Manel Wakkel 02/07/2015 à 14h

Vous êtes cordialement invités à la soutenance de la thèse de
Manel Wakkel

02/07/2015 à 14h

Amphi Riquet – INSA Toulouse

Contribution à l’étude de la séparation des protéines par chromatographie d’échange d’ions en milieu complexe. Effet du poids moléculaire sur l’équilibre et la cinétique de la rétention
Résumé

La séparation et la purification de biomolécules à partir de milieux bruts, végétaux ou biologiques, est un sujet vaste et complexe. De sa compréhension et de son développement dépendent des enjeux industriels, et notamment le complet développement des procédés biotechnologiques, les procédés de séparation, ou downstream processes, constituant environ 80 % des coûts totaux de ces procédés. Ce travail se veut une contribution à ces problématiques. Il a été motivé par des résultats obtenus au préalable dans le laboratoire qui montraient qu’il est possible de récupérer une protéine de très grande taille à partir d’un milieu réel végétal par l’application d’une seule opération chromatographique (Kerfai, 2011). Suite à ce résultat, des hypothèses ont été énoncées, auxquelles ce travail essaie de répondre : quel(s) mécanisme(s) peuvent expliquer ce résultat ? Existe-t-il une localisation spécifique pour la fixation de la molécule sur l’échangeur d’ions qui rend plus simple et efficace sa récupération lors de l’étape d’élution ? Ainsi, notre objectif a été de progresser dans la connaissance des aspects fondamentaux de la chromatographie d’échange d’ions appliquée à la séparation des protéines à partir d’un milieu brut. Notamment, l’influence de la présence d’autres protéines dans le milieu a été analysée, et ce dans le cas particulier de protéines de poids moléculaire très différents, comme c’était le cas dans le travail précédemment cité. Des approches variées, théoriques et expérimentales à différentes échelles sur des milieux réels ou synthétiques, ont été appliquées et parfois développées, pour essayer de répondre à ces questions. A l’échelle du procédé, une méthode statistique d’analyse des données (Analyse en Composants Principaux ou ACP) a été menée, dont l’exploitation reste délicate. A l’échelle du laboratoire, l’étude de l’équilibre et de la cinétique d’échange d’ions a été menée sur des solutions synthétiques de deux protéines : la sérum albumine bovine (BSA) (en tant que protéine de référence, couramment étudiée) et la ferritine (protéine de stockage du fer) de point isoélectrique proche de celui de la BSA mais de masse molaire plus élevée. Les résultats montrent que des modèles relativement classiques peuvent être appliqués, y compris pour les protéines de très grandes tailles, pour expliquer les aspects cinétiques de l’échange. Le couplage des flux de matière des protéines à l’intérieur des particules de l’échangeur est très probable, malgré des diffusivités très différentes. Interpréter les résultats d’équilibre reste bien plus ardu. La concentration en sel ou la présence de BSA n’ont que très peu d’effet sur la rétention de la ferritine à l’équilibre. En revanche, la présence de ferritine affecte très fortement la rétention de la BSA (pourtant plus favorable). Parmi les phénomènes suggérés dans la littérature, l’effet Vroman a été recherché, mais il n’a pas été constaté dans le système pour les conditions de travail utilisées. Les isothermes d’adsorption en conditions compétitives n’ont pas pu être simulées par les modèles habituels (comme l’isotherme multi-constituants de Langmuir), alors que celles des protéines seules sont tout à fait classiques. En outre, un blocage partiel des pores de la résine par la ferritine reste probable, empêchant la diffusion de la BSA. Afin de vérifier ce dernier point, une méthodologie a été développée afin d’observer à l’échelle microscopique les profils de concentration des éléments représentatifs du système (P, Fe, Cl…) dans les particules. Cette méthode qui se trouve à un stade très avancé de développement, n’a pas encore permis de conclure faute de sensibilité suffisante des sondes à disposition.
Mots-Clés : Echange d’ions, MEB-EDX, Milieu complexe, procédés chromatographiques, Protéine.
Etablissement d’inscription : INSA-Toulouse
Composition du Jury :

Laurence Muhr, Professeur (rapportrice)

Claire Fargues, Maître de conférences HDR (rapportrice)

Charlotte Cabanne, Maître de conférences HDR (examinatrice)

Bruno Gabriel, Professeur (examinateur)

Pierre Yves Pontalier, Maître de conférences HDR (examinateur)

Maria Aurora Fernandez, Professeur (directrice de thèse)

Sandrine Alfenore, Maître de conférences (co-directrice de thèse, invitée)

Stéphane Mathé, Professeur agrégé (invité)