanılarak eklenir.

NOT: Propanoik asit koyma işlemi çok hızlı yapılmalıdır. Kokusu kesinlikle solunmamalıdır.


Konu 11:

Bölüm 3: Virgin Dişi Seçimi ve Monohibrit Çaprazlama

Tarih




Çaprazlama Deneyleri

Organizmalar arasında yapılan döllenme çalışmalarına genetikte çaprazlama denir. Genotipleri farklı iki bireyin çaprazlanmasına hibridizasyon veya melezleme denir. Hibridizasyon sonucunda oluşan bireyler melez veya hibrid olarak adlandırılır. Melez bireyler ise içerdiği farklı gen çifti sayısına göre monohibrid, dihibrid, trihibrid vs. olarak adlandırılır [1].

Farklı mutant formlarından alınan çaprazlama için seçilen mutant formdan 3-5 virgin dişi seçilir. Başka bir mutant formundan alınan 1-2 günlük aynı sayıdaki genç erkek sinekle aynı kültür ortamına eşlenmeye bırakılır. Dişi sinekler çiftleşmeden sonra 1-2 gün içersinde yumurta bırakmaya başlarlar. 5 gün kadar sonra kültür ortamında larvalar görülmeye başlar. 7-8. günlerde pupa oluşumu başlar. Kültürde pupa görülmeye başladığı andan itibaren anne ve baba (P) uzaklaştırılır. Bu şekilde pupalardan yeni çıkan sinekler ile anne-babanın çiftleşmesi engellenmiş olur.

Monohibrit Çaprazlama

Tek gen kalıtımıdır. Monohibrit çaprazlama için yeni bir kültür ortamı hazırlığı yapılır. Bu kültür ortamına eşit sayıda erkek ve virgin dişi sinekler artarılır. Aktarılan bu ilk sinekler anne ve babadır (P).



Deneyin amacı

Henüz hiç çiftleşmemiş olan dişi meyve sineklerini seçebilmek, erkek ve dişi sinek ayrımı yapabilmek ve doğru bir şekilde çaprazlama başlatabilmektir.



Materyaller

  1. Kültür ortamı

  2. Eter veya buz

  3. Stok kültür

  4. Virgin dişi sinekler


Method

  1. Stok kültürlerden virgin dişiler elde edilir.

  2. Eşit sayıda virgin dişi ve genç erkekler yeni besiyerine aktarılır.

  3. İlk pupalar gözlendikten sonra anne ve baba uzaklaştırılır.

  4. Pupadan çıkan melez sinekler F1 dölleridir.

  5. F1 sinekleri yaklaşık 8 gün boyunca sayılır. Sayımda fenotipik özellikler dikkate alınarak erkek ve dişi ayrımı yapılır.

  6. İncelenilen ve sayılan sinekler bir daha kültür ortamına alınmaz. Gerekli uzaklaştırma işlemi yapılır.

  7. F1 sineklerinde eşit sayıda sinek alınıp yeni bir kültür ortamına F2 sinekleri oluşturulmak üzere ikinci bir çapraz oluşturulur. Bu çaprazlama kendileştirmedir.

  8. İlk pupalar çıktıktan sonra F1 sinekleri ortamdan uzaklaştırılır.

  9. Sonraki 8 gün boyunca çıkan tüm sinekler sayılır ve kayıt tutulur.



Konu 12:

Bölüm 4: Politen Kromozom Analizi

Tarih




Politen Kromozom Boyaması

Drosophila ve diğer diptera türlerinin larvalarının tükrük bezlerinde dev kromozomlar bulunur. Bu dev kromozomlara politen kromozom denir. Bu kromozomlar normal kromozomlardan yaklaşık 100-200 kat daha büyüktür. Boyandıkları zaman üzerlerinde eksene dikey konumda koyu renkli bölgeler yani bantlar gözlenir. Bu bantlar aynı soyun tüm bireylerinde aynıdır. Bir politen kromozomda sayısını çok fazla arttırmış iki homolog kromozom eşlenmiş durumda ve bir aradadır [1].

Drosophila melanogaster larvalarının tükrük bezlerinde görülen politen kromozomlar interfaz kromozomlarının ve özel yapılarının anlaşılmasında oldukça önemlidir. Bu kromozomlarda nispeten şişmiş ve kabarmış olarak gözlenen bölgeler puf bölgeleridir.

Puf bölgeleri kromozomların diğer bölümlerine göre daha çok RNA sentezinin gerçekleştiği aktif gen bölgeleridir. Politen kromozomlardaki puflaşma modeli, interfaz nukleusundaki gen aktivitesinin bir göstergesidir ve sitogenenetik methotlarla rahatlıkla incelenebilir [2].

Drosophilanın 3. İnstar larva döneminde pupalaşma aktivitesi çevre koşullarına göre değişiklik gösterir. Hormonal kontrol altında olan bu olay, geçici ve seri bir süreçtir. Örneğin, Artan sıcaklık koşulları puf oluşumunu arttırır.

http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/genetics/drosophila_chromosomes/drosophila_chromosome_jpegs/07_glands_dissected_out_p1222878.jpg

Şekil 1: Drosophila melanogaster Larvasının tükrük bezi

(http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/Genetics/Drosophila_chromosomes/Drosophila_Chromosomes.htm)



http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/genetics/drosophila_chromosomes/d.m._chromosome_images/dros_chromo_p1181203.jpg

Şekil 2: Politen Kromozom mikroskop görüntüsü

(http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/Genetics/Drosophila_chromosomes/Drosophila_Chromosomes.htm)

Politen kromozomlar tükrük bezi dışında malphigi tüpleri ve bağırsaklar gibi dokulardada bulunurlar. Bu dokular dikkat edilirse metabolik aktivitenin en yoğun olduğu dokulardır. Bu tür dokulara Politenik doku ismi verilir.

Politen Kromozomların Oluşumu

Kromatin iplikleri yavaş bir süreç içersinde DNA’nın replikasyonunu gerçekleştirir. Replikasyon sonucunda kromozomlar yapısal olarak eşleşirler. Fakat bu süreç sonunda mitoz bölünme gerçekleşmez. Bu olaya endomitoz denir. Sayıca çoğalan bu kromatin iplikleri bir araya gelerek birlikte paketlenirler. Bol preteinli bir matriks içersinde yerleşim gösteren bu kromozomlar zamanla politen kromozom yapısını oluştururlar.

Politen kromozomlar boyanma ile çeşitli bant tipleri oluşturur. Bu bant tiplerinden açık renkli olanlara interbant, koyu renkli olanlara bant denilmektedir.

Materyaller:


  • Lam ve Lamel

  • Diseksiyon iğnesi

  • Diseksiyon solüsyonu (Ringer Solüsyonu)

  • Fizyolojik su

  • Aseto-karmin boyası

Method

  • Araştırmaya elverişli olacak kromozomların elde edilmesi için iyi yetiştirilmiş bir larvanın seçilmesi gerekir.

  • Lam ve lamel çok iyi temizlenmiş olması gerekmektedir. Üzerinde tüy vb. hiçbir şey olmamalıdır.

  • Diseksiyon solüsyonunu pH’sının 7.0 ile 7.4 arasında olması gerekmektedir.



  1. Diseksiyon Solüsyonu Hazırlama

Sodyum Klorür (NaCl)…………………….6.5 g

Potasyum Klorür(KCl)…………………….0,25 g

Kalsiyum Klorür (CaCl2)………………….0,3 g

Sodyum bikarbonat(NA(CO3)2 ) …….0,2 g

Tüm maddeler bir beher içerisine koyulup, üzerine 1000 ml saf su ilave edilir. Maddeler çözüldükten sonra pH tayini yapılır.


  1. Fizyolojik su hazırlama

1000 ml saf suya 7 gram Sodyum klorür ilave edilerek hazırlanır.

  1. Aseto-karmin boyası

Kromozomları fikse eden boyadır. Bu boya aynı zamanda kromozomları boyar fakat sitoplazmayı boyamaz.

10 gr karmin 1 l %45 glasial asetik asit içerisinde çözülür. Kaynatılır. Ve filitreden geçirilir.



  1. Protokol



  1. 3. İnstar döneminden larva alınır.

  2. % 0,7’lik NaCl koyulmuş lam üzerine alınır.

  3. Larvanın ağız parçaları bulıunan bölgesi kesilir.

  4. Tükrük bezi çıkarılır.

  5. Hemen Asetokarmin boyası koyulur.

  6. 3 dk muamele edilir.

  7. Lamel kapatılır.

  8. Silgi ucu ile hafif darbelerle vurulur. (Ezme Preparat hazırlama yöntemi)

  9. Mikroskopta incelenenlenir.

Konu 13:

Bitki Kromozomlarının İncelenmesi

Tarih




Karyotype of Hordeum vulgare (2n=14)

In this week’s lab, we will expand on last weeks procedure by characterizing the chromosomes or karyotype of barley. Essential to the lab report is a good drawing with a scale added for measuring the length of the chromosomes (karyogram), including the exact location of the centromere and any secondary constrictions. These measurements and ratios will be used to pair the chromosomes and prepare an idiogram (a diagramatic sketch or interpretive drawing) of barley.

The protocols are essentially the same as in lab one, but we will switch to Feulgen stain, which is specific for the chromosomes only. Feulgen stain is a bit more tricky to work with than aceto-carmine. Feulgen stains everything it comes into contact with purple, has a limited shelf life and if it contaminates the ethanol storage solution or the HCl it will make future staining of the chromosomes impossible.



Procedure

Pre-treatment: Clean barley seed is placed on moistened filter paper in the dark until roots emerge and are 2 cm long. Root tips are harvested and placed in ice water overnight at 4oC.

Fixation: Farmers solution at 4oC overnight.

Storage: 70% ethanol at 4oC.

Hydrolysis: Transfer the root tips to 1N HCL at 60oC for 6-8 minutes. Rinse the root tips with distilled water and transfer to a clean vial.

Staining: Add the Feulgen stain and place the root tips in the dark. Staining will take between 10-20 minutes. Be sure to keep any tweezers that have come in contact with the stain separate or clean with Comet and rinse thoroughly. The chlorine in the cleaner will deactivate the stain.

Once the root tips have stained dark purple excise the tip and place in a drop of 45% acetic acid on a slide. Macerate carefully and apply a cover slip. Feulgen stain will fade over time so be sure to place your remaining root tips back in the dark. Check your slide carefully for a good metaphase cell. Remember the more detail at 40X the easier it will be to draw and therefore measure at 100X.



Drawing: After finding the appropriate metaphase cell, draw the chromosomes as carefully as you can. Take care to note the exact location of the centromere, the satellite length and the location of the end of each arm. Without changing the camera lucida, carefully remove your slide and replace it with the micrometry slide. Find the lines in the centre of the circle and focus under oil at 100X as you did with your drawing. Carefully add the scale below your drawing. Draw vertical lines below your drawing spaced as they are on the slide, the space between two lines represents 10 microns. Use this scale by converting it to mm and measure your chromosomes and then convert back to microns for the final report. Include in your report this drawing with the scale, a table showing the measurements and pairing and the karyotype represented as an idiogram. The idiogram is drawn longest to shortest chromosome. The labeling on your original drawing should also represent your pairing ie. change the original labels to represent the pairing you have made through the measurements and ratios.

Referans: http://home.cc.umanitoba.ca/~frist/PLNT3140/lab/CytoLabManual.pdf




Konu 14:

Soru Çözümleri

Tarih




Kalıtımla İlgili Problem Çözümü 1

  1. İnsanda kahverengi göz rengi geni, mavi göz rengi genine ve sağ eli kullanma yeteneği, sol eli kullanma yeteneğine dominanttır.

Kahverengi gözlü solak olmayan bir erkek ve mavi gözlü solak olmayan bir bayan evleniyor. İlk çocukları mavi gözlü ve solak oluyor. Bu çiftin diğer çocuklarının bu karakterler bakımından fenotip ve genotip oranları nasıl olur?

  1. Drosophila melanogaster ile yapılan çalışmalarda vücut rengi gri olan sinekler ile siyah olan sinekler çaprazlanıyor. F1 dölü kendileştirildiğinde 380 gri renkli ve 116 siyah renkli sinek oluşuyor. Buna göre

  1. Bu hayvanlarda baskın olan vücut rengi hangisidir?

  2. F1 dölünün dişileri gri renkli erkek sineklerle çaprazlandığında oluşan döllerdeki genotip ve fenotip oranları nasıl olur?



  1. Kobaylarda tüylerin düzgün olmamasına sebep olan gen R, tüylerin düzgün olmasına yol açan gen ise r olarak gösteriliyor. Siyah olması S, beyaz olması ise s ile gösteriliyor.

Homozigot düzgün olmayan siyah renkli kobaylar ile düzgün ve beyaz tüylü kobaylar çaprazlanıyor.

  1. F1 ve F2 döllerinin fenotipleri nasıl olur?

  2. F1’in bir bireyi ile tüyleri düzgün olmayan siyah renkli ebebeyin ile geri çaprazlanırsa nasıl bireyler ortaya çıkar?

  3. F1 dölünün bir bireyi düzgün tüylü beyaz renkli olan ebebeyn ile çaprazlanırsa nasıl bireyler ortaya çıkar?



  1. Düzgün (D) ve buruşuk (d) taneli bitkiler çaprazlanıyor. F1’in tamamı düzgün taneli oluştuğu gözleniyor. F1 kendileştirildiğinde 321 düzgün, 116 buruşuk taneli bitki meydana geliyor. Çaprazlamayı gözterip sonucu khi-kare testi ile kontrol ediniz.



  1. Uzun kanat ve kahverengi vücut renginin dominant özellikler olduğu meyve sineğinde, kısa kanatlı-kahverengi sinekler ve uzun kanatlı-siyah renkli sineklerin saf soyları arasında yapacağınız bir çaprazlamayı;

a) Anne- babanın genotipi nasıldır?

b) Anne- babanın ürettiği gametler nasıldır?

c) F1 ve F2 döllerinde meydana gelebilecek genotipler ve fenotipler nelerdir?

d) Punnett karesi yöntemi ile gösteriniz.



  1. Sadece iki fenotipik kategori varsayılırsa, aşağıdaki tabloda bulunan birey sayılarına göre;



  1. Khi-kare değerini bulunuz.

  2. Khi-kare testi sonucuna göre gözlenen karekterin Mendel yasalarına uygun olup olmadığı açıklayınız.



  1. Aşağıdakilerden hangisi bir test çaprazlamasıdır?

a. AAbb x AaBb

b. AaBB x AaBb

c. AAbb x AABb

d. AaBb x aabb

e. aaBB x aaBb


  1. Farelerde siyah kıl (S) rengi kahverengiye (s) ve kısa kıllılık (K) uzun kıllılık (k) üzerine dominanttır. F1 dölünde meydana gelen siyah-kısa kıllı fareler test çaprazlama yapıldığında 1/4 oranında dört farklı fenotip ve genotipe sahip fareler elde ediliyor. Bunun nedenini F1 bireyinin genotipi açısından değerlendiriniz.



  1. Bezelyelerde gövde uzunluğu (U) bodur gövdeye (u) dominanttır. Yapılan bir monohibrit çaprazlama sonucu toplam 50 bitkiden 30 uzun 20 bodur olarak gözleniyor. Bu karakterlerin basitçe kalıtıldığına varsayılıyor. Bunun doğru olup olmadığını yani Mendel yasalarındaki beklenen sonuçlara uyup uymadığını Khi-kare testi uygulayarak gösteriniz.



  1. Bir Drosophila kültürü ile deney yapıyorsunuz. Elinizde kahverengi kanatsız 5 dişi sinek ve normal kanatlı siyah vücutlu 3 erkek sineğiniz var. Bunları çaprazlamanız isteniyor.

F1 döllerinin hepsi normal kanatlı ve kahverengi vücutlu olduğunu gözlemliyorsunuz.

İlgili özelliklerin eşey kromozomlarında taşınmadığını biliyorsunuz.

a)P generasyonunun genotipi nedir?

b)F1 generasyonunun genotipi nedir?



Kaynaklar

[1] http://www.nature.com/scitable/content/eukaryotic-chromosomes-exist-in-four-major-types-46127

[2] Güler Temizkan, Genetik, I. Temel Genetik, 2010

[3] http://www.nirs.go.jp/ENG/core/rem/rem02_1.shtml



[4]Scott F Gilbert,“Early Drosophila Development”, Developmental Biology, 6th edition, Chapter 9, 2000

[5] Savraj S. Grewal, Controlling animal growth and body size – does fruit fly physiology point the way?, 2012

[6] Maintenance of a Drosophila Laboratory: General Procedures, Michael Ashburner and John Roote,  “Laboratory Culture of Drosophila,” Chapter 35,

[7] Karyotip Şekilleri http://www.biologycorner.com/worksheets/Chromosomestudy.htm adresinden alınmıştır.



https://s-media-cache-ak0.pinimg.com/564x/17/8e/57/178e57bd2ca527b469c754cb1c3be50b.jpg



Dostları ilə paylaş:
Orklarla döyüş:

Google Play'də əldə edin


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©muhaz.org 2017
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə