Universitatea „alexandru ioan cuza”IAŞI
Decelarea unor indicatori biochimici şi funcţionali în aprecierea relaţiei plantă gazdă -filosferă
Yüklə 167,65 Kb.
|
Decelarea unor indicatori biochimici şi funcţionali în aprecierea relaţiei plantă gazdă -filosferă.
Pentru testarea efectelor antimicrobiene ale uleiurilor volatile extrase din specii de Ocimum şi Perovskia au fost selectate două bacterii test ce provin din colecţia de microorganisme a Laboratorului de Microbiologie, Facultatea de Biologie, Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” din Iaşi:
În vederea evidenţierii efectelor antibacteriene a fost utilizată metoda difuzimetrică pe agar nutritiv (Lorian, 2005), cu două variante experimentale:
Plăcile Petri cu mediul de cultură au fost însămânţate la suprafaţă prin scăldare (anterior depunerii comprimatelor sau cilindrilor metalici) folosind preculturi ale celor două bacterii test (densitate optică – DO la 600 nm = 0,211 pentru Escherichia coli, respectiv 0, 231 pentru Staphylococcus aureus) şi incubate la 370 C timp de 24 ore. În cazul reacţiilor pozitive, în jurul comprimatelor sau cilindrilor metalici, a apărut o zonă de inhibiţie a creşterii al cărei diametru a fost măsurat în mm. Datorită răspândirii fenomenului de rezistenţă la antibiotice în rândul patogenilor, succesul tratamentelor eficace ale bolilor provocate de microorganisme este pus în pericol. Din acest motiv, în ultimii ani, s-au făcut eforturi masive în încercarea de a identifica tratamente alternative căii clasice reprezentate de antibiotico-terapie. O posibilă soluţie este utilizarea unor produse naturale, aşa cum sunt uleiurile volatile extrase din diferite plante. Aceste uleiuri au fost studiate din perspectiva potenţialului lor antimicrobian şi supuse unui proces de selecţie în vederea utilizării lor ca tratamente alternative a unor infecţii de natură microbiană (Tepe et al., 2004). Numeroase studii au demonstrat că uleiurile volatile prezintă proprietăţi antibacteriene, antifungice, antivirale, insecticide şi antioxidante (Burt, 2004). Unele au fost folosite în terapia unor forme de cancer (Sylvestre et al., 2006), altele în conservarea alimentelor (păstrare activă), sau ca sursă de compuşi biologic activi. Din aceste motive este de aşteptat ca în compoziţia chimică a uleiurilor volatile provenite de la diferite specii de plante să fie descoperite substanţe cu proprietăţi antimicrobiene având acţiune specifică sau generală asupra microorganismelor (Prabuseenivasan et al., 2006). Uleiurile volatile (numite şi uleiuri esenţiale) sunt compuşi aromatici obişnuiţş din diferite părţi ale plantelor (flori, muguri, seminţe, mlădiţe, scoarţă, lemn, fructe sau rădăcini). Pot fi obţinute prin fermentaţie sau extracţie, însă cea mai utilizată metodă din punct de vedere comercial este hidrodistilarea. Se estimează că până în prezent se cunosc peste 3000 de uleiuri volatile, din care aproximativ 300 au importanţă practică în industria parfumurilor. Uleiurile volatile conţin un amestec de compuşi care din punct de vedere chimic sunt derivaţi din terpene sau din compuşii oxigenaţi ai acestora. Cea mai largă utilizare în Uniunea Europeană a uleiurilor volatile se înregistrează în industria alimentară (condimente), cosmetică şi farmaceutică. Proprietăţile antibacteriene ale uleiurilor volatile sau ale subcomponentelor acestora au fost exploatate sub forma unor produse comerciale diferite cum ar fi: preparate pentru obturarea canalele radiculare dentare, antiseptice (Cox et al., 2000), aditivi alimentari folosiţi pentru furajarea animalelor. Uleiurile obţinute din camfor, cedru, scorţişoară, lămâie, mentă, busuioc, portocal, rozmarin, miez de nucă ş.a. sunt folosite de foarte multă vreme în medicina tradiţională a multor popoare, pentru proprietăţile lor: antimicrobiene şi antifungice (rozmarin, busuioc, levănţică), antiinflamatorii (busuioc), antidiabetice (scorţişoară), antitumorale (mentă, portocal), imunomodulatorii (tei), etc. Busuiocul (Ocimum basilicum) este una din cele mai populare plante utilizate ca şi condiment, având însă aplicaţii extinse şi în industria parfumurilor, produselor de îngrijire orală, etc. Recent, uleiurile volatile extrase din busuioc au devenit agenţi antimicrobieni utilizaţi în domenii de vârf, cum ar fi ambalarea activă a alimentelor, având un risc scăzut pentru consumatori (Miltz et al., 1995). Din aceste considerente, prezentul studiu şi-a propus investigarea potenţialului antimicrobian a unor uleiuri extrase din busuioc (Ocimum basilicum) şi Perovskia atriplicifolia utilizabile ca agenţi antimicrobieni în scopuri comerciale. În acest scop s-a utilizat metoda difuzimetrică pe agar nutritiv (Lorian, 2005), folosind comprimate de hârtie de filtru sau cilindri metalici din oţel inoxidabil. Pentru stimularea difuziei uleiurilor testate în mediul de cultură, atât în probă cât şi în martor s-a adăugat Tween 80, 0,5 % v/v (Prabuseenivasan et al., 2006). Ca şi control, pe suprafaţa mediului de cultură au fost adăugate comprimate standard conţinând gentamicină (10 μg/disc) – Fig. 16 şi streptomicină (25 μg/disc). Diametrele zonelor de inhibiţie (exprimate în mm) reprezintă media a trei măsurători succesive. Analiza uleiurilor volatile extrase din Perovskia atriplicifolia, utilizând ambele variante experimentale, a demonstrat că efectul antimicrobian este exercitat doar asupra bacteriei Gram pozitive testate - Staphylococcus aureus (Fig.15, Fig. 16). Zone de inhibiţie cu diametre medii de aprox. 24 mm au fost evidenţiate doar în cazul testării uleiurilor diluate 1:1 cu DMSO 10 % în soluţie apoasă, folosind metoda cu comprimate de hârtie. De menţionat faptul că utilizarea unui control reprezentat prin comprimate de gentamicină a permis măsurarea unor diametre ale zonelor de inhibiţie foarte asemănătoare cu cele obţinute în cazul precedent – aprox. 25 mm (Fig. 16). Prin urmare, putem afirma că uleiul extras din Perovskia atriplicifolia, testat în condiţiile noastre experimentale, exercită asupra speciei Staphylococcus aureus un efect antibacterian comparabil cu cel indus de utilizarea antibioticului gentamicină. Aceleaşi efecte asupra bacteriei test, induse de uleiuri volatile extrase din specii ale genului Perovskia (P. abrotanoides), sunt menţionate în literatura de specialitate şi în cazul utilizării altor antibiotice: vancomicină şi eritromicină (Mahboubi et al., 2009). Zone de inhibiţie ale creşterii au fost evidenţiate şi în cazul utilizării metodei cu cilindri metalici, atât pentru diluţia 1:1 cât şi pentru 1:5, însă diametrele măsurate sunt mai mici în comparaţie cu cele înregistrate la folosirea comprimatelor de hârtie (Fig. 17). O posibilă explicaţie a diferenţelor înregistrate la utilizarea celor două variante experimentale este legată de gradul mai mare de volatilizare al uleiurilor la folosirea cilindrilor metalici, fapt ce împiedică difuzia probei în mediul de cultură (Burt, 2004). Deşi s-a utilizat o perioadă de predifuzie de 2 ore la 40 C înainte de incubare (Sittiwet, 2009), nu am putut preîntâmpina efectul volatilizării accelerate a uleiurilor testate la temperatura de termostatare (370 C). Potenţialul antimicrobian al uleiul volatil extras din plantele de Perovskia atriplicifolia poate fi datorat prezenţei unor compuşi al căror efect inhibitor asupra creşterii bacteriei Staphylococcus aureus este demonstrat de literatura de specialitate: α-terpineol (Cosentino et al., 1999) şi carvacrol (Cosentino et al., 1999; Lambert et al., 2001). La bacteria Escherichia coli, nici o diluţie obţinută din uleiul volatil testat nu a avut efect inhibitor asupra creşterii, în condiţiile utilizării ambelor variante experimentale (Fig, 16 şi Fig. 18). Absenţa efectului antibacterian în acest caz este confirmată şi de rezultatele raportate în literatura de specialitate de alţi specialişti (Basher et al., 1997; Mahboubi et al., 2009). Rezultatele obţinute în cazul testării uleiului extras din plantele de Ocimum basilicum au evidenţiat existenţa unui potenţial antimicrobian manifestat atât faţă de bacteriile Gram pozitive (Staphylococcus aureus), cât şi faţă de cele Gram negative (Escherichia coli). Efecte de inhibare a creşterii, cu diferite intensităţi, s-au obţinut la testarea bacteriei Staphylococcus aureus, în cazul tuturor diluţiilor utilizate, cele mai mari zone de inhibiţie înregistrându-se în cazul diluţiei 1:1 (Fig. 19, Tab. 4). Aceste efecte pot fi explicate prin prezenţa, în compoziţia uleiului investigat a unor compuşi ca: α-pinen (Mahboubi et al., 2009), metil cavicol (Baratta et al., 1988) cunoscuţi ca având efecte inhibitoare asupra creşterii stafilococului auriu. Cel mai important efect inhibitor datorat utilizării uleiului extras din plantele de busuioc s-a înregistrat în cazul bacteriei Escherichia coli. Diametrele zonelor de inhibiţie (aprox. 56 mm), evidenţiate pentru diluţia 1:1, depăşesc pe cele înregistrate în cazul controlului reprezentat de comprimate standard de streptomicină (25 μg/disc) (Prabuseenivasan et al., 2006) – Fig. 20. Activitatea antibacteriană maximă a fost evidenţiată la cea mai mare concentraţie de ulei testată (diluţia 1:1) - (Tab. 4). Informaţiile din literatura de specialitate demonstrează că acest efect inhibitor este determinat de prezenţa, în compoziţia uleiurilor de busuioc, a unor compuşi ca: linalool, carvacrol, timol, citral şi eugenol (Benchaar et al., 2006; Burt et al., 2007; Helander et al., 1998; Hussain et al., 2008). Nici unul din aceşti compuşi nu a fost identificat în urma analizelor cromatografice efectuate pe probele de ulei obţinute în condiţiile noastre experimentale. Prin urmare, activitatea antimicrobiană a uleiului de busuioc testat se datorează cu siguranţă altor substanţe al căror potenţial urmează a fi identificat pe parcursul etapelor ulterioare. Experimentele noastre au demonstrat că uleiurile volatile extrase din busuioc prezintă un efect antimicrobian asupra unui spectru larg de microorganisme (Gram pozitive şi negative), fapt confirmat şi de literatura de specialitate (Suppakul et al., 2003).
Legendă: 1 – martor = DMSO 10 % sol. Apoasă; 2 – ulei volatil, diluţia 1:1 în DMSO 10 %; 3 – ulei volatil, diluţia 1:5 în DMSO 10 %; 4 – ulei volatil, diluţia 1:10 în DMSO 10 % Tabel 4 – Aprecierea efectului antibacterian al uleiului extras din plante de Ocimum basilicum
O parte din tulpinile bacteriene izolate pe parcursul anului 2009 din filosfera speciilor Perovskia atriplicifolia şi Ocimum basilicum au fost supuse testării în vederea identificării potenţialului antimicrobian al uleiurilor volatile provenite de la aceleaşi plante. În urma analizelor efectuate, urmând protocolul prezentat anterior, am demonstrat că uleiurile testate nu exercită un efect inhibitor asupra bacteriilor provenite din filosfera plantelor utilizate pentru extracţie (Fig. 21-24). Absenţa activităţii antimicrobiene a unor produşi ai plantelor investigate asupra propriei comunităţi filosferice poate fi explicată prin mecanismele de adaptare la care apelează respectivele microorganisme pentru a putea supravieţui acestui tip de habitat (Morris et al., 1996).
Legendă: 1 – martor = DMSO 10 % sol. Apoasă; 2 – ulei volatil, diluţia 1:1 în DMSO 10 %; 3 – ulei volatil, diluţia 1:5 în DMSO 10 %; 4 – ulei volatil, diluţia 1:10 în DMSO 10 % Considerăm deci că: Uleiul extras din Perovskia atriplicifolia exercită asupra speciei Staphylococcus aureus un efect antibacterian comparabil cu cel indus de utilizarea antibioticului gentamicină. Nu a fost evidenţiat nici un efect asupra bacteriei Gram negativ testate (Escherichia coli). Efectul inhibitor indus asupra creşterii bacteriei test poate fi pus pe seama prezenţei α-terpineolului şi carvacrolului în compoziţia chimică a uleiului testat. Uleiurile volatile extrase din plantele de Ocimum basilicum au prezentat un potențial antimicrobian manifestat atât faţă de Staphylococcus aureus, cât şi faţă de Escherichia coli. Inhibarea creşterii stafilococului auriu se poate datora α-pinenului şi metil cavicolului, compuşi evidenţiaţi cromatografic în compoziţia uleiului de busuioc. Activitatea antimicrobiană a uleiului de busuioc asupra bacteriei Escherichia coli nu se datorează unor compuşi ca linalool, carvacrol, timol, citral şi eugenol. Uleiurilor volatile obţinute din speciile de Ocimum şi Perovskia nu prezintă activitate antimicrobiană asupra microorganismelor filosferice proprii. Bibliografie
10dec. 2009 Director proiect, Prof. univ. dr. Maria Magdalena ZAMFIRACHE Yüklə 167,65 Kb. Dostları ilə paylaş:
| ||||||||||||||||||||||||
