Chapitre I: Materiel et Methodes
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- CHAPITRE III : DISCUSSION ET CONCLUSION 26
- I.1.1. Matériel biologique
- I.1.2. Milieu de culture
- I.1.2.3. Milieu de culture
- I.1.3. Matériel de fermentation
- I.2. Etude des paramètres de fermentation
- I.2.1. Analyse des sucres réducteurs (méthode AFNOR,1989)
- I.2.2. Analyse de l’Ethanol, glucose, acide acétique, glycérol
- I.2.3. Evaluation de la biomasse cellulaire
- I.4. Analyse des échantillons par GC
- Température initiale: 40 o C
- II.1.1. Evolution de la croissance cellulaire au cours du temps
- II.1.2. Variation du nombre de cellules, du substrat et du produit en fonction du temps
- II.1.3. Production de glycérol et d’acide acétique
- II.2. Résultats de la distillation
- II.3. Résultats de l’analyse par GC
- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
- Matériel ou pilote de fermentation
- Annexe 9, 10 et 11 : Copie des spectres
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Agence universitaire de la Francophonie (AUPELF) Bureau Moyen-Orient UNIVERSITE LIBANAISE (UL) UNIVERSITE SAINT-JOSEPH (USJ) UNIVERSITE SAINT –ESPRIT DE KASLIK (USEK) Et INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE PARIS-GRIGNON (INAP-G) En partenariat avec L’INSTITUT DE RECHERCHE AGRONOMIQUE-Liban(IRAL) L’INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE –France (INRA) Mémoire de diplôme d’Etudes Approfondies (DEA) AGROALIMENTAIRE ASSURANCE –QUAlITE D Différence entre les alcools supérieurs de différents fruits fermentés iff Présenté par :Norma WAKIM Effectué à : Fanar aux Laboratoires de l’IRAL Mkalles aux laboratoires de la faculté de sciences de l’USJ Directeur du mémoire : Dr Christo HILAN Membres du Jury : Dr Michel Frem Dr Christo Hilan Dr Samir Medawar Dr Rachad Saliba Dr Philipe Verger
Novembre 2001Remerciements Je tiens à remercier, avec beaucoup de respect et de gratitude tous ceux qui, par leur collaboration, ont contribué à l’établissement du présent travail. J’adresse mes remerciements au Dr Medawar, directeur du programme de DEA Agroalimentaire-assurance –qualité à l’AUPELF et à Mlle Nayla Abou Alwan pour leur soutien tout au long de cette année. Je remercie Dr Hilan, le directeur du laboratoire de Fanar à l’institut de recherche agronomique du Liban (IRAL), et tout le personnel , pour leur acceuil et leur gentillesse spécialement Mme Hiam Sinno, Mlle Rima El Hajj et Mr Georges Chamoun. Je tiens également à exprimer mes profonds respects et remerciements pour Docteur Toufic Rizk, directeur du département de chimie à l’USJ pour sa générosité, son aide et son soutien . Je remercie sincèrement Mr Wissam Medawar, pour m’avoir soutenu, par ses compétences, sa connaissance, ses qualité humaines, ses produits et même son matériel, au quotidien tout au long de la période de mon projet , et même durant les jours de congé et les week-ends. Je remercie encore Claudine l’assistante de laboratoire de chimie pour sa disponibilité, sa gentillesse et son aide qui ont rendu mon travail plus facile, et qui m’ont permis d’effectuer mes expériences à l’USJ, même durant le mois de congé. J’adresse aussi mes remerciements à Mr Amer Sakr directeur du laboratoire ATL, pour m’avoir aidé à la lecture des échantillons sur GCMS. Enfin,je tiens à adresser mes meilleurs remerciements à mon patron de mémoire, Dr Christo Hilan, qui par son soutien, ses conseils, et sa patience m’a permis de terminer mon projet. TABLE DE MATIERES INTRODUCTION 5 PROBLEMATIQUE 7 CHAPITRE I. MATERIEL ET METHODES I.1. Fermentation 12 I.1.1. Matériel biologique 12 I.1.2. Milieu de culture 12 I.1.2.1. Milieu de préculture 12 I.1.2.2. Le levain 13 I.1.2.3. Milieu de culture 13 I.1.3. Matériel de fermentation 13 I.2. Etude des paramètres de fermentation 14 I.2.1. Analyse des sucres réducteurs 14 I.2.2. Analyse de l’éthanol, acide acétique et glycérol 15 I.2.3. Evaluation de la biomasse cellulaire 16 I.3. Distillation 17 I.4. Analyse des échantillons par GC 17 I.5. Analyse par GCMS 18 CHAPITRE II. RESULTATS II.1. Résultats de la fermentation alcoolique 19 II.1.1. Evolution de la croissance cellulaire au cours du temps 19 II.1.2. Variation du nombre de cellules, substrat et du produit en fonction du temps 20 II.1.3. Production de glycérol et d’acide acétique 21 II.2. Résultats de la distillation 21 II.3. Résultats de l’analyse par GC 21 II.4. Résultats de l’analyse par GCMS 23
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 30ANNEXE 32INTRODUCTIONL’élaboration de boissons alcoolisées par fermentation des produits végétaux est une pratique très ancienne qui a connu des grands progrès avec les travaux de PASTEUR au 19 ème siècle. L’obtention d’une eau de vie de vin se fait grâce à une séparation de l’alcool obtenu après la fermentation alcoolique du jus de raisin. Elle est appelée au Liban Arack. Cette boisson alcoolisée nationale, est aussi consommée dans certains pays voisins comme la Turquie, la Grèce où elle est nommée respectivement Raki et Ouzo. La loi libanaise définie l’Arak de raisin comme étant la distillation du jus de raisin, avec les graines d’anis vert uniquement. Elle maintient exclusivement la dénomination “Arack de Raisin”, à l’alcool obtenu par fermentation du raisin et distillé avec la semence d’anis. Ce produit d’origine porte la désignation “Arack de raisin pur”. Si un Arack est produit à partir d’une autre origine agricole, la désignation sera “Arack” seulement. Dans le cas d’un mélange d’alcool de raisin et d’alcool industriel ou alcool d’origine agricole autre que le raisin, il s’agira alors d’un Arack de raisin fraudé (LIBNOR, norme No 67672, non publiée).
Pour différencier ces divers types d’arack, il faut avoir recours au goût et aux arômes naturels qu’ils contiennent ; mais la qualité aromatique et gustative des eaux de vie dépend de la variété de fruit, des conditions pédoclimatiques (sol et climat), des conditions de la préfermentation et de la fermentation (Schreler, 1979). PROBLEMATIQUE Afin d’évaluer la qualité de l’alcool de raisin pur et de contrôler les pratiques illicites et l’adultération de cet alcool, il est nécessaire de différencier les arômes des différents fruits fermentés. L’arôme du vin de fruit a une complexité d’origine. Il est formé d’arôme variétal, préfermentaire et fermentaire. Les arômes variétaux sont la partie de l’arôme reliée au cépage dont il est issu à laquelle s’ajoute l’interférence du sol, du climat et des pratiques culturales. Les arômes préfermentaires, sont ceux qui se développent suite aux traitements subis par le fruit de la récolte au départ de la fermentation. Les arômes fermentaires résultent des transformations effectuées par les levures au cours de la fermentation alcoolique(Schreler, 1979). Traditionnellement, la fermentation alcoolique était assurée par des populations indigènes où l’espèce saccharomyces cerevisiae était largement prédominante. Depuis quelques années la tendance est à la généralisation du levurage. L’introduction d’une souche pure permet de régulariser et d’accélérer les départs en fermentation et d’éviter les incidents organoleptiques résultant de la mise en action de certaines populations indigènes (Valade & Moulin, 1984). En vinification, la levure utilise les composés nutritionnels du moût du fruit utilisé (sucre, azote, potassium, vitamines…) pour assurer les fonctions de croissance, multiplication, production et maintenance. La croissance des levures se fait en quatre phases (Balley, 1986) :
La conduite d’une fermentation alcoolique dans des bonnes conditions nécessite la prise en compte de plusieurs paramètres, dont les variables initiales et les conditions opératoires de la cinétique de fermentation. Les variables initiales sont le taux de substrat et le taux d’inoculation. Le taux de substrat ne doit pas être supérieur à 170 g/l . Des concentrations supérieures à ce taux inhibent les enzymes de métabolisme fermentaire. Le levurage ne doit pas s’effectuer à une très forte densité cellulaire, car il provoque une chute du rendement en biomasse, étant donné que la croissance des levures sera limitée par l’épuisement du moût en éléments nutritifs ( Feuillat, 1983). Les conditions opératoires sont la température et le pH. Les sacharomyces cerevisiae supportent une large gamme de température, mais une température entre 12 et 18o C est conseillée car une fermentation lente favorise la retention des composés volatils (Fleet, 1998). Le pH optimal de croissance des levures est de 3.5 à 3.8 (Gray, 1984). Dans un milieu à pH supérieur à 7 ou inférieur à 2.9, une inhibition de la croissance et de la production d'’alcool est observée ( Jones et al, 1981, winter, 1988). Les arômes de fermentation alcoolique ont fait l’objet de nombreux travaux. Les composés les plus importants sont les alcools supérieurs et les esters. Selon les références, le nombre de familles chimiques auxquelles appartiennent les substances aromatiques est variable. Latrasse et al en 1985 ont retenu schématiquement six familles qui sont :
D’autre part, onze familles participant aux qualités organoleptiques des boissons fermentées ont été retenues par Degorge-Dumas et al en 1984 . Ces familles sont :
La catégorie de substances de flaveur est donc formée de composés volatils responsables de l’odeur comme les alcools, les esters, les aldéhydes, tandis que les composés non volatils contribuent particulièrement au goût comme les acides organiques, sucres, composés phénoliques et les minéraux ( Berger, 1995). Pour différencier les alcools supérieurs et les arômes, ou plutôt caractériser les distillats ou eaux de vie provenant de différents fruits fermentés il est important de savoir la composition chimique du fruit et d’étudier la fermentation, car la qualité aromatique des distillats dépend du fruit, des conditions de fermentation et de la distillation. La température et le mode de distillation (Alambic, colonne) jouent un rôle important sur la composition en alcools supérieurs de l’eau de vie. L’utilisation de la colonne a l’inconvénient de dénaturer les arômes qui peuvent indiquer l’origine de l’alcool (Belille, 1981). La quantification d’alcools volatils par chromatographie à phase gazeuse a été suggérée pour la caractérisation des eaux de vie. La distribution analytique de ces alcools a été utilisée pour établir des profiles analytiques par classes de certains alcools tels le Bourbon, Scotch, Vodka, Gin et Tequila (Schoeneman & Dyer, 1973). Plusieurs études ont été aussi faites sur le Brandy, elles avaient précisé la présence d’isobutanol, butanol, amylol et 1- hexanol (Barnett et Einsmann , 1977) . Peu d’études ont été faites sur l’alcool de raisin au Liban, Dagher et Ilyas en 1975, ont déterminé la composition des huiles essentielles et du méthanol dans l’arack Gehchan et al en 1991, ont identifié et quantifié les composés volatils et le méthanol dans différents échantillons d’arack de raisin commercial et artisanal. Aucune étude n’a été faite spécifiquement sur l’eau de vie de raisin libanais (alcool non anisé), ou sur l’eau de vie de certains fruits qui pourraient être ajoutés et ou substituées à l’arack. Actuellement, plusieurs analyses se font à Fanar à l’IRAL, sur la composition de l’alcool produit au Liban, et sur le contrôle de l’origine de l’arack produit au Liban dans le cadre du projet « contrôle alimentaire », bien qu’insuffisantes. Pour cela, et dans ce même cadre cette étude porte sur la fermentation alcoolique dans les mêmes conditions des paramètres de fermentation et de distillation, de 2 variétés de fruits autre que le raisin qui sont la pomme et les figues. Ceci, afin d’identifier la différence entre les alcools supérieurs des eaux de vie de ces fruits, et d’analyser leurs arômes. La pomme a été choisie à cause de sa production excessive au Liban , de la difficulté de son écoulement et de l’absence de sérieuses alternatives de transformation surtout la variété starking (Ministère de l’agriculture, recensement agricole, 1998). Les figues à cause de la surproduction durant la période de leur récolte et de leur périssabilité rapide. La première partie de ce travail a été consacrée à la fermentation et au contrôle des paramètres de suivi de la fermentation tels la température, l’agitation, l’oxygénation ainsi que l’étude de l’évolution de la biomasse, du substrat (sucres réducteurs), et du produit (surtout éthanol) des 3 fruits étudiés. Par la suite les vins obtenus ont été distillés. Différents échantillons ont été prélevés à de différentes températures. Ces échantillons ont été analysés par chromatographie à phase gazeuse afin d’identifier la différence entre leurs alcools supérieurs et aussi qualitativement par injection sur GCMS. L’ensemble du travail devrait conduire à une meilleure connaissance de la différenciation entre les alcools supérieurs et les arômes de 3 eaux de vies obtenues. CHAPITRE I: MATERIEL ET METHODES Ce chapitre décrit la démarche suivie afin d’aboutir aux résultats finaux. Il est subdivisé en 4 parties principales : La fermentation, L’étude des paramètres de contrôle de la fermentation alcoolique, La distillation, L’analyse des composés aromatiques des distillats ou eaux de vie obtenues. Les expériences ont été réalisées aux laboratoires de l’institut de recherche agricole au Liban à fanar et aux laboratoires de chimie et de biologie de la faculté des Sciences à L’université Saint Joseph à Mkalles et aux laboratoires de l’Analytical testing laboratories (ATL) à Achrafié. I.1. Fermentation La fermentation alcoolique a été réalisée sur les moûts de 3 variétés de fruits qui sont : Le raisin blanc, La pomme (variété : Starking), Les figues à peau balnche. I.1.1. Matériel biologiqueLa souche saccharomyces cerevisae est utilisée pour l’inoculation du milieu à une dose de 2 millions de cellules par litre de moût. Cette souche porte le numéro « MUCL 31497 ». Elle provient de la Belgique, des laboratoires de mycothèque de l’université catholique de Louvain. I.1.2. Milieu de culture3 milieux de culture ont été utilisés lors de l’expérimentation avant l’inoculation du moût utilisé : I.1.2.1. Milieu de préculture (prélevain) Les levures sont réactivées par cette préculture. Cette étape est effectuée dans un Erlen Meyer contenant le milieu dont la composition est la suivante :
Tampon : Na2HPO4, 7 H2O : 26.88 g/l Acide citrique : 17.6 g/l La préculture est ensemencée à partir de la souche conservée sur une gélose à 4C. Après 24 heures d’incubation, une numération des cellules viables permet de fixer le volume de culture nécessaire pour ensemencer le levain et ensuite le milieu de fermentation. I.1.2.2. Le levainLa préparation de l’inoculum est faite en 2 étapes (levain, culture). La première permet d’adapter la souche vis à vis du milieu, et la deuxième est utilisée pour ensemencer le milieu à étudier avec 2.10 6 cellules/ml en phase de croissance. Les 3 levains sont préparés comme suit : 50 ml du jus de fruit étudié (pommes, figues, Raisin), pasteurisés à 70 C pendant deux heures, et inoculés par un volume de préculture contenant des cellules en phase de croissance. I.1.2.3. Milieu de culture3 milieux de culture sont utilisés. Moûts de Raisin blanc, pomme et figues : 1 litre de moût de chaque fruit est égrappé , bien macéré et stérilisé à une température de 70C pendant deux heures, ensuite inoculé par un volume de levain assurant un ensemencement de 2.10 6 cell/ml en phase de croissance I.1.3. Matériel de fermentationL’expérience est réalisée sur un ensemble de 3 erlens Meyers de 1 litre de volume utile, autoclavés fermés par du coton doublé de papier aluminium. L’homogénéité du milieu est assurée par un système d’agitation magnétique. La température est régulée à 17oC pendant toute l’expérience par un bain marie relié à un groupe réfrigérant (Annexe 2). I.2. Etude des paramètres de fermentationPour un bon contrôle de la fermentation 3 paramètres ont été étudiés au cours de la fermentation l’analyse des sucres réducteurs, l’analyse de l’éthanol et l’analyse de la biomasse. Une analyse du glycérol, du glucose et de l’acétate a été aussi faite. I.2.1. Analyse des sucres réducteurs (méthode AFNOR,1989)La détermination des sucres réducteurs est réalisée par un dosage de ces sucres selon la méthode AFNOR, 1989 et modifiée selon l’expérience. L’analyse est effectuée en 2 étapes
Pour trouver la quantité des sucres réducteurs à partir du volume de KMnO4 utilisé, On se sert des deux courbes d’étalonnage effectuées au préalable à partir de différentes concentrations de glucose allant de 0 jusqu’à 30 g/l et de 30g/l jusqu’à 170 g/l.( Annexe 3). A : Acétate neutre de plomb :250g Eau distillée : 500ml B : Sulfate de cuivre 4g + acide sulfurique pur 0.2 ml +100 ml eau distillée C : Tartrate sodico potassique 20g + soude pure 15 g+ 100 ml eau distillée D : sulfate ferrique sec et pur 5 g+ acide sulfurique pur 20g + 1500 ml eau ditillée I.2.2. Analyse de l’Ethanol, glucose, acide acétique, glycérolCes molécules ont été analysées par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Au cours de la fermentation, des échantillons d’1 ml de volume sont prélevés, 0.25 ml de sulfate de Zinc (ZnSO4) 5% et 0.25 ml d’hydroxyde de Baryum (Ba(OH)2)0.3N sont ajoutés. Le mélange est ensuite centrifugé (12000tpm : 10minutes), afin d’éliminer les matières en suspension en les précipitant, et directement congelé (-20 oC). Au moment de l’analyse les échantillons sont décongelés , filtrés à travers un filtre de porosité 0.2 m et injectés au chromatographe. Un chromatographe à injecteur automatique Thermo Separation Products Spectra Series Autosampler AS100 équipé du détecteur réfractométrique différentiel spectra Physics Refracto Monitor IV SP 8430 a été utilisé. La séparation est faite par exclusion ionique sur colonne de résine cationique Bio-rad Aminex HPX-87 H, utilisée à 40 oC, 0.4mL/min. La phase mobile est une solution d’acide sulfurique 0.005 M. La courbe d’étalonnage est réalisée avec 5 concentrations pour chaque composé : Glucose : 0.1-12 g/l. Ethanol : 0.1-12 g/l Acide acétique : 0.1-8 g/l Glycérol: 0.1-8 g/l I.2.3. Evaluation de la biomasse cellulaireLa méthode de comptage cellulaire est utilisée pour déterminer le nombre de cellules viables et donc la courbe de croissance.1 ml d’échantillon est pris, dilué dans une solution saline, la dilution est faite jusqu’à l’obtention d’un nombre de cellules comptable. Ensuite une concentration est prise de la dilution finale et elle est cultivée sur une boîte de pétri contenant le milieu gélosé auto clavé ayant la composition suivante:
Les boîtes de pétri sont ensuite mises à l’incubateur pendant 24 heures, puis les colonies de levures peuvent être comptées. Ces cultures ont été répétées 2 ou 3 fois. La méthode de comptage sur cellule de Thoma ( méthode du comptage cellulaire au microscope) a été aussi utilisée afin de s’assurer des résultats obtenus. La cellule de Thoma est compartimentée par des carrés de 0.0025 mm3 (0.05 x 0.05 x 0.1). Chaque 16 « carrés » forment 1 carreau. En comptant K carreaux pour un échantillon dilué D fois, le nombre (N) de cellules /ml dans l’échantillon est relié au nombre n de cellules totales comptées : Ncell/ml= n*D/(16 K)(0.0025*10-3) ou bien N 10 6 cell/ml = n*D/4K En pratique 5 carreaux ont été comptés ( les 4 de la diagonale allant du carreau supérieur gauche à l’inférieur droit et le carreau supérieur droit). L’observation au microscope permet d’évaluer la viabilité des levures, grâce à la coloration au bleu de méthylène. La suspension cellulaire est mélangée volume à volume avec une solution( 0.1 g de bleu de méthylène/ L tricitrate de sodium 2%). Après 10 minutes l’observation au microscope est faite. Les levures mortes apparaissent bleues tandis que celles qui sont viables restent incolores. I.3. DistillationLe montage de colonne alambic de laboratoire a été utilisé. Il comprend :
Une distillation fractionnée a été appliquée, pour un volume de 150 ml des 3 vins de fruit obtenus. Pour chaque échantillon 3 ou 4 distillats, de volume différent ont été prélevés à des températures différentes. I.4. Analyse des échantillons par GCL’appareillage utilisé est : PERKIN ELMER AutosystemDétecteur: FID Phase stationnaire: colonne carbowax 20M-6FT 1/8inch. Matériel de support: chromosorb W-HP 100/120 Phase mobile: Gaz nitrogène (20 ml/minute) Programme variable
L’appareillage utilisé est le Shimadzu GCMS QP 5000 Programme variable : Température initiale 50 oC pour 2 minutes, augmente jusqu’à 260 oC à raison de 7 oC par minute, et reste stable à 260 oC pour 8 minutes. Split Injection : 1 :38, flux : 1.7 ml/min. Colonne DB-1 byJ&W, longueur : 30m, diamètre interne 0.25 mm et épaisseur du film 0.25 microns. Détecteur : Spéctrométrie de masse avec GC, Shimadzu QP 5000. Volume d’injection : 1 microlitre Pression : 100Kpa. CHAPITRE II : RESULTATS II.1. Résultats de la fermentation alcoolique et des paramètres de contrôle La fermentation alcoolique des 3 moûts de fruits s’est déroulée dans les conditions suivantes considérées comme standard pour l’étude :
Les pH initiaux des fruits à fermenter sont : Raisin : 3.5 Pomme :4. Figues : 3.7
Raisin : 170 g/lPommes : 150 g/l Figues : 180g/l II.1.1. Evolution de la croissance cellulaire au cours du tempsDifférents milieux de culture ont été utilisés pour évaluer la croissance des levures et établir les courbes de croissance en fonction du temps. Les figures R1, F1 et P1 de l’annexe 4 représentent respectivement les courbes de croissance cellulaire sur les moûts de raisin, pommes et figues en fonction du temps. Ces courbes font apparaître les temps des différentes étapes de la croissance ainsi que les rendements totaux en biomasse (en millions de cellules/ml) des moûts utilisés. Pour les moûts de raisin et de pommes, la levure commence sa phase de croissance rapide après 20 heures. Sur le moût de figues une accélération rapide de la croissance est observée, après un temps minime .La levure atteint rapidement sa phase de croissance. La levure atteint sa phase stationnaire après 70 heures sur les figues, 160 heures sur le moût de pommes et 118 heures sur celui du raisin. Les rendements totaux en cellules et par ml, des moûts utilisés sont respectivement 110 millions ,216 millions et 220 millions pour la pomme, les figues et le raisin.
Les figures R2 , F2 et P2 de l’annexe 5 visualisent les profils de production de biomasse, de consommation de sucres et de production d’éthanol obtenues dans les conditions définies ci-dessus. Nous pouvons remarquer que le substrat est totalement consommé au bout de 70 heures pour les figues, 118 heures pour les raisins, tandis que pour la pomme une concentration de substrat reste à la fin (12 g/l), et au temps 160 heures la levure atteint sa phase stationnaire et commence à décroître. La concentration en éthanol à la fin de la fermentation est de 40.71 g/l pour la pomme, 83.07 g/l pour les figues et 53.04 g/l pour le raisin. Les vitesses moyennes de production de biomasse (Vx), d’éthanol (Vp) et de consommation de sucre (Vs) sont calculées par : Vx= (Xf-Xo)/t en Mcel/l/h où t est la durée de fermentation en heures Xo et Xf les concentrations initiales et finales en biomasse Vp= (Pf-Po)/ t en g/l/h où Po et Pf sont les concentrations initiales et finales en produits et t est la durée de fermentation en heures Vs= (So-Sf)/t en g/l/h où So et Sf sont les concentrations initiales et finales en substrats et t est la durée de fermentation en heures. Le tableau suivant montre les valeurs de ces vitesses pour les différents fruits fermentés : Tableau I : Les vitesses moyennes de production de biomasse (Vx), d’éthanol (Vp) et de consommation de sucre (Vs)
II.1.3. Production de glycérol et d’acide acétiqueD’autre part, la production de glycérol a été observée sur les 3 moûts, sa concentration a été déterminée par HPLC en cours de la fermentation. Les courbes d’évolution du glycérol (R3, F3, P3) en fonction du temps ont été établies pour les 3 milieux de fermentation (Annexe6). Elle est de l’ordre de 5.17 g/l à la fin de la fermentation dans le vin de raisin, 5.76g/l dans le vin de figues et de 3.6 g/l dans celui des pommes. La production d’acide acétique n’a été détectée que sur le moût de figues. La concentration à la fin de la fermentation est 0.351 g/l. La courbe de production d’acide acétique figure dans l’annexe 7.
II.3. Résultats de l’analyse par GCLes distillats ainsi obtenus ont été analysés par GC, afin d’identifier les alcools supérieurs de chaque variété ainsi que leurs quantités respectives. 2 microlitres de chaque distillat sont injectés au chromatographe. Les résultats sont déterminés par la comparaison du pic de l’échantillon avec celui du standard. Les molécules d’alcools supérieurs qui ont été identifiées i sont : - Dans le distillat de la pomme : l’acétaldéhyde, le méthanol, l’éthanol, le propanol, l’isobutanol, le butanol et l’amyl. - Dans le distillat du raisin : L’acétaldéhyde, l’éthanol, le propanol, l’isobutanol, et l’amyl. - Dans le distillat du vin des figues : L’acétaldéhyde, l’éthanol, le propanol, l’isobutanol, et l’amyl. La quantification de ces molécules est déterminée par le rapport des surfaces des pics de l’échantillon et celles du standard. Les résultats obtenus dans les différents échantillons sont montrés dans les tableaux de l’annexe 8. Aucune corrélation avec la température de collecte du distillat n’a pu être montrée. De ces résultats la concentration moyenne de chaque molécule dans le volume total a été déterminée. Le tableau suivant montre ces concentrations en mg/l: Tableau III : Les concentrations moyennes en mg/l des différents composés supérieurs détéctés dans les différents distillats
II.4. Résultats de l’analyse par GCMS. L’analyse par GCMS a été effectuée pour l’identification qualitative de certains arômes des 3 distillats étudiés. Après plusieurs essais, l’extraction a été faite par de l’hexane ensuite les échantillons ont été injectés à la dose de 1 microlitre avec une tranche de 1 :38 microlitre. Les spectres des chromatogrammes obtenus ont été identifiés par recherche et comparaison aux spectres identiques de la librairie de recherche du MS. Du chromatogramme de l’eau de vie de raisin ont été identifiées les molécules suivantes : Decanoic acid ethyl ester, octanoic acid, undecanoic acid ethyl ester, dodecanoic acid, n-dodecanoic acid, pentadecanoic acid ethyl ester (Annexe 9). D’autre part, dans le distillat des figues, l’octanoeic acid ethyl ester, le decanoic acid ethyl ester, l’undecanoic acid ethyl ester, l’hexadecanoic acid, l’hexadecanoic acid ethyl ester et le méthyl z-5,11,14,17, eicosatetraenoate ont été identifiés. Le chromatogramme ainsi que les différents spectres identifiés sont montrés dans l’annexe10. De même, et d’après le chromatogramme, et les différents spectres de l’annexe11, la présence dans l’eau de vie de pomme de : l’octanoeic acid ethyl ester, decanoic acid ethyl ester , undecanoic acid ethyl ester, pentadecanoic acid ethyl ester, nonadecanoic acid ethyl ester ont été identifiés. De plus l’alpha farnesene, 1,3, 6, 10 dodecatetraene, le 3- methylbutyl decanoate ont été aussi identifiés. La présence d’une molécule phénilique a été aussi détectée (octanoic acid 2- phenyl ethyl ester). D’après les hauteurs des pics , nous pouvons remarquer que les proportions de chaque molécule varient d’un distillat à l’autre. Le tableau IV montre la différence entre les molécules qui ont pu être détectées par GCMS pour les distillats de Raisin, de Pomme et de Figues : Tableau IV : Différence entre les molécules détéctées par GCMS pour les distillats de Raisin, de Pomme et de Figues
CHAPITRE III: DISCUSSION ET CONCLUSION D’après les résultats de la fermentation, nous avons remarqué que la phase de latence de la levure « Sacharomyces cerevisae » est de 20 heures dans le moût de raisin et de pommes et elle est très minime sur celui des figues. De plus le temps total de fermentation est le plus court sur les figues (90 heures) et le plus long chez la pomme (160 heures). Ainsi que les vitesses de production de biomasse, de dégradation du substrat et de production sont les plus rapides pour les figues, et plus lentes chez la pomme. En effet, ces paramètres dépendent de la quantité de l’inoculum et de son âge, des conditions du milieu et de sa composition en substances stimulatrices et en substances inhibitrices. Il s’avère dans ce cas,que c’est la composition du milieu qui joue le rôle principal, étant donné le départ d’une même concentration d’inoculum (2 millions de cellules par ml), ayant le même stade de développement (phase de croissance), et l’opération dans des conditions de milieu très proche (pH de 3.5-4.2, To = 17oC, milieu anaérobique, même agitation). En effet la concentration en substrat (sucres réducteurs) est la plus élevée dans le moût de figues(180g/l), suivi par le moût de raisin(170g/l), et ensuite vient la pomme avec une concentration de 150g/l. En plus de leur concentration, la répartition de ces sucres diffère d’un fruit à un autre, dans les figues, la concentration du glucose est toujours supérieure à celle du fructose. Dans le raisin, ces concentrations sont proches, tandis que dans la pomme, la concentration du fructose est supérieure à celle du glucose. D’après Moumeni, 1997, la levure peut prendre plus de temps à dégrader le fructose surtout quand le milieu du prélevain est essentiellement composé de glucose. La présence de substances inhibitrices tels les phénols (surtout présents dans les pommes) et certains métaux peut aussi ralentir la fermentation.
Une différence entre la composition des différents distillats en alcools supérieurs n’a pas été observée, puisque les 3 eaux de vie contiennent la plupart des molécules identifiées (Acétaldéhyde, méthanol, éthanol, isobutanol, propanol, amyl et n butanol). En effet l’éthanol provient de la dégradation des sucres par les levures qui donne l’acide pyruvique, qui perd une molécule de gaz carbonique pour donner l’acétaldéhyde qui évolue ensuite et donne l’éthanol. Le méthanol provient de la dégradation de la pectine contenue dans la peau, les pépins et les grappes ou tiges des fruits utilisés. L’isobutanol a pour précurseur l’acide aminé valine . La leucine et l’isoleucine sont les précurseurs de l’amyl alcool et les 3 fruits utilisés contiennent ces acides aminés. Elles peuvent être aussi formées à partir des sucres par l’intermédiaire des acides cétoniques correspondants. Les alcools supérieurs constituent un groupe important parmi les composés aromatiques des boissons alcooliques. l’absence de méthanol dans l’alcool de raisin, sa concentration acceptable dans celui de pomme et sa dose élevée dans l’eau de vie de figues sont surtout liées aux traitements de la phase de préfermentation. Durant ce stade, et avant la macération, les raisins ont été égrappés en partie épluchés, les pépins enlevés. Pour les pommes, les pépins ont été enlevés, tandis que les figues ont été macérées telles quelles. La différence a été principalement notée par la concentration moyenne élevée de ces alcools dans l’eau de vie de pommes par rapport aux deux autres, ceci peut être expliqué par le fait qu’une fermentation lente favorise la synthèse des produits d’arômes(vitesse moyenne de croissance est la plus lente chez la pomme 0.59 Mcell/ml) En ce qui concerne la détection des arômes par GCMS, seules les molécules peu volatiles ont été identifiées après extraction dans l’hexane. Les molécules qui ont été détectées dans les 3 distillats sont : decanoic, undecanoic, octanoic acid ethyl ester. Le méthyl z-5, 11, 14, 17 eicosatetraenoate a été seulement identifié dans l’eau de vie de figues, et le 3- méthylbutyl decanoate, et l’octanoic acid-2 phenyl ethyl ester et l’alpha farnesene, 1, 3, 6, 10 dodecatetraene ont été seulement identifiés dans l’alcool de la pomme. En effet les arômes des vins de fruits ont une complexité d’origine et sont composés de plusieurs familles. La plupart sont des composés volatils, et lors de la distillation une bonne partie de ces arômes est perdue. Seuls les moins volatils, restent dans l’eau de vie et lui confèrent sa spécificité. En fait les eaux de vie que nous avons obtenu sentaient l’arôme des fruits de provenance, mais ces produits n’ont pas été détectés et se sont éliminés lors de l’évaporation. Plusieurs méthodes d’extraction d’arômes existent dont la meilleure est « head space », relié à un GCMS. L’extraction liquide -liquide peut aussi être appliquée, mais l’absence de head space, et de technique moderne de déhumidification dans nos laboratoires, ont limité l’application d’une méthode adéquate pour l’extraction. L’extraction par plusieurs solvants(chloroforme, hexane..), suivie d’une évaporation à température ambiante, et ensuite injection sur GCMS ont été appliquées. CONCLUSION Le principal facteur de variation entre les alcools supérieurs de différentes eaux de vies est leur concentration Des autres arômes, seules quelques acides et esters ont été identifiés et ceci par difficulté d’application d’une méthode d’extraction adéquate dans nos laboratoires. En effet, ce travail n’est qu’un premier stade effectué dans un domaine nécéssaire au Liban. Il serait très intéressant de procéder et continuer les recherches en tant pour le contrôle de qualité de l’arack produit que pour l’élaboration de nouvelles eaux de vie provenant de différentes variétés libanaises, et ceci afin d’améliorer la situation au niveau des industries agroalimentaires et ouvrir de nouvelles débouchés pour l’intérieur et l’extérieur. De même d’autres points importants seraient intéressants à rechercher : l’évolution des arômes en fonction des méthodes de distillation (Alambic, colonne, colonne de différentes longueurs, utilisation de charbon actif…), aussi la différence entre les arômes de plusieurs variétés d’un même fruit.. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE Annexe 1 Normes de certains composés de l’Arack de raisin
Source: LIBNOR, 1999 Annexe 2 Matériel ou pilote de fermentation A : Bain Marie thermostaté, agité par un agitateur magnétique B : Erlens Meyers contenant le milieu de culture, bouchés. C : Résistance régulisant la température à 17 oC D : Thermomètre E : Groupe frigorifique de température -20 oC, contenant de glycol afin d’assurer la circulation de l’eau froide si nécessaire Annexe 3 Sur excel courbe d’étalonnage Annexe 4F  igure R1: Variation de la biomasse dans le moût de raisin au cours du temps Figure P1: Variation de la biomasse dans le moût de pommes en fonction du temps  F
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