Une offre variétale pour les systèmes de culture de demain coût total du projet
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PROJET INTITULE: RESAUBER Gestion durable des résistances génétiques à R. solanacearum chez l’aubergine (Solanum melongena) En réponse à l'appel à projets 2013 CASDAR « Semences et sélection végétale » : Une offre variétale pour les systèmes de culture de demain
ORGANISME CHEF DE FILE : Nom : CIRAD UMR PVBMT Adresse : Cirad, Pôle de Protection des Plantes, 7 chemin de l’ IRAT, 97410 Saint-Pierre, Ile de la Réunion Téléphone/Fax : 0262 49 92 00/0262 49 92 93 Mail (où sera adressée la liste des lauréats) : bernard.reynaud@cirad.fr CHEF DE PROJET :
Nom, Prénom : DINTINGER Jacques Organisme employeur : CIRAD Adresse : Pôle de Protection des Plantes, 7 chemin de l’ IRAT, 97410 Saint-Pierre, Ile de la Réunion Téléphone/fax : 0262 49 92 21/0262 49 92 93 Mail : jacques.dintinger@cirad.fr
La rédaction de cette partie doit s’appuyer sur les recommandations formulées par le Comité scientifique du Comité Technique Permanent de la Sélection des plantes cultivées figurant dans le présent appel à propositions.
Le flétrissement bactérien, provoqué par la bétaprotéobactérie tellurique R. solanacearum, constitue l’une des phytobactérioses majeures affectant les Solanacées maraîchères (tomate, aubergine, piment) et la pomme de terre dans toute la ceinture tropicale et subtropicale, dans les zones de plaine comme celles d’altitude au climat plus frais. Cette maladie affecte indistinctement les cultures intensives destinées à l’export comme les petits paysannats dans toute l’Afrique, l’Amérique Centrale et du Sud, le sous-continent Indien et l’Asie du Sud-Est. Il s’agit d’une maladie émergente dans certaines zones du globe (Europe, Caraïbes et Amérique du Nord pour certaines souches), et sans doute appelée à s’étendre dans les régions tempérées du fait des changements globaux. Après la tomate, l’aubergine est la culture la plus concernée par cette maladie. En zone tropicale, des cultivars résistants sont utilisés avec un succès limité et variable (Singh and Gopalkrishnan 1998), compte tenu des fortes interactions entre les résistances et les souches bactériennes. R. solanacearum est considérée comme un complexe d’espèces constitué de 4 phylotypes, d’origines géographiques différentes : Afrique de l’Est-Asie pour le phylotype I, Amérique latine pour le phylotype II, Afrique centrale et de l’Ouest pour le phylotype III, Indonésie pour le phylotype IV (Wicker et al. 2012b). Le phylotype I est le groupe le plus répandu en zone tropicale (Asie, Afrique et Océan Indien, Amérique centrale et du Sud), suivi du IIA. Le phylotype IIB, et plus spécifiquement les souches dites « froides » (IIB-clade 5 sequevar 1, anciennement race3/biovar 2), émerge depuis quelques décennies en zone tempérée (Amérique du Nord, Europe et pourtour méditerranéen). Les souches affectant les Solanacées maraîchères sont réparties dans les 4 phylotypes. Endémique dans les départements et territoires d’outre-mer français (Antilles, Guyane, Réunion et Mayotte, Nouvelle Calédonie), R. solanacearum menace également aujourd’hui le territoire métropolitain et l’Europe continentale, particulièrement en cultures sous abri. Une souche du groupe « émergent » (phylotype IIB/clade 4, sequevar 4NPB) décrit originellement en Martinique (Wicker et al. 2007), a ainsi été identifiée dans une épidémie de flétrissement bactérien sur tomate, survenue en 2001 dans le Sud-Est de la France. Ce groupe « émergent » est d’ailleurs capable de provoquer la maladie en conditions tempérées (Bocsanczy et al. 2012), tout comme le groupe « Brown Rot » (phylotype IIB-clade5, sequevar 1). Du fait du changement climatique, il faut anticiper la probable remontée depuis l’Europe du Sud - Italie (Loreti et al. 2008), Espagne (Palomo Gomez and Garcia Benavides 2006), Portugal (Cruz et al. 2008) - de souches tropicales qui provoqueront à terme des épidémies dans les cultures maraîchères métropolitaines. Il est indispensable que les sélectionneurs prennent en compte ce risque, et disposent de matériel végétal adapté. La sélection variétale pour la résistance des Solanacées au flétrissement bactérien a jusqu’ici essentiellement porté sur la tomate (Daunay et al. 2010; Wang et al. 1998), plus secondairement le piment (Lafortune et al. 2005; Lopes et al. 2006). La résistance de l’aubergine au flétrissement bactérien a été peu étudiée, malgré l’identification de facteurs de résistance majeurs dans des accessions asiatiques (Cao et al. 2009; Fukuoka et al. 2010; Nunome et al. 2009; Nunome et al. 1998). Le déploiement à l’échelle mondiale de variétés résistantes s’est très vite révélé impossible, de par l’existence de fortes interactions génotype-milieu, et surtout du fait de l’exceptionnelle plasticité génomique et phénotypique de R. solanacearum. Des travaux récents du CIRAD à la Réunion ont abouti à la caractérisation des principales sources de résistance au flétrissement bactérien chez les Solanacées à graines (tomate, aubergine et piment), vis-à-vis d’une core-collection de R. solanacearum représentant l’essentiel de la diversité du pathogène dans le monde (Lebeau et al. 2011). Il apparaît ainsi que les interactions Solanacées x R. solanacearum peuvent être formalisées en 6 « pathoprofils ». Des résistances de haut niveau n’ont été identifiées que chez l’aubergine (plusieurs cas de résistance totale), la tomate étant caractérisée par des phénotypes de résistance quantitative et partielle et le piment plutôt par des phénotypes de tolérance (infections sans symptômes). Parmi les accessions d’aubergine identifiées comme résistantes, l’une d’entre elles, ‘AG91-25’ (Ano et al. 1991), a fait l’objet d’une étude approfondie du déterminisme génétique de la résistance. Un gène majeur, Ers-1, probablement originaire de S. aethiopicum, contrôle une résistance de haut niveau vis-à-vis de plusieurs souches du phylotype I (Lebeau 2010; Lebeau et al. 2013). Il s’agit du premier gène majeur de résistance à R. solanacearum identifié chez une espèce cultivée, ainsi que le premier gène de résistance à une maladie cartographié chez l’aubergine. Ce gène a un intérêt majeur pour la création variétale chez les solanacées. Le seul gène majeur de résistance à R. solanacearum identifié à ce jour (RRS1-R) provient d’Arabidopsis thaliana. ERs1 est potentiellement transférable dans d’autres variétés d’aubergine, et pourra servir à la recherche d’homologues chez la tomate et d’autres Solanacées. Un programme de transfert de ce gène dans des variétés d’aubergine locales, en combinaison avec d’autres gènes/QTL de résistance, est actuellement en cours à l’île de la Réunion (collaboration CIRAD/ARMEFLHOR). Le déploiement à grande échelle de ce gène de résistance dans les programmes d’amélioration génétique de l’aubergine, et la gestion de la durabilité de ce gène, impliquent cependant d’approfondir au préalable plusieurs points :
La résistance des plantes aux bioagresseurs comporte 3 composantes principales (Palloix et al. 2009) : (i) le niveau, ou l’efficacité (résistance partielle vs. résistance totale), (ii) le spectre ou spécificité (race-spécifique vs. non spécifique), et (iii) la durabilité, définie comme la durée de vie de la résistance jusqu’à ce que la fréquence de variants virulents dépasse celle de variants avirulents. Plusieurs estimateurs de durabilité ont été proposés dans la littérature internationale et sont principalement basés sur la dynamique évolutive de l’agent pathogène. Une résistance est d’autant plus durable que son contournement (acquisition de virulence) induit une forte perte de fitness des génotypes virulents (Leach et al. 2001). Or un certain nombre d’effecteurs bactériens d’avirulence (avérés ou putatifs) contribuent à la fitness bactérienne (Ponciano et al. 2003), y compris chez R. solanacearum (Macho et al. 2010). Estimer la conservation et le taux de sélection sur ces effecteurs d’avirulence peut permettre de prédire la durabilité de la résistance : un effecteur très conservé sera très probablement essentiel à la survie de la bactérie. Par ailleurs, prédire la durabilité d’une résistance et l’améliorer éventuellement, implique d’abord de prédire le potentiel évolutif des agents pathogènes. Parmi les paramètres définissant ce potentiel évolutif, il a été montré que ce sont le taux de mutation et les flux de gènes (mesure indirecte de la dispersion) qui contribuent significativement au risque observé de contournement (Mc Donald and Linde 2002). L’appréciation des capacités réelles de dispersion du pathogène est donc primordiale pour prédire la durabilité d’une source de résistance.
Les actions envisagées visent à acquérir les connaissances nécessaires d’une part à l’utilisation optimale de la résistance de l’aubergine AG91-25, et d’autre part au pyramidage futur de facteurs génétiques de résistance complémentaires ; ceci en nous appuyant sur un réseau multilocal de partenaires dans l’outre-mer français (Guyane, Réunion) et en Afrique (Cameroun). Notre équipe de recherche dispose d’une collection unique au monde de plus de 2000 souches de R. solanacearum, de données d’hybridation (Comparative Genomic Hybridization ou CGH) de 66 souches sur une puce pangénomique (Guidot et al. 2009), de données phénotypiques (avirulence/virulence) sur aubergine, tomate et piment (coreTEP) (Lebeau et al. 2011) sur une quarantaine de souches. Nous disposons également de plusieurs génomes bactériens séquencés dans les 4 phylotypes (Li et al. 2011; Remenant et al. 2010; Remenant et al. 2011), qui nous ont permis d’identifier des loci minisatellites (MLVA) adaptés au suivi d’épidémies. Ces marqueurs nous ont ainsi permis de tracer des complexes clonaux hautement virulents en Côte d’Ivoire (N'Guessan 2013; N'Guessan et al. 2012; N'Guessan et al. 2013). La variabilité des situations épidémiologiques rencontrées sera quantifiée par le génotypage des populations pathogènes par MLSA et MLVA, et la définition des « pathoprofils » présents sur chaque site partenaire, en se basant sur les résultats du comportement d’une core-collection d’accessions résistantes (ACTION 1). L’étude du spectre d’action du gène majeur Ers-1 devra être d’abord complétée par des tests de résistance menés avec inoculation contrôlée de souches représentant les phylotypes IIA, IIB et III (ACTION 2). Pour anticiper le possible contournement du gène majeur ERs1, la diversité des sources de résistance à R. solanacearum chez l’aubergine et leur complémentarité sera explorée en testant les générations F1, F2 et backcross issues de croisements entre des accessions résistantes prometteuses et une accession sensible, cela en conditions d’inoculation contrôlée. Une première analyse sur ce matériel permettra d’établir les spectres d’efficacité des différentes sources de résistance, et de cibler les accessions les plus intéressantes susceptibles de porter d’autres facteurs majeurs de résistance qui pourraient être combinés avec Ers-1 dans un programme de sélection. Des populations d’haploïdes doublés seront produites en vue d’études de cartographie génétique dans ces autres fonds génétiques. Le génotypage de ces descendances ainsi que la densification de la carte actuelle MM738 (S) x AG91-25 (R) en vue du clonage du gène majeur ERs1, feront l’objet d’un projet spécifique mené en parallèle. Pour évaluer, et à terme prédire, la durabilité des résistances présentes chez l’aubergine, nous proposons de : (i) caractériser la dynamique évolutive d’une population parcellaire de R. solanacearum sous pression de sélection exercée par le gène ERs1 (ii) évaluer les contraintes évolutives portant sur les facteurs génétiques bactériens associés à la virulence/avirulence sur aubergine, en ciblant les effecteurs de type III, protéines injectées directement dans la cellule végétale (ACTION 3). L’impact de la résistance d’AG91-25 sur la structuration génétique parcellaire du pathogène sera suivi grâce à la mise en place de cycles successifs de 3 mois de culture d’AG91-25 sur une parcelle naturellement infestée par des souches de phylotype I. Grâce aux marqueurs VNTR développés sur phylotype I (N’Guessan et al (2013) ; stage A. Latreille 2013), les populations évoluant sous pression de sélection exercée par la résistance de AG91-25 seront comparées à celle infestant le témoin sensible MM738. Ce dispositif expérimental permettra de caractériser la dynamique spatiale du pathogène (diffusion plante à plante, différenciation rhizosphère/tige, présence de hot spots de diversité) et de mesurer l’impact de la résistance de AG91-25 (ERs1 et QTLs mineurs) sur cette dynamique de colonisation. Les éventuels variants virulents apparus sur le dispositif seront génotypés par marqueurs neutres, et sur leur contenu en effecteurs d’avirulence afin de détecter d’éventuelles variations alléliques. Leurs traits d’histoire de vie (vitesse de croissance, charge bactérienne in planta, taux de transmission aux plantes voisines) seront également comparés à ceux d’isolats avirulents par des tests en conditions contrôlées. Les données de CGH nous ont permis d’identifier 27 effecteurs de type III plus ou moins fortement associés à l’avirulence ou virulence sur les accessions résistantes d’aubergine AG91-25, Dingras multiple purple, SM-6, Surya et de tomate Hawaii7996. Une dizaine d’effecteurs sont hautement associés à l’avirulence ou à la virulence sur les aubergines résistantes (stage F. PENSEC, 2010). Parmi eux le gène popP2 (déjà connu comme gène d’avirulence sur Arabidopsis) est très hautement associé à l’avirulence sur AG91-25, évoquant un cas unique de relation gène-pour-gène chez R. solanacearum ; il est aussi fortement associé à la fitness sur aubergine. Il est donc envisagé de comparer les distributions d’effecteurs dans une collection mondiale de R. solanacearum, intégrant des souches déjà phénotypées sur AG91-25, afin de repérer le polymorphisme d’insertion/délétion, et la variabilité allélique sur chaque effecteur. L’implication de ces différents allèles dans l’avirulence sur AG91-25 sera ensuite validée par deux approches de génétique fonctionnelle : l’expression transitoire dans un clone agro-infectieux (l’effecteur/allèle d’effecteur provoque-t-il une réaction hypersensible ?), et la mutagénèse dirigée (l’effecteur/allèle d’effecteur provoque-t-il l’avirulence ?).
Publications des équipes partenaires du projet Carmeille A, Caranta C, Dintinger J, Prior P, Luisetti J, Besse P (2006). Identification of QTLs for R.solanacearum race 3-phylotype I resistance in tomato. Theor Appl Genet 113:110-121 Daunay MC, Laterrot H, Scott JW, Hanson P, Wang J-F (2010) Tomato resistance to bacterial wilt caused by Ralstonia solanaearum E.F. Smith: ancestry and peculiarities. Tomato Genetics Cooperative Report 60:6-40 Guidot A, Coupat B, Fall S, Prior P, Bertolla F (2009) Horizontal gene transfer between R.solanacearum strains detected by comparative genomic hybridization on microarrays. ISME Journal 3:549-562 Lebeau A (2010) Résistance de la tomate, l’aubergine et le piment à R.solanacearum : interactions entre les géniteurs de résistance et la diversité bactérienne, caractérisation et cartographie des facteurs génétiques impliqués chez l'aubergine. Faculté des Sciences et Technologies. Université de la Réunion, Saint Denis de la Réunion Lebeau A, Daunay MC, Frary A, Palloix A, Wang JF, Dintinger J, Chiroleu F, Wicker E, Prior P (2011) Bacterial wilt resistance in tomato, pepper, and eggplant: genetic resources respond to diverse strains in the R.solanacearum species complex. Phytopathology 101:154-165 Lebeau A, Gouy M, Daunay M, Wicker E, Chiroleu F, Prior P, Frary A, Dintinger J (2013) Genetic mapping of a major dominant gene for resistance to R.solanacearum in eggplant. Theoretical and Applied Genetics 126:143-158 N'Guessan AC (2013) Phylogénie, structure génétique et diversité de virulence de R.solanacearum, agent du flétrissement bactérien, en Côte d'Ivoire. UFR BioSciences. Université de Cocody-Abidjan, Abidjan, p 217 N'Guessan CA, Abo K, Fondio L, Chiroleu F, Lebeau A, Poussier S, Wicker E, Kone D (2012) So near and yet so far: the specific case of R.solanacearum populations from Côte d'Ivoire in Africa. Phytopathology 102:733-740 N'Guessan CA, Brisse S, Le Roux-Nio A-C, Poussier S, Koné D, Wicker E (2013) Development of variable number of tandem repeats typing schemes for R.solanacearum, the agent of bacterial wilt, banana Moko disease and potato brown rot. Journal of Microbiological Methods 92: 366-374 Poueymiro M, Genin S (2009) Secreted proteins from R.solanacearum: a hundred tricks to kill a plant. Current Opinion in Microbiology 12:44-52 Remenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, Cellier G, Wicker E, Allen C, Fegan M, Pruvost O, Elbaz M, Calteau A, Salvignol G, Mornico D, Mangenot S, Barbe V, Medigue C, Prior P (2010) Genomes of three tomato pathogens within the R.solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence. BMC Genomics 11:1-16 Remenant B, de Cambiaire JC, Cellier G, Jacobs JM, Mangenot S, Barbe V, Lajus A, Vallenet D, Medigue C, Fegan M, Allen C, Prior P (2011) The genomes of the insect-transmitted plant pathogens Ralstonia syzygii and Blood Disease Bacterium reveal a recent evolutionary origin within the R. solanacearum species. PLoS One 6:e24356 Remigi P, Anisimova M, Guidot A, Genin S, Peeters N (2011) Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to R.solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist 192:976-987 Wicker E, Grassart L, Coranson-Beaudu R, Mian D, Guilbaud C, Fegan M, Prior P (2007) R.solanacearum strains from Martinique (French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73:6790-6801 Wicker E, Lebeau A, Pensec F, Daunay M-C, Dintinger J (2012a) New insights on virulence and evolutionary dynamics of the R.solanacearum species complex - keys and challenges in the search of durable resistance in Solanaceae. Plant Resistance Sustainability International Conference. INRA, La Colle-sur-Loup, France, p 68 Wicker E, Lefeuvre P, Cambiaire JCd, Lemaire C, Poussier S, Prior P (2012b) Contrasting recombination patterns and demographic histories of the plant pathogen R.solanacearum inferred from MLSA. ISME Journal 6:961-974 Wroblewski T, Caldwell KS, Piskurewicz U, Cavanaugh KA, Xu H, Kozik A, Ochoa O, Mc Hale LK, Lahre K, Jelenska J, Castillo JA, Blumenthal D, Vinatzer BA, Greenberg JT, Michelmore RW (2009) Comparative large-scale analysis of interactions between sveral crop species and the effector repertoires from multiple pathovars of Pseudomonas and Ralstonia. Plant Physiology 150:1733-1749
Bocsanczy AM, Achenbach UC, Mangravita-Novo A, Yuen J, Norman DJ (2012) Comparative effect of low temperature on virulence and twitching motility of R.solanacearum strains present in Florida. Phytopathology 102:185-194 Cao B-H, Lei J-J, Wang Y, Chen G-J (2009) Inheritance and identification of SCAR marker linked to bacterial-wilt resistance in eggplant. African Journal of Biotechnology 8:5201-5207 Coupat-Goutaland B, Bernillon D, Guidot A, Prior P, Nesme X, Bertolla F (2011) R.solanacearum virulence increased following large interstrain gene transfers by natural transformation. Molecular plant-microbe interactions 24:497-505 Cruz L, Eloy M, Quirino F, Carrinho H (2008) R.solanacearum biovar 1 associated with a new outbreak of potato brown rot in Portugal. 21 ref 47:87-91 Deslandes L, Olivier J, Theulières F, Hirsch J, Feng DX, Bittner-Eddy P, Beynon J, Marco Y (2002). Resistance to R.solanacearum in Arabidopsis thaliana is conferred by the recessive RRS1-R gene, a member of a novel family of resistance genes. Proc Natl Acad Sci USA 99:2404-2409. Deslandes L, Olivier J,Peeters N, Feng DX, Khon-Lotham M, Boucher C, Somssich I, Genin S, Marco Y (2003). Physical interaction between RRS1-R, a protein conferring resistance to bacterial wilt and PopP, a type III effector targeted to the plant nucleus; Proc Natl Acad Sci USA 100:8024-8029. Doganlar S, Frary A, Daunay MC, Lester RN, Tanksley S (2002). A comparative genetic linkage map of eggplant (Solanum melongena) and its implication for genome evolution in the Solanaceae; genetics 161:1697-1711 lbaz M, Kodja H, Luisetti J (2005) Plant host is inducing diversity within R.solanacearum strains. Acta Horticulturae:137-144 Lafortune D, Beramis M, Daubeze A, Boissot N, Palloix A (2005) Partial resistance of pepper to bacterial wilt is oligogenic and stable under tropical conditions. Plant Disease 89:501-506 Leach JE, Vera Cruz CM, Bai J, Leung H (2001) Pathogen fitness penalty as a predictor of durability of disease resistance genes. Annual Review of Phytopathology 39:187-224 Li M, Wang Y, Tian S, Luao Z, Wang X (2006). Genetic analysis of resistance to bacterial wilt and identification of an associated AFLP marker in eggplant (Solanum melongena). Actu Horticulturae Sinica 33:869-872. Macho AP, Guidot A, Barberis P, Beuzcon CR, Genin S (2010) A Competitive Index Assay Identifies Several R.solanacearum Type III Effector Mutant Strains with Reduced Fitness in Host Plants. Molecular plant-microbe interactions : MPMI 23:1197-1205 Mc Donald BA, Linde C (2002) Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance. Annual Review of Phytopathology 40:349-379 Nunome T, Negoro S, Kono I, Kanamori H, Miyatake K, Yamaguchi H, Ohyama A, Fukuoka H (2009) Development of SSR markers derived from SSR-enriched genomic library of eggplant (Solanum melongena L.). Theoretical and Applied Genetics 119:1143-1153 Nunome T, Yoshida T, Hirai M (1998) Genetic linkage map of eggplant (Solanum melongena L.). In: Palloix A, Daunay M-C (eds) Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding on Capsicum and Eggplant. INRA Editions, Paris, pp 239-242 Palloix A, Aymé V, Moury B (2009) Durability of plant major resistance genes to pathogens depends on the genetic background, experimental evidence and consequences for breeding strategies. New Phytologist 183:190-199 Ponciano G, Ishihara H, Tsuyumu S, Leach JE (2003) Bacterial effectors in plant disease and defense: keys to durable resistance ? Plant Disease 87:1272-1282 Singh PK, Gopalkrishnan TR (1998) Evaluation of brinjal genotypes for yield and bacterial wilt resistance. Journal of Applied Biology 8:70-74. Sun B, Liao Y, Li Z, Sun G (2008). AFLP markers linked to genes related to bacterial wilt resistance of eggplant. Mol Plant Breed 6:929-934. Wang J-F, Hanson P, Barnes JA (1998) Worlwide evaluation of an international set of resistant sources to bacterial wilt in tomato. In: Prior P, Allen C, Elphinstone JG (eds) Bacterial wilt disease - Molecular and ecological aspects. Springer-Verlag, Berlin, pp 269-275 Wang JF, Ho Fl, Truong HT, Huang SM, Balatero CH, Dittapongpitch V, Hidayati N (2012). Identification of major QTLs associated with stable resistance of tomato cultivar ‘Hawaii 7996’ to R.solanacearum. Euphytica DOI. 1007/s10681-012-0830-x. Wu FN, Eanneta NT, Xu YM, Tanksley S (2009). A detailed synteny map of the eggplant genome based on conseerved ortholog set II (COS II) markers. Theor Appl Genet 118:927-935.
Concernant R. solanacearum, les mécanismes d’interaction moléculaire plante-pathogène ont fait l’objet de travaux principalement sur des espèces modèles (Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula). Ce projet a pour objectif d’utiliser les effecteurs de type III comme estimateurs de la durabilité d’un premier gène majeur de résistance identifié dans une espèce cultivée. Ce projet constitue par ailleurs la première opportunité d’étudier la durabilité d’un gène majeur de résistance à une bactérie en conditions agronomiques, et de valider l’existence d’une ou des interactions gène-pour-gène sur ce modèle. Notre collection mondiale de plus de 2000 souches, rassemblant l’essentiel de la variabilité mondiale du pathogène, est un atout essentiel pour constituer une core-collection représentative permettant de tester le spectre d’efficacité de différentes accessions résistantes d’aubergine. L’approche choisie d’évolution expérimentale in natura va permettre de caractériser l’impact d’une résistance variétale de haut niveau sur l’évolution des populations, pour, à terme, décomposer les effets de cette résistance sur les différents traits d’histoire de vie du pathogène. Elle permettra également d’évaluer la réelle capacité d’évolution des effecteurs bactériens sous pression de sélection d’AG91-25 ; ces variations pourront être transformées en marqueurs de suivi de virulence par les sélectionneurs.
ACTION 1 : Typologie des situations épidémiologiques sur les sites partenaires La variabilité ente les différents sites partenaires sera évaluée, en terme (i) de composition des populations pathogènes présentes, (ii) de profils de virulence présents (pathoprofils). La répartition géographique des sites partenaires est d’autant plus intéressante qu’elle englobe la majorité de la diversité phylogénétique du pathogène : phylotype I, IIA, IIB et III d’Afrique (TECHNISEM) et de l’Océan Indien (CIRAD Réunion et ARMEFLHOR), phylotype I et IIB « émergent » en Guyane (CIRAD UR 106). Les méthodologies employées s’appuient sur l’expérience acquise lors du projet INRA-CIRAD-Consortium semenciers «Résistance des solanacées à graines à R.solanacearum » (2007-2010). Six pathoprofils (a à f) avaient été identifiés chez R. solanacearum (Lebeau et al. 2011) ; les principaux profils de résistance identifiés (phénoprofils) ont aussi permis de définir une gamme différentielle restreinte de 12 accessions de 3 espèces (tomate, aubergine, piment), appelée coreTEP2 (Lebeau 2010), utilisée depuis pour typer les populations ivoiriennes de R.solanacearum (N'Guessan et al. 2012). Cette action se déclinera en 3 grandes tâches : Tâche 1.1. : Production de matériel végétal Les graines de la coreTEP2 (aubergines Dingras Multiple Purple, SM-6, Ceylan, Surya, AG91-25, Florida Market ; tomates, NC72, IRAT L3, HW7996, R3034, L390 ; piments Yolo Wonder et PM659) vont être multipliées, et distribuées à chaque partenaire. Tâche 1.2. : Phénotypage multilocal Chaque partenaire implantera la coreTEP2 sur son principal site d’expérimentation, selon un dispositif en blocs randomisés. Ce site devra avoir été géoréférencé par GPS. Les niveaux de résistance seront évalués par suivi de l’évolution de l’incidence de la maladie sur chaque accession, et détection des infections latentes en fin d’essai.
Chaque partenaire engagé dans les actions de phénotypage fournira un lot de souches provenant de sa station expérimentale, i.e. sa/ses souches de travail, mais également des souches échantillonnées sur la parcelle de test de la coreTEP2. Les lots de souches seront génotypés au Pôle de Protection des Plantes (3P) de la Réunion au 3P (multiplex-PCR, séquençage de gènes de ménage) afin de déterminer leur phylotype, leur clade et séquévar. Action 2. Spécificité de la résistance d’AG91-25 (gène majeur Ers-1) et recherche de facteurs de résistance complémentaires dans la diversité génétique de l’aubergine Le contrôle spécifique de la résistance par Ers-1 a pour l’instant été établi seulement vis-à-vis de souches du phylotype I (CMR134, PSS366, GMI1000, PSS4, To10). Les deux objectifs de cette action sont maintenant (i) de préciser l’efficacité et le spectre d’action de ce gène vis-à-vis de souches appartenant aux phylotypes II et III, et (ii), d’identifier et phénotyper des facteurs de résistance complémentaires. Des tests de résistance menés à la Réunion sur une core-collection d’aubergines ont montré la présence de résistances à spectre large prometteuses, notamment chez certaines accessions d’origine indienne : Dingras multiple purple (E1), SM-6 (E2), Ceylan (E3), Surya (E4) et Terong Bulat Hijau (E9) (Lebeau et al. 2011; N'Guessan et al. 2012). Des tests en conditions d’inoculation contrôlée des générations F1, F2 et backcross dérivant de ces lignées permettront d’identifier la présence de nouveaux gènes/QTLs majeurs. La production de descendances d’haploïdes doublés à partir des F1 obtenues entre les accessions les plus intéressantes et le parent sensible MM738 (E8) permettra de mener ultérieurement des études de cartographie génétique sur du matériel génétiquement fixé et immortel. Cette action fera partie d’une thèse de Doctorat en cours de montage (démarrage prévu fin 2013), qui s’attachera à disséquer les bases génétiques de la résistance à R. solanacearum sur le modèle aubergine et les bases de sa durabilité en sélection variétale. Tâche 2.1 : Cartographie génétique de la résistance sur la population de RILs issue de E8 x E6 vis-à-vis de souches représentant les phylotypes II et III Le criblage aura lieu en serre tunnel, avec inoculation contrôlée de R. solanacearum via le système d’irrigation (Lebeau et al. 2013). - deux essais x deux saisons menés à la Réunion avec une souche de phylotype III Ocean Indien, puis une souche « des Hauts » (phylotype IIB sequevar 1, ex-race3 /biovar2) - un essai x deux saisons mené au Cameroun avec une souche IIA Africaine ou III Africain. Tâche 2.2 : Tests des générations F1, F2 et backcross obtenues à partir des autres sources de résistance : Les générations F1, F2 et backcross produites à partir des croisements entre les accessions E1, E2, E3, E4, E9, et l’aubergine sensible MM738 seront produites et mises à disposition par l’INRA. Les essais auront lieu en serre avec un dispositif d’inoculation contrôlée : - à la Réunion (CIRAD) vis-à-vis de la souche agressive PSS4 du phylotype I, d’une souche des Hauts du phylotype IIB et d’une souche du phylotype III; - au Cameroun avec une souche IIA Africaine ou III Africain (station TECHNISEM) Tâche 2.3 : Production de descendances lignées fixées par haplo-diploïdisation L’androgenèse in vitro chez l’aubergine a été mise au point à l’INRA de Montfavet (Dumas de Vaulx and Chambonnet 1982). La production des descendances sera confiée à la société VEGENOV, Saint Pol de Leon, à partir de plantes F1 issues du croisement entre la/les accession(s) résistante(s) les plus prometteuses et l’aubergine sensible MM738. Action 3. Suivi de la durabilité du gène ERs1 et dynamique évolutive de son contournement Cette action a pour objectif d’identifier les phases clés du cycle infectieux de R.solanacearum impactées par l’action du gène ERs1, et les mécanismes moléculaires et populationnels impliqués dans le contournement de ce gène. Cette action fait l’objet d’une thèse de Doctorat (J. GUINARD, financement CIRAD/Université Réunion) débutée en fin 2012. Tâche 3.1 : Impact du système Ers1 chez AG91-25 sur la structuration génétique des populations de R. solanacearum dans une parcelle de plein champ Dans une parcelle préalablement typée (phylotype I) et ayant porté un premier cycle de culture non sélective (tomate sensible), 3 couples de microparcelles AG91-25 / MM738 (témoin sensible) sont implantés, et reconduits sur des cycles de 3 mois (stage Master 2 2012 et thèse J. Guinard). Au cours de chaque cycle de culture, l’incidence de la maladie est suivie à partir de l’observation du flétrissement selon une échelle de 0 à 4 (Lebeau 2010). En fin de culture, les populations pathogènes sont échantillonnées sur les plants avec ou sans symptômes selon un dispositif en double W (Huising et al. 2008), à raison de 2 compartiments par plante (rhizosphère/tige) afin d’évaluer l’effet filtre exercé par la plante. Les souches de R. solanacearum seront ensuite purifiées et génotypées par marqueurs neutres (gènes de ménage, marqueurs minisatellites) et marqueurs de virulence/avirulence (gènes d’effecteurs). Tâche 3.2. Diversité et contraintes évolutives sur les gènes bactériens d’avirulence et fitness sur aubergine Sur les lots de souches envoyés par chaque partenaire (action 1) et collectés au cours du suivi durabilité (action 3.1), les répertoires d’effecteurs de type III seront séquencés, en ciblant les gènes associés à la virulence/avirulence sur aubergine, ainsi que les effecteurs associés à la fitness bactérienne (Macho et al. 2010). Nous analyserons les différentes formes alléliques présentes dans les populations naturelles et identifierons ainsi les séquences conservées/sous sélection. Les résultats obtenus seront corrélés aux résultats de phénotypage (contournement de résistance).
Cette tâche a pour premier objectif d’établir si les effecteurs bactériens ciblés provoquent bien une réaction hypersensible (reconnaissance d’un effecteur Avr bactérien par un gène R de plante), par une approche d’expression transitoire via Agrobacterium tumefaciens menée en collaboration avec l’équipe de B. VINATZER (VirginiaTech University aux USA). Nous vérifierons également par une approche de mutagénèse dirigée si l’inactivation de ces effecteurs aboutit à une perte d’avirulence sur AG91-25. Contenu par action et indicateurs de suivi et d’évaluation : 
Calendrier des actions 
• partenaires techniques impliqués dans la réalisation du projet (destinataires de financements CAS DAR)
INRA, Unité de Génétique & Amélioration des Fruits et Légumes, Domaine St Maurice BP 94, 84143 Montfavet cedex Tel : 04 32 72 27 24 Fax : 04 32 72 27 02 Email : daunay@avignon.inra.fr
UMR PVBMT, Pôle de Protection des Plantes, 7 chemin de l’IRAT 97410 Saint PIERRE, La Réunion Tel : 02 62 49 92 21 / 02 62 49 92 42 / 02 62 49 92 00 Fax : 02 62 49 92 93 Email : dintinger@cirad.fr, wicker@cirad.fr
UPR 106 Bioagresseurs BP 701, F- 97387 Kourou Cedex, Guyane Tél : 05 94 32 73 57 Fax : 05 94 32 73 51 Email : jean.guyot@cirad.fr
1 chemin de l’IRFA, Bassin Martin, 97410 Saint-Pierre, La Réunion Tel : 02 62 96 22 60 Fax : 02 62 96 22 61 Email : insaguilllaume@armeflhor.fr
Zone d'activité Anjou Actiparc de Jumelles 49160 Longué-Jumelles Tel : 02 4138 39 39, Fax : 02 41 67 47 32 Email : ronan.gorin@technisem.com, chloe.moisson@technisem.com
Laboratoire des Interactions Plantes Micro-organismes (LIPM) 24 chemin de Borde Rouge - Auzeville BCS 52627 31326 CASTANET TOLOSAN CEDEX Tel : 05 61 28 50 55, Fax : 05 61 28 50 61 Email : Stéphane.Genin@toulouse.inra.fr 3.2. Inscription éventuelle de ce projet au sein d’un projet plus vaste présenté dans le cadre d’un autre appel à projet. Ce projet s’inscrit dans le cadre plus large du Programme GENETOM (Lutte génétique contre les maladies émergentes chez les Solanacées maraîchères) et plus particulièrement dans le projet GENETOM 3 (Durabilité, bases génétiques et moléculaires de la résistance au flétrissement bactérien chez les solanacées à graines). Ce programme est financé sur des fonds du CIRAD, de la Région Réunion et de l’Europe (FEDER), et conduit au sein de l’UMR PVBMT (Peuplements Végétaux et Bioagresseurs en Milieu Tropical). 3.3. Titres des contrats en cours dans les laboratoires des équipes concernées.
Contrat CASDAR VASCULEG 2011-2013 (résistance aux maladies vasculaires chez le melon et l’aubergine, recherche de nouveaux porte-greffes pour l'aubergine).
- Projet GENETOM 3 faisant partie du PO financé par l’UE et négocié dans le cadre de la convention tripartite Etat/Région/Cirad sur la période 2008 – 2013. - Projet CIOM 2012-2013 : Sélection de matériel végétal (aubergine et anthurium) résistant aux maladies bactériennes. - Projet ODEADOM 2011-2013 : programme sectoriel Fruits et Légumes et Horticulture.
-PO financé par l’UE et négocié dans le cadre de la convention tripartite Etat/Région/Cirad sur la période 2008 – 2013.
-Projets sur financement CASDAR : BIOPHYTO Mangue : production de mangue sans insecticide 2012-2014. Développement d’une production de pépinière hors sol durable 2012-2014. -Projets sur financement ECOPHYTO 2018 : Axe3 : mise au point de méthode de lutte alternative et sélection variétale. Axe5 : membre du réseau de surveillance biologique du territoire. Axe6 : homologation ou extension d’homologation de produits phytosanitaires sur les usages mineurs. -Projets sur financement européens : EPRPV : appui méthodologique aux essais herbicides oignons (Madagascar).
Un comité de pilotage rassemblant un à deux membres de chaque organisme partenaire sera constitué et se rassemblera en début de projet (kick-off meeting) pour décider des modalités de mise en œuvre du programme. Des visio-conférences seront organisées tous les 6 mois pour synthétiser les premiers résultats et discuter des réorientations éventuelles. Une réunion finale sera organisée en fin de projet (synthèse, et perspectives).
Le matériel génétique (aubergine) est déjà disponible en partie, et les marqueurs moléculaires de suivi de populations bactériennes sont au point. Les éventuelles difficultés se situent essentiellement au niveau des expérimentations ; la constitution de la collection de souches, et la détermination initiale des pathoprofils sont tributaires des possibles aléas climatiques qui pourraient perturber le développement d’épidémies de flétrissement bactérien sur les différents sites. Il est toutefois raisonnable de penser que les conditions seront réunies dans la première année. Une autre difficulté peut survenir sur le suivi de durabilité du gène ERs1 en parcelle : absence de contournement, variabilité non détectée dans les populations pathogènes. Les résultats déjà obtenus sur ce dispositif (présence d’infections latentes sur AG91-25) suggèrent cependant que le contournement est déjà en cours ; par ailleurs de nouveaux marqueurs minisatellites à évolution rapide sont en cours de validation sur le premier cycle de culture (stage M2 A. Latreille). Cette approche en conditions naturelles sera complétée par des expérimentations plus ciblées en conditions contrôlées.
Ce projet va fournir les premiers prédicteurs de durabilité de la résistance au flétrissement bactérien chez une espèce cultivée : effecteurs-diagnostic de changement de virulence, durée moyenne de contournement de la résistance. Seront aussi identifiées les sources de résistance les plus complémentaires en terme de spectre d’action et spécificité, ainsi que leur déterminisme génétique. Nous validerons la liste de génotypes d’aubergine résistants les plus adaptés à chaque zone géographique, et à chaque contexte épidémiologique. Les géniteurs de résistance les plus intéressants et les plus complémentaires pourront ainsi être utilisés par les sélectionneurs privés dans des schémas de pyramidage de gènes/QTLs de résistance au flétrissement bactérien en zone tropicale (outre-mer français) mais aussi en Europe et dans les régions méditerranéennes. Les gènes ou facteurs génétiques identifiés comme les plus efficaces (large spectre) seront cartographiés (projet spécifique) dans les populations d’haploïdes doublés développées dans le cadre du projet.
Une suite importante attendue du projet est l’identification chez l’aubergine de nouveaux gènes/QTL de résistance qui sont complémentaires du gène ERs1 et permettraient en combinaison avec ce dernier de contrôler toute la diversité du pathogène. Un des résultats les plus importants attendus du projet est la dissection de la résistance chez AG91-25 basée sur le gène majeur ERs1 accompagné de quelques QTL spécifiques ou non des souches ou phylotypes. Les limites et risques d’utilisation de cette résistance seront connus avec précision, ainsi que les combinaisons à privilégier avec les facteurs présents dans les autres accessions en vue du pyramidage de gènes à terme dans les cultivars d’aubergine. Le génotypage dense de la carte intraspécifique RILs E8 x E6 pourrait bénéficier des 3500 marqueurs SNPs polymorphes produits sur ces deux lignées dans le cadre du projet ANR Arcad. Nous recherchons actuellement des financements et des partenaires pour densifier notre carte et ensuite cloner le gène ERs1, au travers d’une collaboration soit avec un laboratoire étranger (Izmir Institute of Technology, Turquie) ou avec un semencier privé (East West Seeds, Thaïlande). Cette collaboration pourrait être étendue à la cartographie de gènes/QTLs dans les autres fonds génétiques qui apparaîtront comme les plus intéressants et ayant donné lieu à la production de descendances d’haploïdes doublés, à l’issue du projet. Une technologie de génotypage haut débit de type GBS ou tGBS pourrait être mise en œuvre à l’avenir pour produire des cartes génétiques saturées de nos populations d’haploïdes doublés. Les connaissances acquises chez l’aubergine pourront ensuite être mises à contribution chez les autres Solanacées, tomate, piment et également pomme de terre : recherche d’homologues du gène ERs1 et exploration, chez ces espèces synténiques, des zones du génome correspondant à celles identifiées chez l’aubergine. Le réseau, focalisé sur l’aubergine dans ce projet, pourra être mis à contribution pour les études de stabilité et durabilité de résistance d’autres solanacées (tomate et piment, voire pomme de terre). Les effecteurs-diagnostic de changement de virulence, identifiés dans cette étude, pourront être utilisés en épidémiosurveillance dans un réseau plus large. La recherche des cibles végétales de ces effecteurs bactériens pourra permettre d’identifier de nouveaux gènes de résistance. Les patrons de structuration spatiale de la population pathogène observés avec ou sans pression de sélection permettront d’identifier les phases clés du cycle infectieux impactées par le gène, et de celles impliquées dans le contournement. Il s’agira par la suite de tester différentes stratégies d’implantation variétale pour optimiser/maximiser la durabilité de la résistance. 7. Résumé destiné à une éventuelle publication Résumé, présentant en une demi-page maximum la problématique, les enjeux, les acteurs et les résultats attendus. R. solanacearum représente un problème phytosanitaire majeur sur les cultures maraîchères, mais constitue également une menace potentielle en France métropolitaine et dans d’autres pays de l’UE. La résistance variétale est la méthode la plus efficace et la moins coûteuse pour contrôler cette bactériose tellurique, mais son utilisation à large échelle est rendue difficile par la diversité et la très grande plasticité génotypique du pathogène. Le développement de sources de résistances efficaces et durables implique d’approfondir notre connaissance des interactions cultivar x souches, ainsi que leur dynamique évolutive. Les travaux menés à la Réunion (projet INRA-CIRAD-semenciers privés) ont montré que les niveaux de résistance les plus intéressants étaient observés chez l’aubergine. Dans l’accession S. melongena ‘AG91-25’, un gène majeur dominant a été identifié (Ers-1) contrôlant spécifiquement 3 souches du phylotype I mais contourné par des souches virulentes du même phylotype. D’autres accessions portent des résistances à spectre large (efficaces contre plusieurs phylotypes) potentiellement intéressantes en sélection. Le déterminisme génétique de ces résistances doit être caractérisé en vue de leur utilisation future. Dans ce projet seront donc explorées les complémentarités des différentes résistances ; en parallèle, la durabilité du gène Ers1 sera abordée en évaluant son impact sur l’évolution des populations de R. solanacearum à l’échelle parcellaire. Les résultats obtenus, corrélés aux observations sur le terrain dans des essais de contournement de la résistance, permettront de se faire une première idée de la durabilité des résistances. Les connaissances acquises dans ce projet seront valorisables pour les filières maraîchères en termes d’efficacité des facteurs de résistance à déployer face aux différentes situations épidémiologiques caractérisant les DOM et la zone tropicale en général. Yüklə 119,62 Kb. Dostları ilə paylaş:
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