Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Tehnologii Izotopice si Moleculare

Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Tehnologii Izotopice si Moleculare

Str. Donath 65-103, Cluj-Napoca, Tel: [phone], Fax: [phone]


Studiu asupra mecanismelor de decuplare heteronucleara utilizate in spectroscopia RMN pe solide

(Proiect CERES C3 / 2003)

1. Introducere

Decuplarea de spin reprezinta o componenta esentiala in toate experimentele RMN de inalta rezolutie pe solide [1]. In particular, in conditiile in care interactiunile dintre nucleele speciei detectate si nucleele celorlalte specii prezente in sistem sunt eliminate prin decuplare heteronucleara, calitatea spectrelor RMN poate fi imbunatatita substantial, atat din punct de vedere al sensibilitatii, cat si al rezolutiei spectrale (Fig. 1). Majoritatea aplicatiilor RMN de inalta rezolutie in compusi organici sunt axate pe detectia nucleelor ¹³C si(sau) ¹⁵N, deoarece dispersia deplasarilor lor chimice este mare in comparatie cu cea a protonilor (¹H). Decuplarea heteronucleara consta in aplicarea unor procedee specifice de mediere a interactiunilor dipolare heteronucleare dintre ¹³C(¹⁵N) si nucleele de ¹H, care sunt responsabile de largirea apreciabila (pana la 10-20 kHz) a liniilor RMN [2]. Toate tehnicile RMN moderne pe solide se efectueaza in prezent in conditii de rotatie a probei in jurul unghiului magic (MAS: Magic Angle Spinning). Prin aceasta se obtine decuplarea partiala a interactiunilor de spin anizotrope, si constituie un prim pas in procesul de ingustare a liniilor de absorbtie [3]. Pentru cresterea in continuare a rezolutiei spectrale, MAS trebuie combinat cu aplicarea unor campuri de radiofrecventa (rf) pe canalul ¹H. Pana nu demult singura metoda utilizata in acest scop a fost CWD (Continuous Wave Decoupling), care consta in iradierea spinilor ¹H cu un camp rf puternic (50 – 250 kHz), pe toata durata evolutiei coerentelor de spin asociate heteronucleelor (¹³C, ¹⁵N) [4,5]. Recent s-a demonstrat teoretic, si s-a confirmat experimental, ca performantele de ingustare ale metodei CWD pot fi imbunatatite prin modularea fazei sau a amplitudinii campului de

Fig. 1: Spectrul RMN pe ¹³C al glicinei (NH₃CHCH₂COO) achizitionat (a) in proba statica si in absenta decuplarii, si respectiv, (b) in conditii de MAS (ν_R=10 kHz) si prin decuplare heteronucleara (CWD, cu ν_rf=80 kHz). Spectrele prezentate ilustreaza efectul pe care aceste tehnici il au asupra cresterii sensibilitatii (amplitudinile de linie) si a rezolutiei spectrale, permitand astfel identificarea diferitor grupari chimice din sistemul investigat. In cazul prezentat in figura, liniile gruparilor CH si CH₂ (marcate isotopic), sunt foarte bine rezolvate dupa aplicarea MAS si a decuplarii heteronucleare

decuplare. Astfel, s-au dezvoltat noi tehnici de decuplare heteronucleara, cum ar fi TPPM (Two Pulse Phase Modulation) [6] sau XiX (X inverse X) [7], care conduc in multe cazuri la performante de decuplare superioare metodei traditionale CWD.

Metodele enuntate mai sus conduc la ingustari cu trei ordine de marime a largimii de linie, ajungandu-se in final la valori reziduale cuprinse intre 10 si 30 Hz (in functie de gruparea chimica considerata). Performantele in imbunatatirea rezolutiei spectrale sunt suficiente pentru majoritatea tehnicilor RMN utilizate la investigarea sistemelor de spini relativ restranse. Astfel de aplicatii sunt utile de exemplu in procesul dezvoltarii de materiale avansate: aici spectroscopia RMN pe solide ofera tehnici experimentale eficiente de caracterizare structuarala si dinamica deoarece numarul parametrilor necunoscuti, cu relevanta din punct de vedere al functionalitatii, este relativ restrans si, in consecinta, acestia pot fi determinati cu o foarte buna acuratete prin marcare izotopica selectiva cu ¹³C si(sau) ¹⁵N a pozitiilor de interes din macromolecula sau complexul supramolecular investigat. In ultima perioada exista insa o tendinta din ce in ce mai accentuata inspre utilizarea spectroscopiei RMN de inalta rezolutie pe solide in scopul determinarii structurii tri-dimensionale (3D) complete a unor compusi biologici macromoleculari cu importanta practica deosebita (cum ar fi proteinele de membrana), si a caror structura nu poate fi obtinuta prin metode traditionale precum difractia de raze X, sau spectroscopia RMN pe lichide. Investigarea unor astfel de sisteme este motivata de importanta pe care intelegerea conexiunii dintre structura 3D a proteinelor si mecanismul lor de functionare o are asupra eradicarii multor boli, in prezent considerate incurabile.

Extinderea aplicatiilor inspre domeniul biotehnologiilor constituie o directie prioritara, insa metodologia necesara unor astfel de aplicatii este inca insuficient dezvoltata. Astfel, experimentele efectuate pana in prezent, in special pe sisteme poli-peptidice model, au aratat ca principalele obstacole in utilizarea spectroscopiei RMN pe solide pentru determinarea curenta a structurii spatiale 3D in proteine sunt urmatoarele:

1. 
   In proteine, unde sunt necesare sute de distante internucleare pentru a rezolva complet o structura spatiala 3D, strategia marcarii izotopice selective este extrem de costisitoare si de indelungata: in consecinta, ea trebuie inlocuita prin marcarea multipla (sau chiar uniforma) a probei cu ¹³C si ¹⁵N
   
2. 
   Prin marcare multipla se creaza sisteme multi-spin, caracterizate de o dinamica mult mai complexa, ceea ce reclama inlocuirea tehnicilor RMN calsice cu metode noi, care sa permita extragerea simultana a unui cat mai mare numar de parametri structurali din spectrele RMN de corelatie [8]
   
3. 
   Marcarea multipla (uniforma) cu ¹³C(¹⁵N) conduce la degradarea substantiala a sensibilitatii si rezolutiei spectrale (vezi Fig. 2), ceea ce face imposibila aplicarea noilor metode RMN de investigare structurala
   

In acest context, prezentul proiect abordeaza un aspect extrem de precis, dar cu impact major in procesul ulterior de dezvoltare de noi metode RMN, cu aplicabilitate in domeniul biotehnologiilor. Respectiv, vom elabora modele teoretice (analitic si programe de simulare numerica) capabile sa descrie dinamica de spin in sisteme complexe, precum proteinele marcate uniform cu ¹³C(¹⁵N), iar pe baza lor sa dezvoltam metode specifice de imbunatatire a rezolutiei spectrale. Proiectul porneste de la un concept nou in problematica decuplarii de spin, si beneficiaza de o abordare metodologica moderna. In particular, se porneste de la premiza ca exista mecanisme coerente ale dinamicii de spin, care nu pot fi identificate in cadrul modelelor semi-fenomenologice existente, si care pot fi exploatate pentru imbunatatirea in continuare a performantelor de decuplare.

Fig. 2: Spectrele RMN pe ¹³C ale tri-peptidei Met-Leu-Phe (MLF: 3 aminoacizi) si poli-peptidei SH-3 (62 de aminoacizi) in proteina α-Spectrin, ambele marcate uniform cu ¹³C si ¹⁵N. Aceste doua exemple ilustreaza efectul de degradare al sensibilitatii si rezolutiei spectrale cu cresterea complexitatii sistemului de spini (compusului macromolecular) investigat.
In conformitate cu obiectivele acestei etape in derularea proiectului, am efectuat in primul rand o sinteza la zi a problematicii decuplarii de spin in spectroscopia RMN pe solide. Pe baza acesteia, am identificat principalele modele teoretice utilizate in prezent pentru descrierea mecanismelor de decuplare, si aproximatiile pe care ele se bazeaza, iar in final s-au elaborat concluzii cu privire la posibilitatile lor de imbunatatire. Rezultatele sintezei sunt prezentate in Sectiunea 2. Pornind de la concluziile sintezei, in Sectiunea 3, formalismului Floquet de analiza a dinamicii de spin in solide rotite in jurul ungiului magic a fost extins la cazul particular al decuplarii de spin. In final, utilizand cateva exemple concrete, am demonstrat ca acest formalism permite tratarea mai riguroasa a mecanismelor de decuplare prin includerea efectelor coerente de ordin superior.
2. Decuplarea Heteronucleara in Solide Organice
Metode Experimentale

Liniile de absorbtie RMN obtinute pe probe solide statice sunt in general foarte largi, datorita anizotropei mari a principalelor interactiuni de spin. De exemplu, in cazul nucleelor cu spin ½ acestea sunt reprezentate de interactiunile dipolara si de ecranare chimica (deplasare chimica). Deoarece partile dependente de coordonatele spatiale ale acestor interactiuni pot fi reprezentate in functie de tensorii sferici ireductibili de rang 2, prin rotirea probei in jurul unghiului magic (θ_M = 54.7⁰) componenta statica devine zero, iar interactiunile vor fi in intregime modulate periodic, cu frecventele ungiulare ±ω_R, si ±2ω_R. In functie de caracterul omogen sau neomegen al hamiltonianului de spin in conditii de MAS, efectul de ingustare produs de rotatia probei asupra liniilor RMN este diferit. Matematic, interactiunea este definita neomogena (sau omogena) dupa cum hamiltonianul evaluat la doua momente arbitrare de timp comuta, respectiv nu comuta, cu el insusi [9]. Cazul cel mai simplu este cel al interactiunilor neomogene (de exemplu, deplasarea chimica anizotropa, interactiunea dipolara heteronucleara, si interactiunea dipolara homonucleara in prechi izolate de spini), unde ingustarea liniilor RMN se obtine relativ usor deoarece largimea de linie reziduala nu depinde de frecventa de rotatie. La cealalta extrema, a interactiunilor omogene (cuplajele dipolare homonucleare in sisteme multi-spin), se obtine doar o ingustare progresiva cu cresterea frecventei de rotatie, ajungandu-se ca in regimul de rotatie rapida (cand frecventa de rotatie depaseste dublul celei mai mari constante de interactiune din sistem) largimea reziduala de linie sa aiba o dependenta liniara de tipul Δν = a/ω_R + b.

Datorita abundentelor naturale scazute ale izotopilor ¹³C (1.1 %) si ¹⁵N (0.4 %), interactiunile in care spinii lor nucleari sunt implicati in compusi organici sunt neomogene, si anume, daplasarea chimica, si interactiunile dipolare heteronucleare cu spiniii abundenti (99.3 %) de ¹H. Daca se iau in considerare insa si interactiunile dipolare homonucleare foarte puternice dintre protoni, precum si caracterul multi-spin al sistemului pe care acestia il definesc, hamiltonianul total este in realitate omogen. In aceste conditii, chiar daca efectul cuplajelor ¹H-¹H asupra largimilor de linie RMN ale ¹³C(¹⁵N) este unul indirect, el este suficient de puternic incat sa nu poata fi neglijat. Comportarea de tip omogen a largimii de linie in prezenta protonilor este ilustrata in Fig. 3, pe exemplul liniilor ¹³C ale gruparilor CH si CH₂ masurate in L-alanina unde s-a obtinut o dependenta de tipul Δν = a/ω_R + b (caracteristica regimului de rotatie rapida) pentru ν_R > 10 kHz [10]. Analiza acestor rezultate ne conduce la concluzia ca rezolutia spectrala obtinuta numai sub MAS, chiar la frecventele de rotatie cele mai inalte (ν_R = 50 kHz), este insuficienta pentru majoritatea aplicatiilor RMN pe compusi organici. Largimile reziduale masurate la aceasta frecventa sunt inacceptabil de mari (Δν = 500 si 750 Hz, pentru CH, si respective CH₂), ceea ce face absolut necesara aplicarea unor metode de decuplare suplimentare.


Fig. 3: Variatia cu frecventa de rotatie a largimii liniilor ¹³C RMN corespunzatoare gruparilor CH si CH₂ in L-alanina. In ambele cazuri regimul de rotatie rapida este atins la frecvente mai mari de 10 kHz, dupa cum demonstreaza fitarea largimilor reziduale cu o dependenta de tipul Δν = a/ν_R + b
Pana relativ recent (1995) decuplarea heteronucleara a fost realizata aproape in mod exclusiv prin metoda CWD (Continuous Wave Decoupling), care consta in iradierea la frecventa de rezonanta a protonilor cu un camp rf intens (50 – 250 kHz) pe toata durata achizitiei spectrului RMN al heteronucleului investigat (¹³C sau ¹⁵N). Succesul metodei CWD s-a datorat faptului ca aceasta este extrem de simpla si robusta din punct de vedere experimetal (adica putin sensibila la variatii ale parametrilor campului de decuplare). Reprezentarea schematica a CWD, este ilustrata in Fig. 4a pe baza unui exemplu foarte simplu, respectiv un experiment de un puls, prin intermediul caruia sunt achizitionate spectrele 1D RMN de inalta rezolutie al nucleelor ¹³C(¹⁵N) in solide. Comparativ cu largimile reziduale in conditii de MAS, utilizarea CWD conduce la o ingustare suplimentara substantiala, cu peste un ordin de marime.

In campuri magnetice moderate (intre 10 – 15 T), si pe compusi organici relativ simpli (sau compusi macromoleculari marcati selectiv cu ¹³C si/sau ¹⁵N), ingustarea obtinuta cu ajutorul CWD este suficienta pentru ca majoritatea liniilor RMN din spectru sa fie complet rezolvate: aceasta permite diferentierea tuturor gruparilor chimice din sistem si face astfel posibila utilizarea cu suces a multor experimente RMN de corelatie care ofera informatii structurale si dinamice locale. Exista insa si numeroase aplicatii recente, in special din domeniul biotehnologiilor, unde ingustarea produsa de CWD este insuficienta pentru a rezolva liniile din spectrul RMN, iar cauzele care conduc la degradarea rezolutiei spectrale in astfel de siteme biologice au fost enumerate in sectiunea precedenta. Din acest motiv, incepand cu a doua jumatate a anilor ’90 au inceput studii intense avand drept scop dezvoltarea unor metode de decuplare heteronucleara mai performante, iar solutia tehnica gasita a fost cea de inlocuire a campurilor rf continue prin campuri a caror amplitudine si(sau) faza sunt modulate periodic. Astfel, pana in prezent au fost testate numeroase scheme de modulare, iar unele dintre ele conduc intr-adevar la noi metode de decuplare heteronucleara, cu performante imbunatatite fata de CDW.

Prima metoda bazata pe noul concept a fost introdusa in 1995 [6] si se numeste TPPM (Two Pulse Phase Modulation); schematic, acesta metoda este ilustrata in Fig. 4b, unde se observa ca secventa de baza consta din doua pulsuri de unghi θ, avand intre ele o diferenta de faza Δφ. Valoarile celor doi parametri pentru care se obtine ingustarea de linie cea mai buna depind atat de compusul investigat cat si de frecventa de rotatie a probei, astfel incat pentru fiecare experiment in parte ele trebuie optimizate pentru a obtine performanta maxima (de exemplu, considerand frecvente de rotatie uzuale intre 10 si 15 kHz, valorile optime ale lui θ si Δφ se situeaza in jurul a 180⁰, si respectiv intre 15-30⁰). Necesitatea de a optimiza doi parametri constituie insa un dezavantaj destul de mare



Fig. 4: Reprezentarea schematica a unui experiment RMN simplu de un puls pentru achizitia spectrelor RMN 1D de inalta rezolutie ale ¹³C pe solide. Decuplarea heteronucleara se realizeaza cu ajutorul metodei CWD (a), si respective TPPM (b)
al metodei TPPM, asfel incat recent s-a introdus o noua metoda (numita XiX [7]) in care, fixand diferenta de faza la Δφ = 180⁰, este necesara doar optimizarea duratei τ a celor doua pulsuri. Desi rezolutia spectrala obtinuta este in general aceeasi ca si in cazul TPPM, metoda XiX are avantajul unei implementari experimentale mai simple. Utilizand acelasi principiu de baza, al modularii campului de decuplare, dupa TPPM au fost dezvoltate si alte secvente in care, de exemplu, este modulata amplitudinea (SPARC [11], SPINAL [12]), sau altele in care sunt modulate simultan atat amplitudinea cat si faza (FMPM [13], AM-TPPM [14]) campului rf. Cu toate ca sunt mult mai sofisticate, noile metode nu conduc insa la o imbunatatire semnificativa rezolutiei in comparatie cu TPPM sau XiX, astfel incat acestea din urma sunt preferate in practica datorita simplitatii lor.

Din punct de vedere metodologic, cele doua strategii enuntate mai sus sunt singurele tehnici de decuplare heteronucleara utilizate in prezent in spectroscopia RMN de inalta rezolutie pe solide. In ambele cazuri, pana nu demult tendinta era de a utiliza campuri de rf cu amplitudinea cat mai mare (pana aproape de 200-250 kHz), pentru a beneficia de rezolutia maxima posibila. Studii recente, atat experimentale cat si teoretice,

Fig. 5: Spectrul RMN 1D al ¹³C intr-o proba de cristal lichid (5CB) unde decuplarea s-a realizat (de la stanga la dreapta) cu ajutorul metodlor CWD, TPPM si XiX
au aratat insa ca esential pentru ingustarea obtinuta este nu valoarea absoluta a amplitudinii campului rf, ci valoarea lui relativa in raport cu frecventa de rotatie a probei. In particular, s-a observat ca in realitate se poate utiliza nu numai strategia traditionala, respectiv frecvente de rotatie mici si amplitudini mari ale campului rf, ci putem exploata si extrema cealalta, a frecventelor de rotatie foarte mari (50 kHz) combinate cu campuri rf slabe (pana la 10 kHz). Desi conceptual nu introduce nimic nou, acesta ultima strategie este foarte utila in practica, mai ales daca se tine cont de tendinta actuala de a utiliza campuri magnetice din ce in ce mai inalte (20-25 T), unde sunt necesare intr-adevar frecvente mari de rotatie ale probei.

Cantitativ, cresterea gradului de ingustare prin metodele TPPM si XiX comparativ cu CWD nu se poate exprima in mod uniform pentru toate situatiile posibile, acesta depinzand de multi parametri, precum valoarea campului magnetic static, frecventa de rotatie a probei, dispersia deplasarilor chimice izotrope a protonilor, etc. In anumite situatii se poate obtine o ingustare suplimentara de pana la 100%, iar in altele aproape deloc. De exemplu, in Fig. 5 este ilustrat un caz concret in care utilizarea TPPM si XIX conduce la imbunatatirea semnificativa a rezolutiei in comparatie cu CWD. Cu toate progresele inregistrate in urma modularii campului de decuplare, noile metode nu sunt inca suficient de performante pentru a permite o rezolvare a liniilor spectrale in multe cazuri cu relevanta pentru aplicatiile biologice, si in special in proteine marcate uniform cu ¹³C(¹⁵N). Exemplul cel mai ilustrativ in acest sens este prezentat in Fig. 2b, unde se observa ca nici una dintre liniile ¹³C RMN corespunzatoare polipeptidei SH3 (62 reziduuri aminoacide) nu este complet rezolvata, desi acest spectru a fost achizitionat in conditiile decuplarii prin TPPM.

Modele Teoretice

Progresele din ultima decada obtinute in dezvoltarea de noi metode de decuplare au fost posibile atat datorita eforturilor in plan experimental, dar si elaborarii de modele teoretice adecvate. In cele ce urmeaza vom face o prezentare sintetica a principalelor modele existente, scotand in evidenta rolul lor in intelegerea principalelor mecanisme specifice decuplarii de spin, dar si deficientele care inca exista in explicarea catorva comportari experimentale.

O tratare riguroasa a evolutiei in conditii de MAS a heteronucleelor ¹³C(¹⁵N), reprezentate prin operatorii de spin S_α (α = x, y sau z), in prezenta nucleelor ¹H (I_α) si a campului rf de decuplare se face plecand de la hamiltonianul total de interactiune (in sistemul dublu rotitor)

(1)

unde

(2)

reprezinta deplasarile chimice izotrope (m = 0) si anizotrope (m =± 1, ± 2) ale fiecarui spin S,

(3)

sunt aceleasi marimi corespunzatoare spinilor I, iar

(4)

(5)

(6)

reprezinta hamiltonienii interactiunilor heteronucleare ¹³C-¹H, si respectiv homonucleare ¹H-¹H si ¹³C-¹³C. Componentele Fourier m = ± 1, ± 2 se refera la termenii dipolari, a caror constante de interactiune sunt date de

(7)

si depind de geometria sistemului prin intermediul distantelor internucleare r_jk si a unghiurilor _jk dintre vectorii internucleari r_jk si directia axei de rotatie a probei. Componentele izotrope (m = 0) reprezinta interactiunile spin-spin scalare (asa numitele cuplaje J), iar constantele lor de interactiune, J^jk_AB, depind de tipul de nuclee implicate (A = I,S si B = I,S) si de numarul de legaturi chimice dintre ele (in general, doar cuplajele intre nuclee legate direct sunt suficent de puternice incat sa produca efecte observabile). Ultimul termen in ec.(1) reprezinta hamiltonianul interactiunea dintre spinii ¹H si campul rf de decuplare, iar expresia sa explicita depinde metoda utilizata efectiv in practica. In cazul metodei CWD, H_rf este independent de timp si expresia lui este data de

(8)

unde ω₁ reprezinta amplitudinea (exprimata in kHz) a campului de rf.

Largimea reziduala a unei linii de absorbtie RMN oarecare, de exemplu a spinului S_k, se deduce din transformata Fourier a semnalului de inductie (FID – Free Induction Decay) asociat, si anume

(9)

unde <…> include atat mediarea peste variabilele de spin (Trace), cat si peste varibilele spatiale (mediere pe pulbere), iar superoperatorul de evolutie (in spatial Liouville) intre doua momente arbitrare de timp, t₁ si t₂, este evaluat din solutia ecuatiei Liouville – von Neumann [1],

(10)

respectiv,

(11)

unde T este operatorul Dyson de ordonare temporala. Prezenta acestuia se datoreaza caracterului omogen al hamiltonianului (1) in sensul definit de Maricq si Waugh [9], si face imposibila rezolvarea analitica exacta a ec. (9). In consecinta, pentru a avea totusi o intelegere intuitiva a fenomenelor implicate in procesul de decuplare, a fost necesara elaborarea de modele alternative, simplificate, de exemplu modelul teoretic dezvoltat de Ernst si Meier [15]. Acest model se bazeaza pe urmatoarele aproximatii:

1. 
   Efectul interactiunilor dintre nucleele de ¹³C(¹⁵N) se considera neglijabil deoarece patratul factorilor giromagnetici ai acestora este mult mai mic decat cel al protonilor, iar o trunchiere suplimentara a termenilor de flip-flop din relatia (6) apare datorita diferentetelor relative mari dintre deplasarile chimice izotrope. In aceste conditii, procesul de decuplare poate fi studiat pentru un singur heteronucleu, iar rezulatatul generalizat la toti ceilalti
   
2. 
   Interactiunile dipolare dintre protoni, ec. (7), sunt tratate in mod fenomenologic, prin intermediul unui superoperator de difuzie de spin,
   
3. 
   
   
4. 
   Numai cuplajul dintre un heteronucleu si protonul cel mai apropiat se considera in mod explicit in expresia (4), iar interactiunea acestuia din urma cu toti ceilalti protoni este tratata prin intermediul procesului de difuzie de spin
   

In aceste conditii problema se simplifica in mod apreciabil: ea consta in analiza spectrului asociat unui spin S in interactiune cu un singur proton I, asupra caruia se aplica un camp rf de intensitate ω₁ si este cuplat la un rezervor termic definit de toti ceilalti protoni din sistem. Analiza spectrala se face plecand de la ec. (9), care acum poate fi rezolvata exact, ea conducand la doua cazuri distincte in functie de valorile relative ale ratei, k, asociate procesului de difuzie de spin, si frecventa efectiva ω_eff(t), definita de

(12)

unde dependentele explicite de timp ale constantelor de interactiune se pot determina din relatiile (3) si (7). In particular,

1. 
   Daca k < ω_eff(t) spectrul consta in doua linii avand valori diferite ale frecventei de rezonanta, si anume
   

si largimi reziduale identice,

precum si intensitati egale.

2. 
   Daca k > ω_eff(t) se obtin tot doua linii, cu aceeasi frecventa de rezonanta, si anume
   

insa atat largimile reziduale,

cat si intensitatile lor sunt diferite (intensitatea liniei mai largi este mai mica, si ea

devine neglijabila pe masura ce creste valoarea ratei de difuzie de spin, k).

Parametrii determinati mai sus reprezinta valori instantanee, corespunzatoare unei orientari arbitrare a vectorului internuclear in raport cu directia campului magnetic static, B₀. Pentru a avea o imagine completa asupra spectrului masurat experimental, trebuie efectuata in final atat o mediere pe pulbere, cat si o mediere temporala, pe durata unei perioade de rotatie, τ_R. Considerand cazul decuplarii la puteri mari de radiofrecventa (ω₁ >> ω_R) medierea temporala poate fi realizata cu ajutorul teoriei hamiltonainului mediu [4]. Cu toate simplificarile pe care le include, acest model confirma in linii mari rezulatatele experimentale privind variatiei largimii de linie reziduala in functie de rata difuziei de spin, iar micile diferente existente intre acestea si spectrele simulate utilizand relatiile de mai sus sunt atribuite aproximatiilor utilizate. O astfel de analiza este ilustrata in Fig. 6, unde variatia parametrului k a fost obtinuta in practica prin variatia frecventei de rotatie a probei, deoarece s-a constatat experimental ca in regimul de rotatie rapida intre aceste doua marimi exista o dependenta liniara. In plus, pe baza modelului descris mai sus se poate identifica si factorul cu contributia cea mai insemnata la largirea reziduala a liniilor RMN in cazul decuplarii prin metoda CWD, si anume, interferenta dintre deplasarile chimice (izotrope si anizotrope) ale protonilor si interactiunnile heteronucleare (dipolare si cuplajele J). Pornind de la aceste rezultate se explica si performantele superioare ale

Fig. 6: (a) Variatia largimii reziduale a liniei RMN [2-¹³C] in alanina cu frecventa de rotatie a probeiin conditii de decuplare prin metoda CWD (ν_rf = 75 kHz). (b) Simulare teoretica pe baza modelului lui Ernst si Meier [], unde valorile ratei k₁ asociata difuziei de spin in sistemul ¹H a fost determinata experimental tinand cont de dependenta liniara dintre aceasta si frecventa de rotatie a probei
metodelor TPPM (si a celor derivate), deoarece dependenta temporala indusa de modularea campului de decuplare este transferata asupra termenilor de interferenta, conducand astfel la o mediere a lor.

Analiza teoretica a decuplarii prin modularea campului rf se poate face cu ajutorul unui model simplificat, asemanator celui prezentat mai sus in cazul CWD, unde insa trebuie tinut cont de faptul ca hamiltonianul H_rf in ec. (8) devine explicit dependent de timp. In cele ce urmeaza prezentam sintetic principalele rezultate ale unui asemenea modelari doar pentru metoda TPPM, acestea putand fi apoi usor particularizate si la alte metode care se bazeaza pe modularea amplitudinii si(sau) fazei campului de decuplare, deoarece ele nu difera mult din punct de vedere conceptual fata de TPPM. Considerand deci iarasi cazul unui spin S in interactiune cu un singur proton, I, cuplat la un rezervor termic definit de toti ceilalti protoni din sistem, si a unui hamiltonian rf specific modularii in faza conform TPPM

(13)

unde s(t) = ±1, dupa cum t este asociat primului, sau respective celui de-al doilea, puls din secvanta TPPM (vezi Fig. 4b). Pentru a putea face o comparatie cu rezultatele obtinute pentru CWD, in continuare vom trata doar cazul decuplarii la campuri inalte, caz in care putem aplica teoria hamiltonianului mediu. Termenul de ordin zero in seria perturbativa aferenta defineste doar pozitia liniei de rezonanta a spinului S, ca si la CWD, iar largirea sa reziduala apare doar in ordine superioare. Evident, ponderea cea mai insemnata in acest proces o vor avea termenii de ordin intai, in timp ce contributiile termenilor de ordin mai inalt sunt in general considerate neglijabile [5]. Asadar, termenul de ordin inatai in expersia hamiltonianului mediu pentru decuplarea prin metoda TPPM este data de [6],

(14)

unde semnificatia marimilor care apar in relatie este aceeasi ca si in cazul discutat mai sus. O comparatie directa cu expresiile similare care definesc largimea reziduala in cadrul metodei CWD releva in primul rand ca acestea difera prin factorul 2tg(φ/2)/π, si explica ingustarea suplimentara obtinuta prin TPPM. De exemplu, pentru φ = 40⁰ obtinem o largime de linie sub TPPM mai mica de aproximativ patru ori in comparatie cu valoarea specifica CWD: acest fapt nu corespunde insa intru totul constatarilor experimentale, deoarece in practica nu s-au obtinut factori de ingustare mai mari de 2. Astfel, concluziile desprinse din analiza relatiei (14) trebuie privitre in contextual aproximatiilor incluse in modelul analitic utilizat, si in primul rand trebuie tinut cont de faptul ca la valori prea mici ale fazei φ apar probleme de convergenta a seriei perturbative care rezulta prin aplicarea teoriei hamiltonianului mediu. Rezultatele obtinute cu ajutorul modeluilui

Fig. 7: (a) Variatia largimii reziduale a liniei RMN [2-¹³C] in alanina cu frecventa de rotatie a probeiin conditii de decuplare prin metoda TPPM (ν_rf = 75 kHz, θ=180⁰, φ=30⁰). (b) Simulare teoretica pe baza relatiei, unde valorile ratei k₁ asociata difuziei de spin in sistemul ¹H a fost determinata experimental tinand cont de dependenta liniara dintre aceasta si frecventa de rotatie a probei
analtic de mai sus sunt insa extreme de utile pentru o analiza calitativa a mecanismelor de decuplare specifice metodei TPPM. In plus, relatia (14) explica in mod corect variatia mica a largimii de linie reziduala in functie de frecventa de rotatie a probei (vezi Fig. 7), rezultat ce constituie inca un argument in favaoarea utilizarii metodei TPPM pentru decuplarea heteronucleara.

In final mentionam ca toate modelarile analitice ale procesului de decuplare de spin vor putea furniza in cel mai bun caz o descriere calitativa a fenomenelor implicate. Motivul principal il constituie complexitatea deosebita a dinamicii de spin sub actiunea hamiltonianului (1) in conditii de rotatie a probei in jurul unghiului magic (MAS). De exemplu, analiza eficientei decuplarii prin metoda TPPM (Fig. 9) nu va putea fi

Fig. 8: (a) Variatia intensitatii integrale a liniei RMN [2-¹³C] in alanina in functie de durata pulsurilor τ_p sifaza lor relativa φ in cadrul unei secvente TPPM (ν_rf = 75 kHz). Acesta dependenta permite optimizarea decuplarii prin TPPM deoarece intensitatile de linie mai mari indica ingustarea lor, si implicit, constituie o masura a eficientei decuplarii de spin. (b) Aceeasi dependenta ca la (a), insa obtinuta prin simulare numerica exacta efectuata pe un sistem de spini simplificat, corespunzator unei grupari CH

descrisa ajutorul niciunui model teoretic simplificat. In schimb, dupa cum se observa din Fig. 8b, o analiza cantitativa poate fi obtinuta utilizand simulari numerice exacte ale dinamicii de spin sub actiunea hamiltonianului (1).

4. Extinderea Formalismului Floquet la Modelarea Decuplarii de Spin
Desi modelarile analitice nu ofera o descriere cantitativa a efectelor observate in urma decuplarii heteronucleare, ele au avantajul ca pot furniza informatii precise asupra cauzelor care determina aceste efecte si, in ultima instanta, ne permite identificarea de mijloace specifice prin care sa diminuam (eliminam) procesele ce contribuie semnificativ la degradarea eficientei de decuplare. Prin comparatie, simularile numerice in spatial Hilbert conduc la rezultate cantitative din ce in ce mai exacte (pe masura cresterii numarului de spini care pot fi incorporati in simulare), insa sunt complet ineficiente din punct de vedere al interpretarii lor fizice. Cu alte cuvinte, o analiza bazata doar pe simulari numerice are putine sanse sa conduca la elaborarea de noi metode de decuplare: in acest scop, de exemplu este mult mai utila definirea unei strategii bazata pe combinarea dintre un model analitic simplificat, care sa ofere informatii calitative cu



Fig. 9: Dependenta eficientei de decuplare prin metoda CWD in functie de raportul dintre puterea campului de decuplare ν_rf, si frecventa de rotatie, ν_r. Rezultatele au fost extrase din spectrele RMN al ¹³C in glicina
privire la semnificatia fizica a fenomenelor observate, si simulari numerice, prin intermediul carora sa putem verifica cantitativ eficienta diferitelor solutii propuse.

Masura in care modele prezentate anterior sunt capabile sa ofere o imagine cat mai fidela a proceselor implicate rezulta din modul in care ele reusesc sa explice comportarile observate experimental. Anterior am prezentat o serie de comportari experimentale care se regasesc in modelarea teoretica, insa aici trebuie amintit ca sunt si alte caracteritici importante ale decuplarii prin CWD sau TPPM, precum modularea cu frecventa de rotatie a curbei care exprima eficienta de decuplare in functie de intensitatea campului rf (vezi Fig. 9), sau efectele de ordin superior asupra largirii reziduale a liniilor RMN, care nu pot fi explicate pe baza modelelor existente. Asadar, dezvoltarea de noi modele teoretice, capabile sa ofere o descriere mai completa a mecanismelor decuplarii heteronucleare, reprezinta o conditie necesara in procesul ulterior de elaborare a unor metode de decuplare mai performante. Pentru realizarea acestui obiectiv am efectuat in primul rand o analiza detaliata a principalelor rezultate raportate pana in prezent in literatura de specialitate. In cadrul acesteia am evidentiat in mod special: (i) formalismul de calcul utilizat, (ii) aproximatiile introduse, si (iii) gradul de concordanta intre predictiile modelelor teoretice si evidentele experimentale. Rezultatele analizei sunt expuse mai sus in forma unei sinteze la zi a problematicii decuplarii de spin heteronucleare. Plecand de la deficientele constatate, am analizat modul in care au fost rezolvate probleme similare in analiza dinamicii de spin corespunzatoare diferitor aplicatii ale spectroscopiei RMN pe solide. In final, concluziile studiilor efectuate pot fi sintetizate in felul urmator:

1. 
   Cauzele posibile pentru care exista neconcordante intre model si anumite comportari experimentale sunt reprezentate atat de formalismul de calcul utilizat, respectiv teoria hamiltonianului mediu, cat si de aproximatiile utilizate efectiv in calcule
   
2. 
   Intre cele doua, rolul determinant il are totusi formalismul utilizat: in general, este cunoscut faptul ca aplicarea teoriei hamiltonianului mediu la analiza dinamicii de spin sub MAS nu poate pune in evidenta procese modulate de rotatia probei
   
3. 
   O alternative la formalismul bazat pe teoria hamiltonianului mediu o reprezinta utilizarea formalismului Floquet, deoarece aceasta prezinta avantajul ca efectele de modulare pot fi descrise in mod explicit. In cadrul grupului nostru a fost dezvoltata o varianta a formalismului Floquet de analiza a dinamicii de spin in spatiul Liouville, care este extreme de convenabila pentru modelarea teoretica a experimentelor RMN efectuate in conditii de MAS [16]. Ulterior, acest formalism a fost generalizat la cazul modularilor cu frecvente multiple, si a fost apoi utilizat in practica pentru analiza spectrelor ¹H MAS [17], a experimentelor CRAMPS [18], precum si a dinamicii de spin in experimente de tip MQ-MAS ale coerentelor de mai multe quante [19].
   

Plecand de la concluziile enuntate mai sus, o prima etapa importanta in cadrul prezentului proiect o reprezinta extinderea formalismului Floquet, care a fost dezvoltat anterior de catre grupul nostru [16], la cazul concret al fenomenelor specifice decuplarii de spin in rezonanta magnetica nucleara. Ulterior, acesta va fi folosit in scopul de elabora modele teoretice alternative de analiza a decuplarii heteronucleare. Existenta a doua aspecte distincte in cadrul acestui proces este motivata de faptul ca formalismul mentionat ofera doar un cadru general de investigare a fenomenelor modulate periodic in timp si, in consecinta, relatiile pe baza carora sunt evaluati diferiti parametri spectrali trebuie mai intai adaptate conditiilor particulare ale problemei in studiu.

In continuare vom aborda doar primul dintre cele doua aspecte mentionate mai sus, urmand ca relatiile obtinute in cursul acestei analize sa fie utilizate in etapa viitoare drept puncte de plecare in elaborarea de noi modele teoretice ale decuplarii heteronucleare. Concret, mai intai consideram cazul hamiltonienilor de interactiune (1)-(7), in absenta campului rf de decuplare. In aceste conditii, nu este necesara nici o transformare, ei putand fi inserati direct in forma actuala in cadrul seriilor perturbative asociate hamiltonianului efectiv si a coeficientilor modulati de frecventa de rotatie (expresiile explicite ale acestor serii de puteri sunt prezenatate in anexa ref. [16]). Daca se considera insa si prezenta campului de decuplare pe canalul spinilor ¹H, hamiltonienii care depind in mod explicit de operatorii de spin I_α vor trebui sa fie transformati in prealabil intr-o reprezentare de interactiune definita de H_rf. Pentru a putea efectua in final o comparatie directa cu rezulatatele modelelor prezentate in sectiunea precedenta, in continuare ne vom limita la analiza metodelor CWD si TPPM. In aceste cazuri vom folosi pentru transformarea la reprezentarea de interactiune hamiltonienii H_rf dati de relatiile (8), si respectiv (13). Fara a intra in detalii de calcul, mai jos redam, separat pentru fiecare dintre aceste metode, expresiile hamiltonienilor de spin rezultati in urma transformarii

(14)

unde marimile scrise caligrafic (in cazul de fata hamiltonianul) sunt reprezentate in imaginea de interactiune.

4.1 Metoda CWD

Aplicand transformarea (14), unde H_rf este dat de relatia (8), obtinem urmatoarele expresii

pentru reprezentarea in imaginea de interactiune a hamiltonienilor de spin care sunt afectati de prezenta campului rf de decuplare. Comparativ cu relatiile (3)-(5), corespunzatoare reprezentarii Schrődinger a acelorasi hamiltonieni, se observa ca acum avem o modulare multipla, cu frecventele ω_n, unde ω₁ = ω_R + ω_rf, ω₂ = ω_R – ω_rf, ω₃ = 2ω_R + ω_rf si ω₄ = 2ω_R – ω_rf. De asemenea, noile componentelor Fourier, _m, vor fi diferite de componentele similare din ec. (3)-(5), iar expresiile lor explicite se pot determina usor tinand cont de rezultatul transformarii (14) asupra operatorilor de spin I_α, si anume

(16)

Dupa ce termenii din hamiltonianul total de interactiune (1) au fost particularizati pentru cazul concret al decuplarii heteronucleare prin metoda CWD, pasul urmator consta in aplicarea efectiva a formalismul Floquet elaborat in ref. [18], specific situatiilor cand exista o modulare multipla. Mai precis, pornind de la expresia generala a operatorului de evolutie intre doua momente arbitrare de timp, t₁ si t₂,

(17)

ea poate fi acum evaluata in mod explicit pentru cazul particular al decuplarii CWD prin simpla inserare a noilor componente Fourier, H_m. Relatia de mai sus descrie modularea multipla cu frecventele ω₁, ω₂, … ω_i, … intr-o forma compacta, prin intermediul vectorilor ω = (ω₁, ω₂, … ω_i, …) si respectiv m = (m₁, m₂, … m_i, …). In pasul urmator, operatorul de evolutie astfel determinat poate fi utilizat pentru a estima valorile medii asociate diferitor marimi fizice de interes, de exemplu spectrul RMN al spinilor S, pe baza caruia se poate apoi analiza eficienta procesului de decuplare. Aceasta procedura face insa obiectul etapei viitoare de derulare a proiectului, si va fi expusa in detaliu in raportul de cercetare urmator. In particular, ar fi de mentionat ca (i) termenii de ordin superior in seriile de puteri asociate coeficientilor modulati si hamiltonianului efectiv din expresia operatorului de evolutie se pot construi in mod iterativ, cu ajutorul termenilor de ordin inferior, si (ii) pe baza acestor expresii se poate face o tratare mai riguroasa a mecanismelor responsabile de degradarea eficientei de decuplare, de exemplu prin analiza termenilor de ordin doi in seria perturbativa asociata hamiltonianului efectiv

4.2 Metoda TPPM

Desi principial exista multe asemanari cu metoda CWD, aplicarea formalismului Floquet pentru analiza metodei TPPM va avea si anumite trasaturi distincte datorita dependentei de timp a hamiltonianului H_rf exprimata in ec. (13). In consecinta, procesul de evaluare a unei expresii generale a operatorului de evolutie este mult mai laborios, deoarece el necesita efectuarea in prealabil a unei medieri peste perioada secventei de pulsuri TPPM. Medierea se poate usor efectua cu ajutorul procedurii elaborate in ref. [18] pentru cazul particular al decuplarii homnucleare prin metoda WHH-4, iar rezultatul consta in inlocuirea componentelor Fourier din relatiile (15) cu hamiltonienii medii corespunzatori. In afara de acesta etapa suplimentara, expresiile hamiltonienilor din relatia (17) a operatorului de evolutie vor fi asmanatoare din punct de vedere formal cu expresiile (15) obtinute in cazul metodei CWD, astfel incat o detaliere suplimentara a formalismului pentru cazul particular al metodei TPPM nu mai este necesara.

4.3 Avantajele Utilizarii Formalismului Floquet

Principalele beneficii ale unei analize bazate pe formalismul Floquet comparativ cu formalismul bazat pe teoria hamiltonianului mediu rezulta foarte clar din expresia (17) a operatorului de evolutie. In primul rand, prezenta in aceasta relatie a coeficientilor modulati C(H_m e^imωt) permite evidentierea explicita a tuturor fenomenelor periodice ce caracterizeaza procesele investigate. In acest fel, dependenta eficientei de decuplare de valaorea campului rf observata experimental (Fig. 9) va putea fi usor inclusa in cadrul noilor modele analitice bazate pe acest formalism. De asemenea, avantaje importante rezulta din exprimarea in forma de serii de puteri, in functie de 1/ω_R, atat a coeficientilor C(H_m e^imωt), cat si a hamiltonianului efectiv, H_eff, in formula (17) a operatorului de evolutie.

5. Concluzii

In cadrul acestui studiu am realizat o sinteza la zi a problematicii decuplarii de spin in spectroscopia RMN de inalta rezolutie pe solide, iar pe baza acesteia am identificat solutii noi privind posibilitatea elaborarii unor modele mai riguroase ale decuplarii de spin heteronucleare. In urma analizei efectuate s-au desprins urmatoarele concluzii importante:

1. 
   Rezolutia spectrala pe nuclee de ¹³C sau ¹⁵N obtinuta prin rotirea probei in jurul unghiului magic (MAS), chiar la frecvente foarte inalte (ν_R = 50 kHz), este insuficienta pentru majoritatea aplicatiilor RMN pe compusi organici. Largimile reziduale obtinute doar in conditii de MAS (300 – 1000 Hz) sunt inacceptabil de mari, ceea ce face absolut necesara aplicarea unor metode de decuplare suplimentare.
   
2. 
   Pana relativ recent decuplarea heteronucleara a fost realizata aproape in mod exclusiv prin metoda CWD (Continuous Wave Decoupling); ea consta in iradierea la frecventa de rezonanta a protonilor cu un camp rf intens (50 – 250 kHz) pe toata durata achizitiei spectrului RMN (¹³C sau ¹⁵N). Comparativ cu largimile reziduale in conditii de MAS, utilizarea CWD conduce la o ingustare suplimentara substantiala, cu peste un ordin de marime. In campuri magnetice moderate (intre 10 – 15 T), si pe compusi organici relativ simpli (sau compusi macromoleculari marcati selectiv cu ¹³C si/sau ¹⁵N), ingustarea obtinuta cu ajutorul CWD (10 – 30 Hz) este suficienta pentru ca majoritatea liniilor RMN din spectru sa fie complet rezolvate.
   
3. 
   Rezolutia spectrala in conditiile decuplarii prin CWD este insa insuficienta pentru majoritatea aplicatiilor biologice ale spectroscopiei RMN pe solide, de exemplu in cazul compusilor macromoleculari marcati uniform cu ¹³C si ¹⁵N (in special proteine). Din acest motiv, incepand cu a doua jumatate a anilor ’90 au inceput studii intense avand drept scop dezvoltarea unor metode de decuplare heteronucleara mai performante, iar solutia tehnica gasita a fost cea de inlocuire a campurilor rf continue prin campuri a caror amplitudine si(sau) faza sunt modulate periodic.
   
4. 
   Prima metoda bazata pe noul concept a fost introdusa in 1995 si se numeste TPPM (Two Pulse Phase Modulation); ea consta dintr-o secventa de doua pulsuri rf de unghi θ, si avand intre ele o diferenta de faza Δφ (de exemplu, considerand frecvente de rotatie uzuale intre 10 si 15 kHz, valorile optime ale lui θ si Δφ se situeaza in jurul a 180⁰, si respectiv intre 15-30⁰). Necesitatea de a optimiza doi parametri constituie insa un dezavantaj destul de mare al metodei TPPM, asfel incat recent s-a introdus o noua metoda (numita XiX) in care, fixand diferenta de faza la Δφ = 180⁰, este necesara doar optimizarea duratei τ a celor doua pulsuri. Utilizand acelasi principiu de baza, al modularii campului de decuplare, dupa TPPM au fost dezvoltate si alte secvente in care, de exemplu, este modulata amplitudinea (SPARC, SPINAL), sau altele in care sunt modulate simultan atat amplitudinea cat si faza (FMPM, AM-TPPM) campului rf. Cu toate ca sunt mult mai sofisticate, noile metode nu conduc insa la o imbunatatire semnificativa rezolutiei in comparatie cu TPPM sau XiX, astfel incat acestea din urma sunt preferate in practica datorita simplitatii lor
   
5. 
   Cu toate progresele inregistrate in urma modularii campului de decuplare, noile metode nu sunt inca suficient de performante pentru a permite o rezolvare a liniilor spectrale in multe cazuri cu relevanta pentru aplicatiile biologice, si in special in proteine marcate uniform cu ¹³C(¹⁵N)
   
6. 
   Pentru elaborarea unor metode de decuplare heteronucleara, cu performante imbunatatite, este utila definirea unei strategii analitice bazata pe combinarea dintre un model teoretic simplificat, care sa ofere informatii calitative cu privire la semnificatia fizica a fenomenelor observate, si simulari numerice, prin intermediul carora sa putem verifica cantitativ eficienta diferitelor solutii propuse.
   
7. 
   Modelul teoretic utilizat in prezent pentru explicarea mecanismelor de decuplare a fost elaborat de catre Meier si Ernst intr-un formalism bazat pe teoria hamiltonianului mediu, si utilizand urmatoarele ipoteze simplificatoare: (i) efectul interactiunilor dintre nucleele de ¹³C(¹⁵N) se considera neglijabil, (ii) interactiunile dipolare dintre protoni sunt tratate in mod fenomenologic, prin intermediul unui superoperator de difuzie de spin, si (iii) numai cuplajul dintre un heteronucleu si protonul cel mai apropiat se considera in mod explicit in calcule, in timp ce interactiunea acestuia din urma cu toti ceilalti protoni este tratata prin intermediul procesului de difuzie de spin
   
8. 
   Cu toate simplificarile pe care le include, acest model: (i) confirma in linii mari rezulatatele experimentale privind variatiei largimii de linie reziduala in functie de rata difuziei de spin, si (ii) ne permite sa identificam factorul cu contributia cea mai insemnata la largirea reziduala a liniilor RMN in cazul decuplarii prin metoda CWD, si anume, interferenta dintre deplasarile chimice (izotrope si anizotrope) ale protonilor si interactiunnile heteronucleare (dipolare si cuplajele J). Pornind de la aceste rezultate se explica si performantele superioare ale metodelor de decuplare TPPM si XiX.
   
9. 
   Datorita formalismului utilizat, modelul Meier – Ernst nu poate insa explica o serie de alte caracteristici importante ale decuplarii heteronucleare, cum ar fi modularea cu frecventa de rotatie a curbei care exprima eficienta de decuplare in functie de intensitatea campului rf si
   
10. 
    O alternativa la formalismul bazat pe teoria hamiltonianului mediu o reprezinta utilizarea formalismului Floquet, deoarece aceasta prezinta avantajul ca efectele de modulare pot fi descrise in mod explicit.
    
11. 
    Pornind de la o varianta a formalismului Floquet de analiza a dinamicii de spin in spatiul Liouville, care a fost dezvoltat in trecut in cadrul grupului nostru, expresiile generale ale hamiltonianului efectiv si a operatorului de evolutie au fost particularizate pentru cazul concret al decuplarii heteronucleare prin intermediul metodelor CWD si TPPM.
    
12. 
    Principalele avantaje ale utilizarii formalismului Floquet sunt urmatoarele: (i) acesta permite evidentierea explicita a tuturor fenomenelor periodice ce caracterizeaza procesele investigate, (ii) termenii de ordin superior in seriile de puteri asociate coeficientilor modulati si hamiltonianului efectiv din expresia operatorului de evolutie se pot construi in mod iterativ, cu ajutorul termenilor de ordin inferior, si (iii) permite o tratare mai riguroasa a mecanismelor responsabile de degradarea eficientei de decuplare in urma analizei termenilor de ordin doi in seria perturbativa asociata hamiltonianului efectiv
    

Bibliografie

1. 
   R. R. Ernst, G. Bodenhausen, A. Wokaun, Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions, Clarendon, Oxford (1987)
   
2. 
   K. Schmidt-Rohr, H.W. Spiess, Multidimensional Solid-State NMR and Polymers, Academic Press, London (1994)
   
3. 
   E.R. Andrew, A. Bradbury, R.G. Eads, Nature, 162, 1639 (1959)
   
4. 
   M. Mehring, Principles of High-Resolution NMR in Solids, Springer, Berlin (1982)
   
5. 
   C.P. Slichter, Principles of Magnetic Resonance, Springer, Berlin (1978)
   
6. 
   A.E. Benett, C.M. Rienstra, M. Auger, K.V. Lakshmi, R.G. Griffin, J. Chem. Phys., 103, 6951 (1995)
   
7. 
   A. Detken, E.H. Hardy, M. Ernst, B.H. Meier, Chem. Phys. Lett., 356, 298 (2002)
   
8. 
   C.P. Jaroniec, C. Filip, R.G. Griffin, J. Am. Chem. Soc., 124, 10728 (2003)
   
9. 
   Maricq, Waugh
   
10. 
    M. Ernst, A. Samoson, B.H. Meier, Chem. Phys. Lett., 348, 293 (2001)
    
11. 
    Y. Yu, B.M. Fung, J. Magn. Reson., 130, 317 (1998)
    
12. 
    B.M. Fung, A.K. Khitrin, K. Ermolaev, J. Magn. Reson., 142, 97 (2000)
    
13. 
    Z.H. Gan, R.R. Ernst, Solid State NMR, 8, 153 (1997)
    
14. 
    K. Takegoshi, J. Mizokami, T. Terao, Chem. Phys. Lett., 341, 540 (2001)
    
15. 
    M. Ernst, H. Zimmermann, B.H. Meier, Chem. Phys. Lett., 317, 581 (2000)
    
16. 
    C. Filip, X. Filip, S. Hafner, D.E. Demco, Molec. Phys., 92, 757 (1997)
    
17. 
    C. Filip, S. Hafner, I. Schnell, D.E. Demco, H.W. Spiess, J. Chem. Phys., 110, 423 (1999)
    
18. 
    C. Filip, S. Hafner, J. Magn. Reson, 147, 250 (2000)
    
19. 
    C. Filip, M. Bertmer, D.E. Demco, B. Blümich, Molec. Phys., 99, 1575 (2001)